植物細(xì)胞微絲束的光學(xué)顯微鏡觀察實驗原理及步驟

1、實驗五：植物細(xì)胞微絲束的光學(xué)顯微鏡觀察【課前預(yù)習(xí)】1為什么本實驗中考馬斯亮蘭R250 染的是微絲？2實驗中的各種試劑分別有何作用？【目的要求】掌握植物細(xì)胞骨架的光鏡標(biāo)本制作方法。【基本原理】細(xì)胞骨架在通常情況下不穩(wěn)定：如低溫、高壓、餓酸處理等。當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX-100 處理細(xì)胞時，能溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中及細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)，而細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻不被破壞顯得更清晰，M-緩沖液洗滌細(xì)胞，可以提高細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，戊二醛固定能較好地保存細(xì)胞骨架成分，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250 染色后，可使細(xì)胞骨架蛋白著色，而胞質(zhì)背景著色弱，有利細(xì)胞骨架纖維顯示。微絲、微管和中間纖維都是直徑很小的結(jié)構(gòu)，最大的單根微

2、管才25nm 左右，只能在電鏡下才能觀察到。目前研究細(xì)胞骨架的主要方法是應(yīng)用高壓電鏡或免疫熒光顯微鏡技術(shù)。本實驗用普通光鏡觀察到細(xì)胞骨架，是因為骨架纖維成束分布、結(jié)構(gòu)經(jīng)染色后，有夸大作用。由于細(xì)胞經(jīng)TritonX-100 抽提后剩下的主要是細(xì)胞骨架成分，使得顯現(xiàn)更清晰。細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)中縱橫交錯的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，按組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞的生長、運動、分裂、分化和物質(zhì)運輸?shù)绕鹬匾饔谩９鈱W(xué)顯微鏡下細(xì)胞骨架的形態(tài)學(xué)觀察多用1% Triton X-100 處理細(xì)胞，可使細(xì)胞膜溶解，而細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)被保存， 再用考馬斯亮蘭R250 染色，使

3、得胞質(zhì)中細(xì)胞骨架得以清晰顯現(xiàn)。【實驗用品】1材料：新鮮洋蔥鱗莖2試劑1） M 緩沖液（pH 7.2）各成分終濃度為：50mmol/L 咪唑(MW:68.08)； 50mmol/L KCl(MW:74.55)； 0.5mmol/L MgCl26H2O(MW:203.30)； 1mmol/L EGTA(MW:380.36)；0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)； 1mmol/L DTT(MW:154.3)2） 6mmol/L PBS 磷酸緩沖液 （pH 6.5）：KH2PO4 : Na2HPO4.2H2O = 7:33） 0.7% NaCl 生理鹽水4） 1% Triton

4、X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于 M-緩沖液5） 3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL，PBS 88mL6） 0.2% 考馬斯亮藍(lán)R250 染液 200mL：考馬斯亮藍(lán)R250 0.2g；甲醇 46.5mL；冰乙酸 7mL；蒸餾水46.5mL3儀器：光學(xué)顯微鏡，鑷子，剪刀，試管，表面皿，滴管，載玻片，蓋玻片【方法步驟】【實驗結(jié)果】洋蔥鱗莖外層與內(nèi)層的表皮細(xì)胞比較（放大倍數(shù)1020）洋蔥鱗莖內(nèi)層的表皮細(xì)胞骨架【實驗報告】1光鏡下觀察到的細(xì)胞骨架有何形態(tài)特征？2請設(shè)計一個實驗鑒定你所觀察到的細(xì)胞骨架是哪一類型。附：各種主要試劑的作用1Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非離子去垢劑；適當(dāng)濃度的Triton X-100，可使細(xì)胞膜溶解，而細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架系統(tǒng)可被保存2M緩沖液和磷酸緩沖液作用：維持細(xì)胞的滲透壓3EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇雙醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金屬離子；后者專一性螯合Ca2，主要是高濃度的Ca2可是微管解聚，因此加