重組導(dǎo)入受體細(xì)胞 (2)PPT

1、關(guān)于重組導(dǎo)入受體細(xì)胞 (2)第一張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 按 DNA片段連接重組的方法，目的基因與載體連接后成為重組 DNA 分子。而重組 DNA分子只有進(jìn)入適宜的受體細(xì)胞后才能進(jìn)行大量的擴(kuò)增和有效的表達(dá)。目的基因能否有效地進(jìn)入受體細(xì)胞，除了選用上述合適的克隆載體外，還取決于選用的受體細(xì)胞和轉(zhuǎn)移方法。一、受體細(xì)胞二、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑第二張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、受體細(xì)胞1. 受體細(xì)胞的定義與選擇原則2. 受體細(xì)胞的類型第三張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 受體細(xì)胞的定義與選擇原則（1）受體細(xì)胞指能夠攝

2、取外源DNA（基因）并使其穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞。作為基因工程的受體細(xì)胞，從實(shí)驗(yàn)技術(shù)上講是能攝取外源 DNA(基因)，并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞；從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價(jià)值或理論研究?jī)r(jià)值的細(xì)胞。原核生物細(xì)胞和真核生物細(xì)胞可作為受體細(xì)胞，但不是所有細(xì)胞都可以作為受體細(xì)胞。在目的基因與載體連接成重組DNA分子以后，下面的重要工作主要是將其導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和篩選，獲得大量的重組DNA分子，這就是外源基因的無(wú)性繁殖，即克隆(cloning)。 第四張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）受體細(xì)胞的選擇原則據(jù)所用載體體系及受體細(xì)胞的基因型進(jìn)行選擇；重組體的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染率高；能夠穩(wěn)定遺傳；受體細(xì)胞基因型與載體

3、所含的選擇標(biāo)記匹配；易于篩選重組體；外源基因可以高效表達(dá)和穩(wěn)定遺傳；此外，安全性、導(dǎo)入方法、翻譯及后加工機(jī)制和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值等。第五張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 受體細(xì)胞的類型（1）微生物表達(dá)系統(tǒng)（是較為理想的受體細(xì)胞）優(yōu)點(diǎn)： 無(wú)纖維素組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，便于外源 DNA 進(jìn)入；無(wú)核膜，外源DNA 與裸露的染色體 DNA 重組簡(jiǎn)單；基因組小，便于對(duì)引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析；容易獲得一致性的實(shí)驗(yàn)材料，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快。第六張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 受體細(xì)胞的類型（1）微生物表達(dá)系統(tǒng)缺點(diǎn)：缺乏蛋白質(zhì)的修飾作用，故微生物細(xì)胞不能直接表達(dá)

4、真核生物基因，但可以通過(guò)對(duì)真核生物基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椈虿捎胏DNA克隆而加以改進(jìn)。第七張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 受體細(xì)胞的類型（1）微生物表達(dá)系統(tǒng)常用微生物表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌枯草桿菌藍(lán)細(xì)菌棒狀桿菌和鏈霉菌酵母菌第八張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌優(yōu)勢(shì)：全基因組測(cè)序共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架；克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善，繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、遺傳穩(wěn)定，曾被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物，現(xiàn)已用來(lái)生產(chǎn)人胰島素、生長(zhǎng)素及干擾素等。劣勢(shì)：缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)制、修飾后加工功能；內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，含有種類繁多的內(nèi)毒素。第九張，PPT共

5、八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月枯草桿菌亦稱枯草芽孢桿菌。優(yōu)勢(shì)： 具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因，能將基因表達(dá)產(chǎn)物高效的分泌到培養(yǎng)基中，簡(jiǎn)化了加工提取工藝，所分泌的真核基因產(chǎn)物具有天然構(gòu)象和生物活性；不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無(wú)致病性；具有芽孢形成能力，易于保存和培養(yǎng)，代謝易控制。成功表達(dá)了-干擾素、白細(xì)胞介素、乙肝病毒核心抗原及淀粉酶、高溫脂肪酶等。劣勢(shì)：產(chǎn)物易被自身分泌的蛋白酶分解，而且重組體穩(wěn)定性差。第十張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月藍(lán)細(xì)菌亦稱藍(lán)藻，與細(xì)菌親緣關(guān)系密切。優(yōu)勢(shì)：自養(yǎng)型，嫩能夠進(jìn)行光合作用釋放氧氣，培養(yǎng)簡(jiǎn)單易行，可能成為植物基因表達(dá)的宿主。現(xiàn)已獲得了高效表達(dá)的PHB等產(chǎn)物的藍(lán)藻工程菌（

6、用于生產(chǎn)可降解塑料），作為生物反應(yīng)器，大量生產(chǎn)藥物、燃料等具有應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)品。第十一張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月棒狀桿菌和鏈霉菌用于生產(chǎn)氨基酸和抗生素等產(chǎn)品。第十二張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酵母菌是以芽殖或裂殖進(jìn)行無(wú)性繁殖的單細(xì)胞真核生物。優(yōu)勢(shì)：除了真核生物細(xì)胞共有的特性外，還具有以下優(yōu)點(diǎn)：基因結(jié)構(gòu)相對(duì)比較簡(jiǎn)單，對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究得比較清楚，便于基因工程操作；培養(yǎng)簡(jiǎn)單，適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉；外源基因表達(dá)產(chǎn)物能分泌到培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工；不產(chǎn)生毒素，是安全的受體細(xì)胞。 第十三張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）植物表達(dá)系統(tǒng)主要是利

7、用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染的方法將目的基因?qū)?，多用于雙子葉植物。最突出的優(yōu)點(diǎn)：體細(xì)胞的全能性，即一個(gè)分離的活細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下，比較容易再分化成植株，這意味著一個(gè)獲得外源基因的體細(xì)胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。第十四張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）植物表達(dá)系統(tǒng)不足之處：植物細(xì)胞有纖維素參與組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，不利于攝取重組 DNA 分子。克服方法：纖維素酶處理獲得原生質(zhì)體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或用基因槍、電激儀處理等方法，同樣可使外源 DNA進(jìn)入植物細(xì)胞。第十五張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要用于大規(guī)模的表達(dá)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)或動(dòng)物疫苗、動(dòng)物品種遺

8、傳改良及人類基因的遺傳治療等。昆蟲(chóng)細(xì)胞：能表達(dá)原核基因和哺乳動(dòng)物基因，具有較強(qiáng)的分泌能力和修飾能力，但糖基化的寡糖鏈與人類糖蛋白的相差較大，多用于抗體生產(chǎn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞：具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)修飾能力，基因產(chǎn)物分泌能力強(qiáng)，有很強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性，但組培條件要求苛刻，易污染，成本高。第十六張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑轉(zhuǎn)化：transfermation，通過(guò)生物學(xué)或理化方法使質(zhì)粒DNA或以質(zhì)粒DNA為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過(guò)程，主要用于原核生物。轉(zhuǎn)染：transfection，是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式，指病毒或以病毒

9、為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使宿主遺傳性狀發(fā)生改變的過(guò)程，其中包括DNA、RT-DNA及RNAi，主要用于原核生物。第十七張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的類型轉(zhuǎn)導(dǎo):( transduction ) 以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。 第十八張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 直接轉(zhuǎn)化法有的微生物細(xì)胞在不加任何處理的情況下就能直接攝取外源 DNA，只要外源 DNA與這樣的細(xì)胞混合，在適宜的條件下懸浮培養(yǎng)，就能完成外源 DNA 的轉(zhuǎn)化。細(xì)菌轉(zhuǎn)化 ：指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生

10、命過(guò)程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫給體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株叫受體菌株。第十九張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 大腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體細(xì)胞。 通常采用的是大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，即在冰浴中用一定濃度的CaCl2處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌，以獲得高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亞礬、二硫蘇糖醇(DTT)或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞(competent cell):具有易于接受外源DNA能力的細(xì)胞。 感受態(tài)：是指受體細(xì)胞能吸收外源DNA分子而有效地作為轉(zhuǎn)化受體的某些生理狀態(tài)。一般受體細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)。第二十張，PP

11、T共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月本質(zhì)兩種假說(shuō)一局部原生質(zhì)體化假說(shuō)：細(xì)菌表面的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細(xì)胞壁或局部溶解細(xì)胞壁，使DNA分子能夠通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞二酶受體假說(shuō)：感受態(tài)細(xì)胞表面形成一種能夠接受DNA的酶切位點(diǎn)，使DNA分子能夠進(jìn)入細(xì)胞第二十一張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌接種于瓊脂培養(yǎng)基37培養(yǎng)基(一) 感受態(tài)細(xì)胞的制備： 1、從新活化的E.coli DH5平板上挑取一單菌落，接種于35ml LB液體培養(yǎng)中，37振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(12h左右)； 2、將該菌懸液以1:1001:50轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開(kāi)始出現(xiàn)混濁后

12、，每隔2030min測(cè)一次OD600，至OD600為0.30.5時(shí)停止培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到1.5 mL離心管中； 3、培養(yǎng)物于冰上放置20min； 4、 04，4000g離心10min，棄去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞, 冰浴20分鐘；感受態(tài)細(xì)胞制備Preparation of competent cell第二十二張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 5、04， 4000g離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min； 6、 04， 4000g離心10min，棄去上清液，加入100 L

13、冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液； 7、制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，如果在4放置1224h，其轉(zhuǎn)化效率可以增高46倍；也可加入占總體積15左右高壓滅菌過(guò)的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70條件下，可保存半年至一年。第二十三張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng)1細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（一般通過(guò)檢測(cè)OD600來(lái)控制。DH5菌株OD600為0.5時(shí)細(xì)胞密度是5107/ml）；2 所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件和冰上進(jìn)行；3 經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞，在低溫

14、條件下，一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加，24h達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的）；4 化合物及無(wú)機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn 2+或Co 2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；第二十四張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5 所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；6 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA；7 一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；第二十五張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.

15、高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法 （1）Electroproration原理：利用高壓電脈沖作用，使細(xì)胞膜上產(chǎn)生可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA和高分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化，但不傷及細(xì)胞，切斷電場(chǎng)后，被擊穿的膜孔可以自行恢復(fù)。（2）過(guò)程：把宿主細(xì)胞置于外加電場(chǎng)中，通過(guò)電脈沖作用在細(xì)胞膜上打孔，DNA分子進(jìn)入細(xì)胞。第二十六張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法（3）條件：電壓300600V、時(shí)間20100ms、溫度0。（4）適用范圍：酵母菌、霉菌等真核生物，適用于農(nóng)桿菌感染不敏感的植物。（5）形式：電穿孔 第二十七張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月例如：高壓電穿孔法

16、轉(zhuǎn)化細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌冷卻離心低鹽緩沖液清洗用10%甘油懸浮細(xì)胞干冰速凍-70貯存外加電場(chǎng)（300-600V維持20100ms）電脈沖轉(zhuǎn)化細(xì)胞0-4 第二十八張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. 微彈轟擊轉(zhuǎn)化法（microprojectile bombardment,particle bombardment ）該法亦稱基因槍法(particle gun)，粒子轟擊法，生物彈法（Biolistics）。（1）原理：金屬微粒在外力作用下，達(dá)到一定速度后，將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨金屬顆粒一起進(jìn)入植物細(xì)胞，但又不引起細(xì)胞致命傷害而維持正常的生命活動(dòng)。（2）過(guò)程：外源DNA與鎢

17、、金等金屬微?；旌?，使DNA吸附在微粒表面；用基因槍轟擊，通過(guò)氦氣沖擊波使DNA隨金屬微粒進(jìn)入植物細(xì)胞。第二十九張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基因槍介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移基因槍法最早是由美國(guó)康奈爾大學(xué)的Sanford(1987)最先提出的。它通過(guò)高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過(guò)該法獲得的。第三十張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一類是以火藥爆炸力作為動(dòng)力加速微彈；第二類是以高壓氣體(high pressure gas)作為動(dòng)力，如以氦氣、氫氣、氮?dú)獾取Ｆ涔ぷ髟硎前演d有DNA的鎢(金)粉噴灑

18、在一張微粒載片上，電極間懸滴著微水滴。在壓縮空氣的沖擊下，微水滴霧狀噴射，驅(qū)動(dòng)載片。當(dāng)載片受阻于金屬篩網(wǎng)時(shí),載有DNA的鎢(金)粒繼續(xù)向下沖擊射入細(xì)胞。第三十一張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十二張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十三張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第三類是以高壓放電為驅(qū)動(dòng)力。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以無(wú)級(jí)調(diào)速，通過(guò)變化工作電壓，粒子速度及射入濃度可準(zhǔn)確控制，使載有DNA的鎢(金)粉粒子能到達(dá)具有再生能力的細(xì)胞層。這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)椴煌耐庵搀w需要不同的參數(shù)。采用該放電轟擊、已在大豆和水稻上成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株(Christou等，1992)第三

19、十四張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十五張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十六張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十七張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA微粒載體的制備原理是CaCl2對(duì)DNA沉淀作用，亞精胺、聚乙二醇具有粘附作用、將這些化合物與DNA混合后與鎢粉或金粉混合，吹干后，則DNA沉淀在載體顆粒上第三十九張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月步驟(1)DNA微彈的制備 1)微粒體的洗滌取60-100mg鎢粉或金粉，其微粒直徑最好選擇為細(xì)胞直徑的1/10，并溶于1ml無(wú)水乙醇中，用超聲

20、波振蕩洗滌。微粒體處理后可在密閉條件下，室溫貯存1周。離心盡量除去乙醇。加1ml無(wú)菌水振蕩離心，移去上清液，如此重復(fù)2次，將殘留的乙醇除凈，再用1ml無(wú)菌水重懸沉淀，密閉貯存于室溫中，備用，保存時(shí)間不要超過(guò)1周。第四十張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2)DNA微粒載體的制備上述微粒貯存液離心移去上清液，加1ml無(wú)菌水重懸；每份樣品取25l微粒重懸液，加入25 l DNA(1 g/ l)，手指振蕩3次，充分混勻； 加入25l2.5mol/LCaCl2溶液，手指振蕩5次；加入20l40PEG 4000，手指振蕩5次；加入2.5ml0.1mol/L亞精胺，手指振蕩5次；混合液在室溫靜置10

21、min，使DNA沉淀到微粒體上；離心5min，移去50-60l上清液(嚴(yán)格掌握體積，使剩余溶液量可以進(jìn)行3次槍擊)；制備好的DNA微粒載體，可在冰水中保存，但不能超過(guò)4個(gè)小時(shí)，槍擊時(shí)每次取樣8l。 注意：上述制備過(guò)程均在無(wú)菌條件下操作。第四十一張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3)靶外植體材料準(zhǔn)備在無(wú)菌條件下截取靶外植體(有菌的外植體按常規(guī)方法消毒處理)，放于樣品皿中，外植體大小按基因槍要求選擇；在無(wú)菌條件下，把靶外植體放入基因槍的樣品室，并對(duì)準(zhǔn)子彈發(fā)射軸心。 4)DNA微彈轟擊，按照不同的基因槍說(shuō)明書操作。 5)轟擊后外植體的培養(yǎng)。DNA微彈轟擊后立刻轉(zhuǎn)入相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以免材

22、料脫水加重細(xì)胞受傷害的程度，獲得再生植株。第四十二張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 轉(zhuǎn)化率及其影響因素關(guān)于基因槍法的轉(zhuǎn)化率，目前不同的作者報(bào)告差別很大，不同的植物、同一植物的不同外植體均有明顯差異。一般在10-4-10-2頻率范圍。第四十三張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響轉(zhuǎn)化率的因素：1)金屬微粒的影響 目前主要采用兩種金屬微粒作為DNA包裹的載體：一種是鎢粉，其微粒直徑可根據(jù)不同植物材料進(jìn)行選擇，一般以0.6m至4m為宜，其優(yōu)點(diǎn)是廉價(jià)易得，制備容易。金粉顆粒，其比鎢粒具有更規(guī)則的球形體積，可以在相同體積下取得最大的附著面積；化學(xué)性質(zhì)也更為穩(wěn)定，也不像鎢粒那樣形成氧化膜

23、。此外，金粉對(duì)DNA的吸附力更強(qiáng)，許多學(xué)者認(rèn)為金粉比鎢粉更理想，但金粉價(jià)格昂貴，仍然應(yīng)用較少。第四十四張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (2)DNA沉淀輔助劑的影響 目前常用的DNA沉淀輔助劑有CaCl2、亞精胺、聚乙二醇等。這些化合物的濃度不僅對(duì)DNA在鎢(金)粉上的粘附有重要影響，而且對(duì)植物受體細(xì)胞的傷害也至關(guān)重要。 (3)DNA的純度及濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 DNA的純度越高越容易獲得成功的轉(zhuǎn)化，加入攜帶DNA如4-6kb的小牛胸腺DNA及鮭魚精DNA?？商岣咿D(zhuǎn)化率、但混雜的DNA起干擾作用。DNA的濃度對(duì)微彈轉(zhuǎn)化率也有影響。 (4)微彈速度的影響 基因槍的轟擊參數(shù)，DNA粒子速度

24、、入射濃度、阻擋板至樣品室高度、轟擊次數(shù)等均影響轉(zhuǎn)化率，其中微彈的速度是影響轉(zhuǎn)比率的一個(gè)重要因素。它直接決定了微彈對(duì)細(xì)胞、組織的作用力及產(chǎn)生損傷的程度 不同的植物材料、不同的轉(zhuǎn)化要求，應(yīng)選擇不同的速度。第四十五張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月特點(diǎn)無(wú)宿主限制：?jiǎn)巫尤~和雙子葉植物適用，動(dòng)物、微生物也適用靶受體類型廣泛：原生質(zhì)體、葉圓片、愈傷組織、懸浮液細(xì)胞、莖段、胚、花粉可控度高；高壓氣體基因槍已可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要無(wú)級(jí)調(diào)控微彈的速度和射入濃度，可以較高的命中率把DNA微粒載體射入特定層次的細(xì)胞從而為基因轉(zhuǎn)化提供可靠的技術(shù)措施。操作簡(jiǎn)便快速，甚至可克服無(wú)菌的困難。第四十六張，PPT共八十九頁(yè)，

25、創(chuàng)作于2022年6月 不少問(wèn)題值得進(jìn)一步研究例如，轉(zhuǎn)化頻率低，目前大多數(shù)只報(bào)道轉(zhuǎn)化后的瞬時(shí)表達(dá)，而穩(wěn)定遺傳的比例甚差，外源DNA的整合機(jī)理等理論問(wèn)題也不清楚、應(yīng)該說(shuō)基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)只處在研究階段，尚未成熱。第四十七張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. 微彈轟擊轉(zhuǎn)化法（3）適用范圍：植物細(xì)胞。（4）特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率高，省去了分離原生質(zhì)體的麻煩，耗資較大。第四十八張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5. 顯微注射法（microinjection）（1）原理：利用顯微注射儀，通過(guò)機(jī)械方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核（需用特制的玻璃微管）。倒置顯微注射儀第四十九張，PPT共八

26、十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5. 顯微注射法（2）過(guò)程：將外源基因直接注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受精卵原核，外源基因整合到動(dòng)物基因組，通過(guò)胚胎移植把含有外源基因的受精卵移植到受體子宮并發(fā)育。（3）適用范圍：真核生物，早期用于動(dòng)物，現(xiàn)已應(yīng)用于植物。（4）特點(diǎn)：繁瑣耗時(shí)、轉(zhuǎn)化率高，但需專門的顯微注射儀，且要求操作者有精細(xì)的操作技術(shù)和低密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。第五十一張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月受體細(xì)胞的固定動(dòng)物細(xì)胞具有獨(dú)特的貼壁生長(zhǎng)待性，不存在固定細(xì)胞的問(wèn)題植物細(xì)胞必須先建立細(xì)胞固定技術(shù)目前有三種方法：第五十二張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月瓊脂

27、糖包埋法：把低熔點(diǎn)的瓊脂糖熔化，冷卻到一定溫度后將制備的細(xì)胞懸浮液混合于瓊脂糖中。需要注意的問(wèn)題是，在包埋時(shí)細(xì)胞約1/3-1/2暴露在瓊脂糖表面，即細(xì)胞體的一半埋在瓊脂糖中，起固定作用，暴露的一半細(xì)胞可一進(jìn)行微針注射、否則瓊脂固化后很難進(jìn)行。多聚-L-賴氨酸粘連法：先用多聚-L-賴氨酸處理玻片表面，由于聚賴氨酸對(duì)細(xì)胞有粘連作用，因此當(dāng)分離的細(xì)胞或原生質(zhì)體與玻片接觸時(shí)被固定在玻片上。而且一個(gè)破片上可固定較多數(shù)量的細(xì)胞或原生質(zhì)體。第五十三張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月吸管支持法：用一固定的毛細(xì)管將原生質(zhì)體或細(xì)胞吸著在管口起到固定作用，然后再用微針進(jìn)行DNA注射。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是吸管可以

28、旋轉(zhuǎn)或移動(dòng)位置使操作者能選擇最佳位置進(jìn)行注射。 顯微注射用的微針通常用拉針機(jī)制備，尖針直徑以0.5m左右為宜。一次注入細(xì)胞質(zhì)中的DNA量約為10-9ml。第五十四張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)化率及影響因素 顯微注射雖然操作繁瑣耗時(shí)，但其轉(zhuǎn)化效率很高已發(fā)展出一套完善的技術(shù)，在煙草、油菜、苜蓿等植物的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率高達(dá)60以上。影響轉(zhuǎn)化率的因素。(1)原生質(zhì)體的成活率是轉(zhuǎn)化率的重要因素，只有注射那些能夠分裂、成活的原生質(zhì)體才能得到轉(zhuǎn)化。因此，注射時(shí)要選擇啟動(dòng)分裂、細(xì)胞壁開(kāi)始形成的原生質(zhì)體進(jìn)行注射。 (2)線性DNA比環(huán)形DNA具有更高的轉(zhuǎn)化率。 (3)操作要迅速敏捷，選擇最佳的注射

29、強(qiáng)力和濃度，使細(xì)胞的損傷減少到最小程度。 (4)固定技術(shù)要可靠，不能損傷細(xì)胞。第五十五張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月顯微注射特點(diǎn)方法簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高；6-8%它是一種純粹的物理方法，適用于各種植物和各種材料，無(wú)局限性；整個(gè)操作過(guò)程對(duì)受體細(xì)胞無(wú)藥物等毒害，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育；轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程無(wú)需特殊的選擇系統(tǒng)。其缺點(diǎn)是需要有精細(xì)操作的技術(shù)及低密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)，注射速度慢、效率低，要求研究者有耐心。第五十六張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6. 脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)法（1）原理：受體細(xì)胞的細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，脂質(zhì)體顆粒帶正電荷，利用引力的作用把遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。

30、即用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹DNA成球體，通過(guò)植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。脂質(zhì)體是根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)功能特性合成生物膜，然后把DNA包裹在人工膜內(nèi)。 第五十七張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十八張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法（2）過(guò)程：在形成脂質(zhì)體時(shí)，把用來(lái)轉(zhuǎn)染的目的DNA分子包裹在其中；脂質(zhì)體與細(xì)胞接觸；外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。（3）適用范圍：真核細(xì)胞。（4）特點(diǎn)：包在脂質(zhì)體內(nèi)的 DNA可免受細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解，所以可直接轉(zhuǎn)化外源 DNA；對(duì)植物病毒RNA的轉(zhuǎn)化率高；如用PEG誘導(dǎo)脂質(zhì)體與原生質(zhì)體融合可獲得高的轉(zhuǎn)化率。4 10-5第

31、五十九張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 影響脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化率的因素很多：脂質(zhì)體的制備類型、方法均有明顯差異；PEG的濃度、加入時(shí)間、PH值及ca”濃度均起到重要作用；保溫培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化時(shí)的條件同樣十分重要。第六十張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 近年來(lái)美國(guó)BRL公司推小一種新型脂質(zhì)體即轉(zhuǎn)化脂(1ipofectia，它主要是由具有強(qiáng)電荷的N-1-(2，3-dioleyoxy)propylN，N，N，trimethylammonium chloride(DOTMA)-(N-1-(2，3二油酰)丙酰N，N，N三甲氨鹽酸鹽)和磷酯組成的小單層脂質(zhì)體(SUV)。借助于DOTMA的強(qiáng)正電荷，可

32、以與帶有負(fù)電荷的DNA分子自發(fā)地結(jié)合，只要把轉(zhuǎn)化脂與DNA簡(jiǎn)單地混合，即可形成轉(zhuǎn)化脂與DNA的復(fù)合體，把DNA包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，并可有效地轉(zhuǎn)化動(dòng)植物細(xì)胞。此方法不僅可明顯提高轉(zhuǎn)化率，而且由于這種脂質(zhì)體有商品出售，免去耗時(shí)的制備上作，操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件溫和。朱禎等1990年首次利用此脂質(zhì)體將人的干擾素cDNA導(dǎo)入水稻原生質(zhì)體獲得轉(zhuǎn)基因植株，并檢測(cè)了干擾素在水稻細(xì)胞中的有效表達(dá)轉(zhuǎn)化頻率提高到14。第六十一張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月7. 花粉管通道法（1）原理：在花粉管通道形成之后封閉之前一段時(shí)間，使外源DNA能沿著花粉管通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具正常細(xì)胞壁的卵細(xì)胞、合子或早期胚胎細(xì)胞，

33、從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。（2）適用范圍：植物第六十二張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月7. 花粉管通道法（3）特點(diǎn)：直接得到轉(zhuǎn)化種子，不經(jīng)過(guò)組培，減少了基因型的影響；操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，無(wú)需昂貴儀器和化學(xué)藥品，可直接在大田操作；大量快捷，性狀穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高；可獲得110-2110-1的高遺傳轉(zhuǎn)化率。 不僅可以導(dǎo)入供體的總DNA，而且可導(dǎo)入含目的基因的質(zhì)粒，甚至可將化學(xué)誘變劑導(dǎo)入胚囊。缺點(diǎn)：工作時(shí)間受自然花期限制，田間操作受環(huán)境影響大，基因組以隨機(jī)方式結(jié)合，要求工作人員經(jīng)濟(jì)性要強(qiáng)，工作效率較低。第六十三張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月我國(guó)科學(xué)家周光宇在1983年首次在“Methods i

34、n En-zymology”報(bào)道的研究成果?，F(xiàn)該技術(shù)主要在蔬菜育種上應(yīng)用。（白菜、茄子、黃瓜、番茄、辣椒等操作步驟1.外源DNA的制備2. 分析受體植物的受精過(guò)程及時(shí)間，確定導(dǎo)入外源DNA的時(shí)間方法（3種） 柱頭涂抹法 柱頭切除法 花粉粒吸入法3.后代材料處理第六十四張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月9. 激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法 早在1984年Tao等首先利用激光微束對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、此庸Web等利用激光微束技術(shù)對(duì)原生質(zhì)體、花粉以及活細(xì)胞內(nèi)的葉綠體進(jìn)行外源DNA導(dǎo)入獲得成功，并用熒光標(biāo)記的大腸桿菌pBR322質(zhì)粒DNA在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中得到檢測(cè)。（1）原理：利用直徑很小、能量很高的激

35、光微束能引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理。在熒光顯微鏡下找適合的細(xì)胞，然后用激光代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔外于細(xì)胞周圍的外源DNA分子隨之進(jìn)入受體細(xì)胞。第六十五張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月9. 激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法（2）特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便快捷，轉(zhuǎn)化效率高10-3-10-4，無(wú)宿主限制，但需要貴重儀器，技術(shù)條件要求高，穩(wěn)定性和安全性不如電穿孔法和基因槍法。（3）適用范圍：動(dòng)植物細(xì)胞、組織、器官及線粒體、葉綠體。第六十六張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月過(guò)程1）DNA的提取2)受體植物樣品制備：將欲照射的植物細(xì)胞或組織用高滲緩沖液浸泡數(shù)分鐘，不同作物不同外植體所用高

36、滲液不同，浸泡時(shí)間也不同。 3)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞懸浮液準(zhǔn)備：激光照射前洗去高滲液，加新鮮培養(yǎng)液。吸取0.5mI細(xì)胞懸浮液，加50ul質(zhì)粒DNA或植物外源DNA(濃度5ugml)一起注入激光微束系統(tǒng)的Rose小室。第六十七張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4)激光微束照射：激光微束顯微照射裝置如為NdYAG四集倍頻脈沖激光冠微照射系統(tǒng)、即輸出波長(zhǎng)技需要選擇，脈寬10-15ns。激光束引入一臺(tái)相差顯微鏡，用40物鏡聚焦Y于欲照射的細(xì)胞。光斑直徑為1.3nm。照射時(shí)移動(dòng)載物臺(tái)，使激光脈沖在植物細(xì)胞團(tuán)上進(jìn)行掃描照射，照射時(shí)間每個(gè)佯品60分鐘，約打7000個(gè)脈沖。 5)培養(yǎng)：激光照射后，將樣品用新鮮的培

37、養(yǎng)液沖洗1-2次，然后接種在裝有液體培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中，25度條件下懸浮培養(yǎng)2-3天或固體培養(yǎng)。第六十八張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十九張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月10. 病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法（1）原理：用病毒(噬菌體)DNA(或 RT-DNA)構(gòu)建的克隆載體或攜帶目的基因的克隆體，在體外包裝成病毒(噬菌體)顆粒后，感染受體細(xì)胞，使其攜帶的重組 DNA 進(jìn)入受體細(xì)胞，將此過(guò)程稱為病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法。（2）適用范圍：主要用于構(gòu)建基因文庫(kù)和物的轉(zhuǎn)基因，早期也用于植物的轉(zhuǎn)基因。 第七十張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月10. 病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法（3）類型：帶有目的

38、基因的病毒顆粒直接感染受體細(xì)胞，目的基因打隨同病毒DNA分子整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，這樣以后不需要再包裝成病毒顆粒。帶有目的基因的病毒是缺陷型的，需同另一輔助病毒一起感染受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞內(nèi)包裝成新的病毒顆粒。雖然帶有目的基因的SV40早期轉(zhuǎn)錄是缺陷型的，但被感染的cos細(xì)胞系的基因組中整合的SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段DNA，所以無(wú)需輔助病毒做混合感染。第七十一張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月11. 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法（1）原理：哺乳動(dòng)物細(xì)胞能捕獲黏附在細(xì)胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。（2）基本操作過(guò)程：將待轉(zhuǎn)染的外源 DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，

39、逐滴加入到不斷攪拌的Hepers-磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀復(fù)合物；用吸管將沉淀復(fù)合物黏附在哺乳動(dòng)物單層培養(yǎng)細(xì)胞表面；保溫幾小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)液洗凈細(xì)胞，再用新鮮培養(yǎng)茹繼續(xù)培養(yǎng)，直至外源基因表達(dá)。第七十二張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月11. 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法（3）特點(diǎn)：多使用高濃度的DNA，1050g/ml；保溫時(shí)間隨受體細(xì)胞而異；Hepers-磷酸鈣溶液應(yīng)不斷攪拌，DNA溶液則應(yīng)緩慢加入，否則形成大塊狀顆粒，不利于受體細(xì)胞吸納。（4）適用范圍：哺乳動(dòng)物細(xì)胞。第七十三張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月12. DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法即二乙胺乙基葡聚糖法（1）可能機(jī)制：

40、DEAE葡聚糖能與外源DNA形成復(fù)合物，保護(hù)DNA免受核酸降解 DEAE葡聚糖可作用于受體細(xì)胞，增加其通透性，便于DNA進(jìn)入。（2）類型：病毒DNA直接與DEAE-葡聚糖混合形成復(fù)合物，再處理受體細(xì)胞；受體細(xì)胞先用DEAE-葡聚糖處理，然后再接觸DNA。（3）特點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性高，轉(zhuǎn)染率高于磷酸鈣法，但轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞不能獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系，故僅適用于基因瞬時(shí)表達(dá)研究。（4）適用范圍：哺乳動(dòng)物細(xì)胞 第七十四張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月13. 聚陽(yáng)離子DMSO轉(zhuǎn)染法（1）原理：采用聚陽(yáng)離子poly-brene處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以增加細(xì)胞表面對(duì)DNA的吸附能力，然后用25%30%D

41、MSO短暫處理細(xì)胞，增加膜的通透性，以提高對(duì)外源DNA的捕獲量（2）適用范圍：哺乳動(dòng)物細(xì)胞第七十五張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月14. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法（1）原理：植物受傷后，在傷口處分泌大量的酚類物質(zhì)如乙酰丁香酮AS、羥基乙酰丁香酮等，他們是農(nóng)桿菌識(shí)別敏感植物的信號(hào)分子，趨化性農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，并將其Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)部，故目的基因與Ti質(zhì)粒結(jié)合后，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，與染色體DNA整合而得以穩(wěn)定維持或表達(dá)。第七十六張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月外植體（子葉、上胚軸、莖段、愈傷組織）胚 狀 體轉(zhuǎn)基因檢測(cè)（GUS、PCR ）進(jìn)一步檢

42、測(cè)（ Southern blot 、 Northern blot、ELISA）LB繁殖菌體農(nóng)桿菌（Ti或Ri質(zhì)粒）轉(zhuǎn) 基 因 植 株田間實(shí)驗(yàn)、遺傳分析、功能鑒定侵 染 轉(zhuǎn) 化愈 傷 組 織共 培 養(yǎng)芽誘導(dǎo)生根 （試管嫁接）預(yù) 培 養(yǎng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法第七十七張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 （一）農(nóng)桿菌包括農(nóng)桿菌包括根癌農(nóng)桿菌（Ti質(zhì)粒）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Ri質(zhì)粒），質(zhì)粒中含有一段可移動(dòng)的DNA稱為T-DNA，可作為外源DNA的載體。 （二）根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的過(guò)程大致包括：1、農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞表面特定部位的識(shí)別和附著；2、經(jīng)敏感細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，位于Ti質(zhì)粒上控制T區(qū)的基因轉(zhuǎn)移的Vir區(qū)基因活化并表達(dá)；3、T-DNA從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)，通過(guò)細(xì)菌和植物細(xì)胞的壁，轉(zhuǎn)移并整合到植物細(xì)胞的核基因組中。第七十八張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月14. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法（2）類型： 整株感染：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞的受傷部位，將得到的腫瘤或發(fā)根切下，至于含羧芐青霉素的無(wú)激素培養(yǎng)基上培養(yǎng)并殺菌，這是獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞的最簡(jiǎn)單的方。該法實(shí)驗(yàn)周期短，操作簡(jiǎn)便，但在用轉(zhuǎn)化后形成的腫瘤組織時(shí)，常會(huì)有未轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞，即形成的是嵌合體植株。第七十九張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十張，PPT共八十九頁(yè)，創(chuàng)作于202