清金保肺湯聯(lián)合針灸輔助治療非小細胞肺癌的臨床及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1、PAGE 11 -清金保肺湯聯(lián)合針灸輔助治療非小細胞肺癌的臨床及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究凌綿聰樊偉熊婷王天磊潘嘉欣莫燕麗劉建浩摘要目的探討清金保肺湯聯(lián)合針灸輔助治療非小細胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）的臨床效果，并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法建立清金保肺湯多成分-多靶點-多通路的中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合小鼠實驗驗證其對于NSCLC的作用機制。方法選取三亞市中醫(yī)院2022年1月至2022年12月收治的NSCLC患者80例作為研究對象，分為對照組40例（常規(guī)治療）與觀察組40例（在對照組基礎(chǔ)上應(yīng)用清金保肺湯聯(lián)合針灸治療），治療1個月后觀察兩組治療效果及評估兩組不良反應(yīng)，監(jiān)

2、測淋巴細胞亞群百分比及絕對計數(shù)的變化情況。通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選肺癌腫瘤樣本與正常樣本的差異基因;運用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫搜索清金保肺湯藥物有效活性成分以及藥物作用靶點，運用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建成分-靶點基因網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò);利用R語言進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析、基因本體論（GO）富集分析。采用NSCLC細胞株A549右腋下接種建立NSCLC荷瘤模型，蛋白質(zhì)免疫印跡法對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的關(guān)鍵作用靶點進行驗證。結(jié)果觀察組有效率顯著高于對照組（P6個月的NSCLC患者，排除妊娠期或哺乳期婦女和患有血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重心肝腎功能不全及精

3、神疾病者。應(yīng)用隨機數(shù)字表法將患者分為對照組（40例，常規(guī)治療）和觀察組（40例，在對照組基礎(chǔ)上應(yīng)用清金保肺湯聯(lián)合針灸治療），兩組患者性別、年齡、體質(zhì)量一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）（見表1），本實驗通過三亞市中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：ZYYLL202202223）。1.1.2治療方法（1）對照組對癥應(yīng)用常規(guī)化療治療，靜脈滴注順鉑（75mg/m2）。（2）觀察組在對照組基礎(chǔ)上應(yīng)用清金保肺湯聯(lián)合針灸治療。清金保肺湯組方：麥冬（去心）6g，桔梗9g，天冬（去心）9g，黃芩9g，荊芥9g，知母9g，杏仁6g，天花粉12g，玄參12g，牛蒡子9g，五味子4g。文火煎熬40min，水煎液

4、500mL，早晚服用，1劑/d。針灸：選取患者壓痛點和天泉穴、風(fēng)門穴、肺俞穴、尺澤穴、膏肓穴、心俞穴、中府穴進行針灸，每次留針30min，1次/d。觀察兩組治療1個月后的治療效果。1.1.3觀察指標(biāo)臨床療效評定包括治療效果評估、不良反應(yīng)評估和免疫功能評估。（1）治療效果評估：以隨訪1個月內(nèi)腫瘤病灶縮小程度作為評判指標(biāo)。進展（progressdegree，PD）：腫瘤病灶未縮小或面積擴大表示惡化;無變化（nochange，NC）：腫瘤病灶發(fā)生縮小但縮小未超過50%表示穩(wěn)定;部分緩解（partrelief，PR）：腫瘤病灶縮小超過50%，隨訪1個月內(nèi)未發(fā)生復(fù)發(fā)情況表示部分緩解;完全緩解（compl

5、eterelief，CR）：腫瘤病灶完全消失，隨訪1個月內(nèi)未發(fā)生復(fù)發(fā)情況表示完全緩解。（2）不良反應(yīng)評估：主要觀察患者惡心、嘔吐、白細胞降低的發(fā)生情況。（3）免疫功能評估：選用四色淋巴細胞亞群分析試劑盒（美國BD公司），使用FACSCanto流式細胞儀（美國BD公司），檢測外周血中淋巴細胞亞群CD3+、CD4+細胞、自然殺傷（naturalkillercell，NK）細胞、B細胞百分比及絕對計數(shù)。1.1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20.0進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用“例（%）”表示，行2檢驗，以P30%）和類藥性（DL0.18）篩選清金保肺湯組方中各味中藥的活性化合物。1.2.3清金保肺湯有效成分

6、的靶基因和肺癌差異交集基因通過Perl（http：/S/）軟件，用清金保肺湯有效成分的靶基因在肺癌的差異基因中進行篩選，以便得到有效成分與部分差異基因的對應(yīng)關(guān)系。1.2.4中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建借助Cytoscape3.7.2（thecytoscapeconsoritum，http：/）軟件構(gòu)建清金保肺湯與肺癌的“有效成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)。1.2.5交集基因的蛋白相互作用核心網(wǎng)絡(luò)（protein-proteininteractions，PPI）的構(gòu)建使用Cytoscape3.7.2軟件中的Bisogenet插件進行PPI網(wǎng)絡(luò)繪制。結(jié)合Cytoscape3.7.2軟件中的CytoNCA插件

7、對PPI網(wǎng)絡(luò)進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為選擇節(jié)點度值（degreecentrality）大于61，構(gòu)建一個子網(wǎng)絡(luò);接下來以介數(shù)中心度（betweennesscentrality）大于100為篩選標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建另一個子網(wǎng)絡(luò)。1.2.6基因功能富集（GO）及通路富集分析（KEGG）利用R軟件，選擇生物過程（biologicalprocess）、細胞組分（cellularcomponent）和分子功能（molecularfunction）3個模塊進行基因功能富集分析;利用R軟件對清金保肺湯與肺癌的交集基因做KEGG信號通路分析，同時利用Cytoscape3.7.2將KEGG通路與其相關(guān)基因構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)

8、絡(luò)。1.3動物實驗1.3.1實驗材料C57BL/6小鼠，SPF級，7周齡，體質(zhì)量1822g，雄性。動物房飼養(yǎng)，溫度（232），相對濕度50%10%，照明條件為12h光照/12h暗循環(huán)，自由攝食飲水，所用小鼠實驗前均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。NSCLC細胞株A549（批號：C1002，杭州亦博生物科技有限公司）;注射用順鉑（規(guī)格：10mg/支，國藥準(zhǔn)字H37021356，齊魯制藥有限公司），使用時用無菌生理鹽水配制成濃度為0.4mgmL-1的順鉑溶液;核因子-B（nuclearfactorkappa-B，NF-B）、B淋巴細胞瘤-2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（B

9、cl2-associatedX，Bax）、肌動蛋白（-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G、增強型RIPA裂解液、SDS凝膠制備試劑盒、廣譜磷酸酶抑制劑混合物（100）（批號：BOS113213951、16D16B02、B031132BP51、AA？鄄64132、BST14B25C15I27、14K16B06、025B1050、16L？鄄21C83，博士德生物工程有限公司）;Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）（批號：20221125，北京索萊寶科技有限公司）。GeneGnome成像系統(tǒng)（基因有限公司）;ImageJ軟件（ImageJ2，美國國立衛(wèi)生研究院）。清金保

10、肺湯藥液的制備：取清金保肺湯文火煎熬40min，制成生藥濃度為8、16mgmL-1的藥液，置于4冰箱保存。1.3.2模型的制備、分組與給藥取非小細胞肺癌A549細胞株于37、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其生長至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，離心（1200r/min，10min，離心半徑8.3596cm），制成單細胞懸液（細胞濃度為1107/mL）。所有小鼠編號，隨機分為正常組10只和造模組40只。造模組小鼠皮下接種單細胞懸液0.2mL，正常組小鼠皮下注射無菌生理鹽水0.2mL。待皮下結(jié)節(jié)長徑生長至8mm左右，即成功建立非小細胞肺癌荷瘤模型，本研究中造模組所有小鼠均造模成功9-10。將造模

11、成功的小鼠隨機分為模型組、清金保肺湯低劑量組、清金保肺湯高劑量組和順鉑組，各10只。模型組和正常組均腹腔注射無菌生理鹽水5mLkg-1，灌胃給予蒸餾水5mLkg-1;清金保肺湯低、高劑量組分別腹腔注射無菌生理鹽水5mLkg-1，灌胃給予8、16mgmL-1清金保肺湯藥液5mLkg-1;順鉑組腹腔注射0.4mgmL-1順鉑溶液5mLkg-1，灌胃給予蒸餾水5mLkg-1。均每天1次，連續(xù)14d。1.3.3標(biāo)本采集與處理末次給藥次日，注射過量1%戊巴比妥鈉處死小鼠，取出腫瘤組織（正常組取正常組織）稱重，切成3mm3mm左右碎塊，-80凍存，備用。1.3.4Westernblot法檢測小鼠腫瘤組織N

12、F-B、Bcl-2、Bax蛋白表達水平11取“1.3.3”中備用組織，使用T-PER組織蛋白提取試劑提取蛋白，Bradford法測定蛋白含量，SDS法分離30g蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉NC膜1h;TBST洗膜后，用NF-B、Bcl-2、Bax、-actin一抗工作液室溫震蕩孵育1h;TBST洗膜后，HRP標(biāo)記山羊抗兔灌胃G二抗室溫孵育1.5h。GeneGnome成像系統(tǒng)曝光，ImageJ軟件分析，所得灰度值即為蛋白相對表達量。1.3.5統(tǒng)計學(xué)分析所有計量資料數(shù)據(jù)均以“xs”表示。各組實驗數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，兩組間比較采用t檢驗，以P0.05）;治療后與對照組相比，

13、觀察組CD3+T、CD4+T細胞的絕對計數(shù)顯著上升（P30%，DL0.18%篩選得到），藥物作用靶點8322個，經(jīng)OB與DL篩選重復(fù)項后得1845個藥物作用靶點。運用Perl軟件對藥物有效成分和相關(guān)靶點進行整理，共篩選出35個靶點基因、59個有效活性成分。將藥物有效成分與交集靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點基因網(wǎng)絡(luò)，即中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖3所示。藥物分子中槲皮素（quercetin）（Degree=19）、木犀草素（luteolin）（Degree=11）、甲基原薯蕷皂苷元-qt（methylprotodioscin-qt）（Degree=8）、山柰酚（kaempferol

14、）（Degree=6）度值（degreecentrality，DC）較大，作用靶點較多，說明這幾個活性成分在肺癌治療過程中起著主要作用。交集基因中環(huán)加氧酶1（prostaglandinendoperoxidesynthase1，PTGS1）（Degree=40）、檢查點激酶1（checkpointkinase1，CHEK1）（Degree=14）、毒蕈堿型膽堿能受體1（cholinergicreceptormuscarinic1，CHRM1）（Degree=14）、孕激素受體（progesteronereceptor，PGR）（Degree=14）、糖原合成酶激酶-3（glycogensynt

15、hasekinase3，GSK3）（Degree=11）度值較大，說明藥物分子主要作用于這些靶點而對肺癌起到一定的治療效果。將交集靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，借助Bisogenet插件制作PPI網(wǎng)絡(luò)，得到2484個節(jié)點（圖4A），根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓撲特征值，利用度值與介度中心數(shù)（betweennesscentrality，BC）計算進行拓撲分析，并以DC61為篩選條件進行拓撲結(jié)構(gòu)分析得到471個節(jié)點（圖4B），以BC600為篩選條件進行拓撲結(jié)構(gòu)分析得到核心網(wǎng)絡(luò)，其中包含84個節(jié)點（圖4C）。探討清金保肺湯對肺癌的治療機制，以P0.05為條件對交集靶基因進行GO富集分析，共得到314個生

16、物信息有關(guān)術(shù)語，其中生物過程相關(guān)術(shù)語274條、細胞組分相關(guān)術(shù)語9條、分子功能相關(guān)術(shù)語31條。選擇P值較低的點進行可視化分析，其可視化分析所得到得柱狀圖如圖5所示。將交集靶基因以P0.05為篩選條件進行KEGG通路富集分析，得到102條KEGG信號通路，選擇其中P值較小的20條信號通路進行可視化分析，主要信號通路為酪氨酸激酶受體信號通路（ErbB）、白細胞介素17信號通路（IL-17）、焦點粘連（Focaladhesion）、絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）、EFGR絡(luò)氨酸激酶抑制劑耐藥等，其可視化分析柱狀圖如圖6A。并篩選出前20條通

17、路用Cytoscape軟件繪制KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖6B）。2.3各組小鼠腫瘤組織NF-B、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較與正常組相比，模型組小鼠腫瘤組織NF-B、Bcl-2蛋白表達水平升高（P0.01），Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達水平降低（P0.01）。與模型組相比，清金保肺湯低、高劑量組及順鉑組小鼠腫瘤組織中NF-B、Bcl-2蛋白表達水平降低（P0.01）;Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達水平升高（P0.01）。與清金保肺湯低劑量組相比，清金保肺湯高劑量組NF-B、Bcl-2蛋白表達水平降低（P0.01）;Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達水平升高（P0.01）。以上結(jié)果表明

18、，清金保肺湯可調(diào)節(jié)小鼠腫瘤組織中NF-B、Bcl-2、Bax的表達水平，對肺癌起到一定的治療作用。見圖7。3討論本實驗結(jié)合針灸及現(xiàn)代藥理學(xué)探究臨床效果的同時，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究清金保肺湯對肺癌的作用機制，并結(jié)合小鼠體內(nèi)實驗，采用清金保肺湯對非小細胞肺癌荷瘤模型小鼠進行干預(yù)，對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果進行驗證，以期為臨床應(yīng)用中醫(yī)藥治療肺癌提供一定的思路與方向。TCMSP平臺篩選出槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分對于肺癌治療有較強的靶向作用。槲皮素能降低MMP-9mRNA、MMP-9蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-1蛋白的表達而誘導(dǎo)肺癌腫瘤細胞株A549凋亡12-13。木犀草素可促使A549肺癌細胞凋亡、阻礙

19、A549肺癌細胞的侵襲14。山柰酚能夠阻礙雌激素相關(guān)受體（ERR）效應(yīng)的發(fā)揮而降低非小細胞肺癌A549細胞侵襲和遷移能力15。通過PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及拓撲分析得到清金保肺湯治療肺癌的關(guān)鍵靶點。P53腫瘤抑制因子（tumorprotein53，TP53）基因可以抑制細胞增殖、誘發(fā)細胞凋亡而起到抗腫瘤的作用16-17。鼠雙微體2（murinedoubleminute2，MDM2）是TP53腫瘤抑制蛋白的一個靶基因，其過度表達可導(dǎo)致TP53因子徹底失活而引起癌變18。GO富集分析得到清金保肺湯治療肺癌的相關(guān)靶點功能，主要包括機械刺激反應(yīng)、生長因子結(jié)合、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，清

20、金保肺湯作用于肺癌的通路主要為ErbB信號通路、IL-17信號通路、MAPK信號通路等。進一步分析發(fā)現(xiàn)，上述通路涉及免疫調(diào)節(jié)、腫瘤與炎癥等方面。ErbB通路靶點最多，表明清金保肺湯最有可能通過該通路發(fā)揮作用。MAPK通路的異?；罨c腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，因此可作為抗肺癌靶點19。NF-B可抑制細胞凋亡，在人類肺癌組織和細胞中，其異常激活且不受控制，被認為是治療非小細胞肺癌的新靶點20。其中Bax為促凋亡因子，Bcl-2為抗凋亡因子，二者相互拮抗，在腫瘤細胞的凋亡過程中發(fā)揮作用21。NF-B可通過調(diào)控Bcl-2、Bax的表達而抑制細胞凋亡。本實驗在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果基礎(chǔ)上，通過人非小細

21、胞肺癌A549細胞株右腋下接種建立非小細胞肺癌荷瘤模型，對小鼠腫瘤組織中NF-B、Bcl-2、Bax蛋白表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)清金保肺湯可通過抑制NF-B信號通路，調(diào)節(jié)細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達，進而促進腫瘤細胞的凋亡，這一結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理研究相佐證，為肺癌的中醫(yī)藥治療提供了參考。本實驗創(chuàng)新性地將針灸療法應(yīng)用于非小細胞肺癌的輔助治療，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究清金保肺湯對肺癌的作用機制，并結(jié)合小鼠體內(nèi)實驗驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果，為肺癌的臨床治療提供了新思路。4結(jié)論清金保肺湯聯(lián)合針灸組療效明顯高于對照組，清金保肺湯治療肺癌的有效成分很有可能是槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分，這些成分通過E

22、rbB、IL-17等通路作用于TP53、MDM2、EFGR、MAPK1、MAPK8等關(guān)鍵靶點，調(diào)控蛋白激酶活性與調(diào)節(jié)細胞對于機械刺激的反應(yīng)等，從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)肺癌組織細胞凋亡等作用，從而對肺癌起到一定的治療作用。參考文獻1程艷，隆會芝，羅紅宇，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和細胞實驗探究蓮子心生物堿防治非小細胞肺癌的分子機制J.中國實驗方劑學(xué)雜志，2022，27（13）：164-171.2吳健彬，陳壯忠，鐘麗霞，等.健脾益氣方聯(lián)合化療對肺脾氣虛證晚期非小細胞肺癌患者療效及生活質(zhì)量的影響J.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2022，38（5）：865-870.3宋勇，高健偉.精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的晚期非小細胞肺癌

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