流式細(xì)胞儀培訓(xùn)手冊(cè)

1、BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀FACS101 Handbook本課程介紹表面抗原流式分析有關(guān)之基礎(chǔ)工作原理。如希望進(jìn)一步了解流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用，請(qǐng)至本公司網(wǎng)站訂閱 FACSinformation 電子報(bào)。如需要本課程手冊(cè)，歡迎至本公司網(wǎng)站下載。如需要免疫熒光染色方法，請(qǐng)至本公司網(wǎng)站下載。一、BD FACSCalibur 基本結(jié)構(gòu)儀器本體：.電源開關(guān)：在BD FACSCalibur儀器右側(cè)下方，先啟動(dòng)儀器本體，再打開計(jì)算機(jī)。.光學(xué)系統(tǒng)：BD FACSCalibur 基本配有一支波長(zhǎng) 488 nm 的僦離子雷射以BD FACSCalibur 基本型為例FSC Diode 只收488 nm

2、波長(zhǎng)散射光SSC PMT 只收488 nm 波長(zhǎng)散射光FL1 PMT熒光光譜峰值落在綠色范圍（波長(zhǎng)515-545 nm ）FL2 PMT熒光光譜峰值落在橙紅色范圍（波長(zhǎng) 564-606 nm ）FL3 PMT熒光光譜峰值落在深紅色范圍（波長(zhǎng) 650 nm ）.儀器面板：儀器前方面板的右下方有三個(gè)流速控制鍵、及三個(gè)功能控制鍵。 流速控制:LO ： 樣品流速：12 l /minMED ：樣品流速：35 l /minHI:樣品流速：60 l /min功能控制:一ruN：此時(shí)上樣管加壓，使細(xì)胞懸液從進(jìn)樣針進(jìn)入流動(dòng)室。（正常顯示綠色；黃色時(shí)表示儀器不正常，請(qǐng)檢查是否失壓。）STANDBY :無樣品或暖機(jī)

3、時(shí)之正常位置，此時(shí)鞘液停止流動(dòng)，雷射功率 自動(dòng)降低。PRIME :去除流動(dòng)室中的氣泡，流動(dòng)室施以反向壓力，將液流從流動(dòng)室沖 入樣品管，持續(xù)一定時(shí)間后，以鞘液回注滿流動(dòng)室。PRIME結(jié)束，儀器恢復(fù)STANDBY狀態(tài)。.儲(chǔ)液箱抽屜：在主機(jī)左下方之儲(chǔ)液箱抽屜?？上蚯袄_，內(nèi)含鞘流液筒、廢液筒、鞘液過濾器Sheath Filter ，及空氣濾網(wǎng) Air filter。請(qǐng)注意氣路減壓閥 VENT TOGGLE之 位置。鞘液筒：位于抽屜左側(cè)，容積 4升。裝八分滿鞘液筒，儀器可以運(yùn)行大約3小時(shí)。筒上裝有液面感應(yīng)器，鞘液用完時(shí)，儀器軟件上會(huì)有顯示。鞘液筒蓋 上有金屬環(huán)扣，保證鞘液筒密閉。廢液筒：位于抽屜右側(cè)，

4、容積 4升。筒上裝有液面感應(yīng)器，廢液盛滿時(shí)，儀器軟件上會(huì)有顯示。注意廢液可能有潛在的生物傳染性。鞘液過濾器：m過濾器，去除鞘液中的雜質(zhì)，保證進(jìn)入流動(dòng)室的鞘液是干凈 的。氣路減壓閥：沿箭頭方向移動(dòng)閥門開關(guān)，鞘液筒減壓，氣壓恢復(fù)正常。在鞘液筒添加鞘液時(shí)，需要減壓?？諝膺^濾網(wǎng)：用于過濾冷卻雷射的空氣。.上樣品區(qū)：上樣品區(qū)是樣本管的上樣位置。它包括三個(gè)部分，一個(gè)是進(jìn)樣針SampleInjection Tube ,將樣本輸入流動(dòng)室，還有就是支撐架 Tube Support Arm 、和 液滴存留系統(tǒng) Droplet Containment System 。進(jìn)樣針：是一根不銹鋼管，將細(xì)胞從樣本針中吸入流動(dòng)

5、室。進(jìn)樣管外有一套管，是液滴保留系統(tǒng)的一部分。支撐架：用于支撐樣本管、并負(fù)責(zé)啟動(dòng)液滴存留系統(tǒng)。支撐架有三個(gè)位置：位于樣本管之下的中位，樣本管左側(cè)或右側(cè)。液滴存留系統(tǒng)：系統(tǒng)由支撐架、真空幫浦和外套管組成。當(dāng)支撐架位于左側(cè)或右側(cè) 位置時(shí)，真空幫浦就會(huì)啟動(dòng)，將液體從外管吸入廢液筒內(nèi)。上樣時(shí)，須注意將支撐 架位于中位，以避免過多樣品被抽吸到廢液筒內(nèi)（當(dāng)支撐架位于中位，真空幫浦停 止工作）。更換樣品時(shí)，讓儀器保持RUN的模式，使得進(jìn)樣針可以反沖；切換到STANDBY模式前，確保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到流動(dòng)室中。Macintosh計(jì)算機(jī)與打印機(jī):準(zhǔn)備您的細(xì)胞樣品.理想樣品濃度調(diào)至 1-10 X 10

6、5 cells/m l 一般實(shí)驗(yàn)只需 ml的樣品。.細(xì)胞樣品務(wù)必放至 BD FALCON 352052 試管中，否則無法上機(jī)。.上機(jī)前務(wù)必去除樣品中之細(xì)胞團(tuán)塊，以防止管路堵塞可使用附濾網(wǎng)BD FALCON試管（Cat.或35-55 m 的尼龍篩網(wǎng)。.供流式分析的樣品是單細(xì)胞懸浮液，而且大部分樣品都需經(jīng)熒光染色。表面抗原 熒光染色的方法大致有兩種：直接免疫熒光、間接免疫熒光染色。研究生可至本 公司網(wǎng)站下載染色方法 bdb/直接免疫熒光染色Lysed - No - Wash ProcedureLysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27Peri

7、pheral Blood Mononuclear Cell ProcedureLeukemia and Lymphoma Procedure 1Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay間接免疫熒光染色滴定抗體濃度常用試劑.如因特殊因素?zé)o法下載上述實(shí)驗(yàn)方法，請(qǐng) e-mail :或。二、開機(jī)、關(guān)機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作FACS Calibur 開機(jī).開啟細(xì)胞儀電源。.開啟其它周邊配備電源，如打印機(jī)及 MO機(jī)。.開啟計(jì)算機(jī)。.確認(rèn)鞘流液筒有八分滿的 FACS Flow ,確實(shí)旋緊（鞘液筒容量為4L）。.將廢液倒掉，并在廢液筒中加入200 m

8、l家用漂白水（廢液筒容量為4L）。.將減壓閥方向調(diào)在加壓（ Pressurize ）位置。.排除液流管路與過濾器中的氣泡。.取下樣品管，執(zhí)行 PRIME功能兩次。. 使用 1ml PBS , HIGH RUN 兩分鐘。.可開始分析樣品。FACS Calibur 關(guān)機(jī)關(guān)機(jī)前必要?jiǎng)幼鳎?清洗進(jìn)樣管和外套管，防止進(jìn)樣管堵塞、或有染料殘留。. 將樣品支持架左移，取 2 ml FACSClean （10%Bleach ）上樣品，讓儀器的真 空系統(tǒng)抽取約1 ml的液體。.將樣品支持架回正，按 HI RUN ,然后讓FACSClean清洗管路10分鐘。. 按Standby ,取下樣品管，執(zhí)行 PRIME功能

9、兩次。. 取2 ml dH2O ，重復(fù)上述步驟1-3。. 注意最后只留約 1 ml dH2O 在試管中。.按STANDBY五分鐘，使風(fēng)扇冷卻雷射后，關(guān)閉細(xì)胞儀（必要?jiǎng)幼?，以保護(hù) 雷射光源。）.倒掉廢液，并回填 200 ml漂白水。.將減壓閥放在VENT漏氣位置。將鞘流液筒充填至八分滿。.退出軟件“ File” “Quit ”（如有對(duì)話選項(xiàng)，選擇“ Don t save確認(rèn)退出 計(jì)算機(jī)中所有BD應(yīng)用軟件，所有數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)已儲(chǔ)存?zhèn)浞荨?關(guān)閉計(jì)算機(jī)?！癝pecial Shutdown 。三、上機(jī)分析流程建議首次試機(jī)避免進(jìn)行大量試驗(yàn)，僅需準(zhǔn)備下列樣品。Negative Control（不加任何抗體）。CD

10、3-FITC （FL1 單染）。CD19-PE （FL2 單染）。CD3-FITC /CD19-PE （FL1/FL2 雙染）。Calibur 開機(jī).先開啟細(xì)胞儀本體再打開計(jì)算機(jī)。*秘技1 :如順序相反，儀器和計(jì)算機(jī)之間無法建立正常通訊，無法執(zhí)行 connect to cytometer 解決之道，兩者都關(guān) 機(jī)、然后以正確方式重開。.向前拉開儲(chǔ)液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，將減壓閥方向 調(diào)在VENT位置（箭頭方向）。.儀器會(huì)對(duì)鞘流液筒打氣加壓，請(qǐng)確認(rèn)筒蓋確實(shí)旋緊。*秘技2:將減壓閥方向調(diào)在加壓（向前）位置。減壓閥如在VENT （箭頭方向）位置，按 RUN功能鍵時(shí)將顯示橙黃色（

11、表示儀器不正常，請(qǐng)檢查是否失壓），正常為綠色顯示。開啟CellQuest 軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件Untitled實(shí)驗(yàn)文.在蘋果菜單下點(diǎn)擊 CELLQuest啟動(dòng)軟件。桌面會(huì)出現(xiàn)一Untitled實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。.從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大 小，然后放開鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對(duì)話方框。.在出現(xiàn)的散點(diǎn)圖對(duì)話方框中點(diǎn)擊Plot Source ,選擇Acquisition （收?。_認(rèn)X和Y軸參數(shù)預(yù)設(shè)為 FSC-H 1024、SSC-H 1024 。在顏色方框中點(diǎn)擊Multicolor Gating（收取樣品時(shí)，門內(nèi)細(xì)胞將

12、出現(xiàn)顏色）。點(diǎn)擊 OK。此時(shí)實(shí)驗(yàn)文件會(huì)出現(xiàn) FSC/SSC散點(diǎn)圖。.說明：散點(diǎn)圖（Dotplot ）,又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中，橫坐標(biāo)X軸為為熒光1強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)，縱坐標(biāo) Y軸則通常表示熒光2或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值。儀器使用 者可因應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求來修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。第一圖X和Y軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H 1024、SSC-H 1024 ;第二圖 X和丫軸參數(shù)分別設(shè)為 FL1-H 1024、 FL2-H 1024。修改動(dòng)作為輕擊圖譜上 X和Y軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC: 細(xì)胞大小，SSC:細(xì)胞折射率，F(xiàn)L1 : FITC綠色熒光，

13、FL2 : PE橙色熒光，F(xiàn)L3 : PerCP紅色熒光）。.從屏幕上方Plots菜單中選擇Dot Plot功能，可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖， 在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)選擇X軸：FL1-H 1024 , Y軸：FL2-H 1024。點(diǎn)擊 OK ,FL1/FL2的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖移至原圖右方。.在工具板中選擇四象限工具，在FL1/FL2散點(diǎn)圖上拖動(dòng) Quadrant的中心將它 設(shè)定在（x, y） = （ 101, 10 1）處，這些象限將指定陰性/陽(yáng)性區(qū)域。建立儀器和計(jì)算機(jī)之間通訊.從 Acquire 菜單中選擇 Connect to Cytometer ,此時(shí)會(huì)出現(xiàn) Acquisitio

14、n Control對(duì)話方框。如果無法選擇Connect to Cytometer ,參考秘技 #1 。如果沒見到Acquisition Control 對(duì)話，可到屏幕上方 Windows菜單中選擇 Show Acquisition Control 。儀器設(shè)置文件注意：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取 后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件(Instrument settings ),含信號(hào)器高壓(Detector/ Amps ),閾值(Threshold ),熒光補(bǔ)償(Compensation )等儀器條件的組合。一般而言，儀 器

15、設(shè)定的順序?yàn)?Detector/Amps - Threshold - Compensation。.檢查現(xiàn)有儀器條件，從 Cytometer 菜單中選擇 Detectors/Amps 。出現(xiàn)Detectors/Amps 窗口。在 Detectors/Amps 窗口確認(rèn) FSC 與 SSC 為 LIN(線性放大)，其它 FL1-3為L(zhǎng)OG (對(duì)數(shù)放大)，將其拖至空白區(qū)。.從 Cytometer 菜單中選擇 Threshold ,出現(xiàn) Threshold 窗口在 Threshold 窗 口：確認(rèn)FSC為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。.從Cytometer 菜單中選擇Compensa

16、tion ,確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其 拖至空白區(qū)。上樣品、設(shè)置儀器.使儀器處于High RUN ,支撐架左移，上陰性對(duì)照管樣品，支撐架回位。確認(rèn) Acquisition Control 窗口中Setup前需打叉或打勾(即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù))，點(diǎn)擊 Acquire 。調(diào)節(jié)FSC/SSC探測(cè)器(電壓).觀察FSC/SSC圖的變化。FSC電壓(Voltage)預(yù)設(shè)為E00 ,可調(diào)節(jié) Amp Gain 從一使主要細(xì)胞群得以清楚顯示(如細(xì)胞較大，將FSC電壓設(shè)置于E-1 ;較小細(xì)胞，將FSC電壓設(shè)置于E01)。調(diào)節(jié)SSC電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。 調(diào)節(jié)FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族

17、群，該細(xì)胞群不與其 它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后，點(diǎn)擊Acquisition Control 窗口中的Pause。Gating 圈選細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射與側(cè)方散射 的二維位圖，即散射光圖譜( Scatter Plot ),來圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯 示出有意義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。.在工具板中選 擇多邊形的Region ,在FSC/SSC散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞 R1區(qū)域 (如下圖)。分析樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)成紅色，可移動(dòng)或改變形狀來圈選有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具欄中點(diǎn)選Gates f R

18、egionlist ,以鼠標(biāo)點(diǎn)選 R1,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖 工具板，重畫 R1 。.選取希望 Gate的FL1/FL2散點(diǎn)圖，從 Plots菜單中選擇 Format dot plot 。在出 現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)，將 No Gate改選G1=R1。點(diǎn)擊OK。調(diào)節(jié)FL1、FL2的探測(cè)器（電壓）.點(diǎn)擊 Acquisition Control 窗口中的 Restart 。在 Detector/Amps 窗口中調(diào)節(jié) FL1、FL2的電壓，使Negative Control細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之100-10 1 處。.在Threshold 窗口，適當(dāng)?shù)靥岣?FS

19、C閾值52 ,以去除碎片或低階噪音。唯需注 意不要切掉主要細(xì)胞族群。.點(diǎn)擊Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去陰性對(duì)照管，關(guān)閉 Detector/Amps 、Threshold 窗口，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光。調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說明：最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過此步驟）如是2色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié) FL2-%FL1 , FL1-%FL2 （若3色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié) FL2- %FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3 的補(bǔ)償）。. High RUN ,換上單染 CD3-FITC 管。點(diǎn)擊 Acquisit

20、ion Control 窗口中的 Acquire 。調(diào)節(jié)FL2-%FL1使FITC陽(yáng)性細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償 調(diào)節(jié)可通過點(diǎn)擊來選擇或直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊AcquisitionControl 窗口中的 Pause。.移去單染 CD3 ,換上單染 CD19-PE 管。點(diǎn)擊 Acquisition Control 窗口中的 Restart 。調(diào)節(jié)FL1-%FL2使PE+細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢， 點(diǎn)擊 Acquisition Control 窗口中的 Pause 。.最后以CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊Acquisitio

21、n Control 窗口中的Restart ,確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成2色熒光之光譜重迭時(shí)，點(diǎn)擊Acquisition Control 窗口中的 Pause、Abort 。.移去樣本管，換上 dH2O 管，讓儀器暫且處于 Standby 狀態(tài)。關(guān)閉Compensation 窗口。您已完成 2色熒光之最適化。收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)決定儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù).預(yù)設(shè)之儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)為 10000。如需修改，從 Acquire菜單中選擇 Acquisition & Storage ,并在出現(xiàn)的窗口功，確認(rèn) Collection Criteria 從 10000 of All ,再點(diǎn)擊 OK。.找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)

22、。從Acquire 菜單中選擇Parameter Description , 出現(xiàn)Parameter Description對(duì)話方框。點(diǎn)擊 Folder ,并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇Your Folder或新建活頁(yè)夾，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的Select YourFolder 。.命名即將儲(chǔ)存之文件名：點(diǎn)擊Parameter Description對(duì)話方框的 File ,出現(xiàn)文件名編輯窗口。在 Custom Prefix 中：輸入文件名，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的 OK。日期為最常用之文件名系統(tǒng)。. Optional :如有需要，可選擇或在P1-P5后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如P1 : Size, P2 :

23、Granularity, P3 : CD3 FITC。輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔案 中，顯示在圖譜上。計(jì)數(shù)器Counters.從Acquire 菜單中選擇 Counters.窗口會(huì)顯示樣品分析速率、與總數(shù)進(jìn)度 。 收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).你可以開始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)了。HIGH RUN ,將第一管樣品放到檢測(cè)區(qū)，在Acquisition Control 窗口中，將 Setup 改成 Setup ,此時(shí) CellQuest 會(huì)自動(dòng) 顯示Your Folder :為資料文件名。點(diǎn)擊“Acquire 便可啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。當(dāng)計(jì)算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會(huì)自動(dòng)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)文件，并會(huì)以“嘟”聲告知，CellQuest

24、會(huì)自動(dòng)升哥附加檔名成。等待下一指示。.你可以換上下一管樣品，點(diǎn)擊“Acquire ”啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。可繼續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之儲(chǔ)存與備份：.不建議長(zhǎng)期使用硬盤儲(chǔ)存數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可考慮以燒光盤(如配有CD-RW )、口袋硬盤(Flash Drive )來備份大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以免占用原有硬盤的內(nèi)存，影響 數(shù)據(jù)處理速度?？蓪浞莺笾?dāng)?shù)據(jù)，拿到另一蘋果計(jì)算機(jī)或個(gè)人PC進(jìn)行離機(jī)分析。.確認(rèn)所有檔案皆己備份后，以鼠標(biāo)圈選欲刪除數(shù)據(jù)，將其拖拉至Trash筒。退出軟件.檢品分析完畢后，記得從屏幕上方File指令欄選擇Save As ,儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。.從

25、屏幕上方 Cytometer指令欄，選擇 Instrument Setting ,出現(xiàn) InstrumentSetting窗口。點(diǎn)系print打印此次實(shí)驗(yàn)條件，可貼入實(shí)驗(yàn)筆記留底，再點(diǎn)擊 Save以儲(chǔ)存此一實(shí)驗(yàn)的儀器條件，供日后再使用。點(diǎn)系SAVE后會(huì)出現(xiàn)文件保存對(duì)話方框，選擇文件目錄及文件名(例： Your Folder : /Your Settingl ), 點(diǎn)擊Save 。 點(diǎn)擊 Done 。.檢品分析完畢后，用鼠標(biāo)從屏幕上方Acquire 指令欄中，選取 Disconnect toCytometer 以斷絕計(jì)算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不分析數(shù)據(jù)，您可退出軟件“File” “Quit ”

26、（遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇Don t save進(jìn)行關(guān)機(jī)程序。管路清洗.以2 ml 10 %漂白水取代樣品，將樣品架置于左位以外管吸除約 1 ml ,再將樣 品架置于中位 HI RUN十分鐘。改用2 ml DI water 。重復(fù)上述程序，樣品架 上留約1 ml DI water 。按STANDBY 五分鐘。關(guān)主機(jī)、關(guān)計(jì)算機(jī) 四、數(shù)據(jù)分析FCS list mode數(shù)據(jù)文件：說明：FCS list mode 數(shù)據(jù)文件是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式檔案（）。該文件含有從流式細(xì) 胞儀收取的平均10,000個(gè)細(xì)胞數(shù)的資料，含有 46個(gè)參數(shù)。一般軟件無法打開listmode 數(shù)據(jù)文件，需藉助如 CellQuest, Wi

27、nList, WinMDI, 等Flow 分析軟件，才可開 啟、繪圖、并進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。開啟一 CellQuest 實(shí)驗(yàn)文件.從屏幕上方File菜單中選擇New。桌面會(huì)出現(xiàn)一Untitled 實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。散點(diǎn)圖之統(tǒng)計(jì)分析（雙色）.從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖動(dòng)對(duì)角線至適當(dāng)大 小。Plot拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot對(duì)話框。.在 Dot Plot 方框中，Plot Source 應(yīng)預(yù)設(shè)為 Analysis ,可點(diǎn)擊 Select File 鈕，并 用隨后之方框來開啟預(yù)存之Sample Files ,它們的路徑

28、位于 Mac HD : BDApplications : CellQuest Folder : Sample Files 。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來打開次目錄， 找到檔案后，點(diǎn)擊 Open來開啟NORM001檔案。X與Y參數(shù)項(xiàng)會(huì)出現(xiàn)默認(rèn)值一FSC-H 256 與 SSC-H 256 ,在 Color 方框中點(diǎn)擊 Multicolor Gating ,確認(rèn)無誤 之后，點(diǎn)擊 OK便完成了一個(gè) NORM001 的FSC /SSC散點(diǎn)圖。.工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將Cursor移至FSC/SSC散點(diǎn)圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細(xì)

29、胞。（如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具欄中點(diǎn)選Gates -Region list ,以鼠標(biāo)點(diǎn)選 R1 ,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用 繪圖工具板，重畫R1。）.從Plots菜單中選擇 Dot Plot可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，屏幕上會(huì)出現(xiàn)一 Dot Plot 對(duì)話方框。點(diǎn)擊 X Parameter 鈕來顯示NORM001檔案中所有的參數(shù)項(xiàng)（FSC, SSC, FL1, FL2）將X參數(shù)項(xiàng)改成FL1-H 256 Gamma-1 ,丫參數(shù)項(xiàng)改 成FL2-H 256 Gamma-2 。從 Gate 輸入欄中將 NoGate 改成 G1= R1 。.點(diǎn)擊OK便完成了一個(gè)以

30、G1圈選的FL1/ FL2散點(diǎn)圖，可將復(fù)制圖移至原圖右 方。NORM001檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對(duì)照組，我們將以之來界定陰性與陽(yáng)性之 界限。.從屏幕左列工具板中，選取Quadrant Marker 工具，然后在 FL1/ FL2散點(diǎn)圖中心處點(diǎn)擊并拖曳至定點(diǎn)，一般而言是緊挨著陰性細(xì)胞聚落。. FL1/ FL2二維散點(diǎn)圖現(xiàn)在被區(qū)隔出四個(gè)象限，欲計(jì)算各象線中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，從 屏幕上方Stats菜單中選擇 Quadrant Stats 。可以得到該圖之四象限統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 UL:左上象限，UR:右上象限，LL:左下象限，LR:右下象限打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值.從屏幕上方File菜單中選擇Print One

31、，可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。.點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表，從屏幕上方 File菜單中選擇Export Statistics 可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù) 值至Excel檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔案，并決定欲存放檔案匣，點(diǎn)擊Save。開啟其它List Mode Data.如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表（文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇Next Data File ,軟件會(huì)自動(dòng)以新檔案來替換現(xiàn)有檔案，您只要確認(rèn)圈選范圍、與 Quadrant Marker的位置是否恰當(dāng)，即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。.對(duì)于存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方

32、式選取所有圖表（文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇ChangeData Files ,并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇所在新目錄與欲分析檔案。點(diǎn)擊 OPEN?？烧{(diào)整圈選區(qū)域，Quadrant Marker陰陽(yáng)界限，軟件會(huì)重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。.常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件（內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告），我們建議您將它另存新檔 File - Save As ,以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。直方圖之統(tǒng)計(jì)分析（單色）.從屏幕上方File菜單中選擇New。桌面會(huì)出現(xiàn)一Untitled實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。.從工具

33、板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大 小。Plot拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot對(duì)話框。.在Dot Plot 方框中，Plot Source 應(yīng)預(yù)設(shè)為 Analysis ,可點(diǎn)擊 Select File 鈕，并用 隨后之方框來開啟預(yù)存之Sample Files ,它們的路徑位于 Mac HD : BDApplications : CellQuest Folder : Sample Files 。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來打開次目錄， 找到檔案后，點(diǎn)擊 Open來開啟NORM001 檔案。X與Y參數(shù)項(xiàng)會(huì)出現(xiàn)默認(rèn)值一 FSC-H 256 與 SSC-H 256 ,在 C

34、olor 方框中點(diǎn)擊 Multicolor Gating ,確認(rèn)無誤之 后，點(diǎn)擊OK便完成了一個(gè) NORM001 的FSC /SSC散點(diǎn)圖。.工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將 Cursor移至FSC/SSC散點(diǎn)圖上，并沿著淋巴球聚 落周邊畫出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細(xì)胞。(如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具欄中點(diǎn)選Gates -Region list ,以鼠標(biāo)點(diǎn)選 R1 ,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用 繪圖工具板，重畫R1 。).從Plots菜單中選擇 Histogram ,屏幕上會(huì)出現(xiàn)一 Histogram 對(duì)話方框。

35、點(diǎn)擊 Select File 鈕，再點(diǎn)擊 Open 來開啟 NORM001 檔案。說明：直方圖(Histogram )表明一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系，在圖中，橫坐標(biāo)X軸為熒光或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)(channel number ),縱坐標(biāo)Y軸則通常表示細(xì)胞出現(xiàn)的頻率，即相對(duì)細(xì)胞數(shù)。.點(diǎn)擊Parameter鈕來顯示NORM001 檔案中所有的參數(shù)項(xiàng)，將參數(shù)項(xiàng)改成 FL2- H 256 Gamma-2 。從 Gate輸入欄中將 No Gate 改成G1= R1，點(diǎn)擊 OK便完 成了一個(gè)以G1圈選的FL2直方圖，圖形的 X軸為橙黃色熒光強(qiáng)度，Y軸為細(xì)胞頻率，NORM001檔案為本組實(shí)驗(yàn)之

36、陰性對(duì)照組，我們將以之來界定陰性與陽(yáng)性之界限。.從屏幕左列工具板中，選取Histogram Marker 工具，然后在圖的左緣處點(diǎn)擊并拖曳至定點(diǎn)，一般而言是陰性信號(hào)的右緣。放開鼠標(biāo)后即完成Marker 1(M1)。重復(fù)前述步驟以增畫另一 Marker , 一般而言M2始自M1的右緣，終于圖的右界。. FL2直方圖現(xiàn)在被區(qū)隔出兩個(gè)區(qū)域，欲計(jì)算各區(qū)域中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可從 Stats 指令欄中選擇 Histogram Stats 。打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值.從屏幕上方File菜單中選擇Print One ，可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。.點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表，從屏幕上方File菜單中選擇Export Stat

37、istics 可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值至Excel檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔案，并決定欲存放檔案匣，點(diǎn)擊Save。開啟其它List Mode Data.如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表（文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇Next Data File ,軟件會(huì)自動(dòng)以新檔案來替換現(xiàn)有檔案，您只要確認(rèn)圈選范圍、與 Quadrant Marker的位置是否恰當(dāng)，即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。.對(duì)于存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表（文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上 ），接著從Plots菜單選擇Cha

38、nge Data Files ,并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇所在新目錄與欲分析檔案。點(diǎn)擊 OPEN ?？烧{(diào)整圈選區(qū)域，Markers界限，軟件會(huì)重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。.常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件（內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告 ），我 們建議您將它另存新檔 File - Save As ,以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。五、錯(cuò)誤信號(hào)、疑難排除儀器狀態(tài)（Status ）:在CELLQuest菜單位于Cytometer 菜單中。用來在收取的任何時(shí)候查看流式細(xì)胞儀的運(yùn)行狀態(tài)，以利解決儀器運(yùn)行中出現(xiàn)的問題。狀態(tài)：顯示儀器運(yùn)行模式Not Ready :激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿。Read

39、y :樣本管放置在進(jìn)樣區(qū)，且支撐臂位于中位，樣本管加壓，儀器在 RUN 狀態(tài)。Standby :儀器在Standby 狀態(tài)、或儀器在 Run狀態(tài)而無樣本管在進(jìn)樣區(qū) 上、或支撐架位于側(cè)位、或樣本管未完全加壓。Standby時(shí)儀器的雷射電源降低。常見故障排除程序樣品試管上不去誤用不適合的試管。（請(qǐng)用 BD Falcon 352052）試管支持架需調(diào)整。旋轉(zhuǎn)調(diào)整試管支持架（順時(shí)鐘向下、逆時(shí)鐘向上）。Bal Seal 磨損。（汰換 Bal seal ）儀器處于N0T READY 狀況檢查以下情況：鞘液筒中的鞘液是否用完。廢液筒中的廢液是否已裝滿。開機(jī)需要5分鐘時(shí)間預(yù)熱。鞘液筒的液面檢測(cè)器連接是否松動(dòng)、

40、或未連接。儀器處于STANDBY狀況（儀器失壓）如果儀器未加壓，上樣管放好后，雖然控制面板處于RUN模式，但儀器仍未能達(dá)到READY狀況，此時(shí)儀器仍處于 STANDBY狀況。這可能是由于鞘液筒蓋漏氣、壓力 閥未加壓，樣本管不能被加壓等原因造成的壓力問題。此時(shí)，樣本不能良好地進(jìn)入 流動(dòng)室，無法檢測(cè)。此時(shí)，檢查以下情況：壓力閥未加壓。鞘液筒是否漏氣（蓋緊鞘液筒蓋）。樣本管是否有破損。上樣針上的 Bal seal是否己磨損。鞘液筒上的藍(lán)色接頭是否連接好。儀器訊號(hào)噪聲過高鞘液過濾器中有氣泡，儀器記錄了氣泡產(chǎn)生的信號(hào)，造成了噪聲數(shù)據(jù)的干擾。氣泡還可以改變樣本流，造成檢測(cè)結(jié)果不理想；此時(shí)，儀器需要做PRI

41、ME ,排除液路中的氣泡干擾。如果鞘液筒吸干了，應(yīng)該重新裝滿鞘液，然后先取下樣品管進(jìn)行5-10次PRIME ,再換上3ml dH2O 上樣管HI RUN 30 分鐘，待鞘液流中的氣泡排除之 后，再進(jìn)行樣本測(cè)定。計(jì)算機(jī)屏幕上見不到細(xì)胞顯示檢查以下情況：如果儀器一直處于 STANDBY 狀態(tài)，則檢查 System Status 。如果STATUS窗日顯示READY ,則檢查樣本管中細(xì)胞濃度是否夠，上樣前 是否混勻了。檢查實(shí)驗(yàn)的Instrument Settings 是否正確。檢查閾值是否設(shè)置過高，導(dǎo)致無法檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞群。檢查CELLQuest軟彳Cytometer 目錄下的Status窗口，是否己

42、被更新。如 果未更新，說明儀器與計(jì)算機(jī)之間的通訊發(fā)生了故障，此時(shí)，應(yīng)關(guān)閉計(jì)算機(jī) 和FACSCalibur ,重新打開儀器，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。PRIME儀器液流，去除流動(dòng)室中可能存在的氣泡。若流動(dòng)室中存在氣泡，可 能使樣本流的位置偏離激光束，導(dǎo)致無細(xì)胞信號(hào)。加樣針有鞘液反流檢查以下情況：檢查上樣針外管是否安好，可以將外管旋下，向上推動(dòng)，重新擰緊。更換上樣針上部的 O型膠環(huán)。檢查液流保存系統(tǒng)的真空幫浦是否工作。如果樣本管支撐架位于旁位時(shí)，聽不到真空幫浦的工作聲音，可能是真空幫浦停了，關(guān)閉 FACSCalibur ,再啟 動(dòng)；移開支撐架時(shí)，如果馬達(dá)仍然不動(dòng)，請(qǐng)致電 BD客戶服務(wù)部門尋求幫 助。實(shí)驗(yàn)文件1: 2 Color ACQ 實(shí)驗(yàn)文件2 : 2 Color ANA 表