ERΔE5在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義探討

1、ERE5在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義討論【摘要】目的：通過(guò)檢測(cè)乳腺癌和癌旁乳腺組織乳腺癌標(biāo)本邊緣外5中雌激素受體EstrgenReeptr，ER剪切變異體ERE5表達(dá)程度的差異，討論ERE5在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法：培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-1，采用RT-PR檢測(cè)目的基因ERE5，建立陽(yáng)性對(duì)照體系。以液氮冷凍儲(chǔ)存的59例乳腺癌組織和59例癌旁乳腺組織提取目的基因，進(jìn)展對(duì)照實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)ERE5在乳腺癌組織和癌旁乳腺組織中的表達(dá)狀況，分析二者的表達(dá)差異及其臨床意義。結(jié)果：在ER陽(yáng)性乳腺癌標(biāo)本中，ERE5陽(yáng)性20例20/44，ER陰性的乳腺癌標(biāo)本中，ERE5陽(yáng)性6例6/15，兩者差異無(wú)

2、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.7170；在人表皮生長(zhǎng)因子受體2huanepideralgrthfatrreeptr，HER-2陽(yáng)性的乳腺癌標(biāo)本中，ERE5陽(yáng)性20例20/22,HER-2陰性的乳腺癌標(biāo)本中，ERE5陽(yáng)性6例6/37。采用單因素分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌標(biāo)本中ERE5的陽(yáng)性表達(dá)與HER-2的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)P0.0001。在乳腺癌標(biāo)本中ERE5的陽(yáng)性表達(dá)率為44.07%(26/59)；在癌旁乳腺組織中未見(jiàn)ERE5的表達(dá)，兩者比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.0001。在乳腺癌標(biāo)本中ERE5的表達(dá)與臨床分期無(wú)相關(guān)性P=0.9084。結(jié)論：在乳腺癌標(biāo)本中ERE5的表達(dá)顯著高于癌旁乳腺組織，而且與HER-2表達(dá)呈正

3、相關(guān)，提示ERE5可能是一種新的臨床預(yù)后的指標(biāo)。【關(guān)鍵詞】乳腺腫瘤受體，雌激素ERE5人表皮生長(zhǎng)因子受體【ABSTRAT】bjetive：TevaluatetheptentialrelatinshipbeteenERE5andthepathphysilgiarkersfbreastarinabydetetingtheexpressinfestrgenreeptr(ER)spliingvariantERE5inthearinatusspeienanditsparaarinatusbreasttissue.ethds：TheexpressinfERE5inbreastarinatustissuea

4、nditsparaarinatusbreasttissuein59patientsfbreastanerasdetetedrespetivelybyreversetransriptinplyerasehainreatin(RT-PR).TheRT-PRaplifiatinfERE5fbreastanerellline乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,內(nèi)分泌治療作為綜合治療的重要組成局部已愈來(lái)愈受到重視。1986年發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)雌激素受體EstrgenReeptr，ER，隨著對(duì)其功能認(rèn)識(shí)的深化，業(yè)已將乳腺癌分為兩大類(lèi)：激素依賴(lài)型和激素非依賴(lài)型。目前認(rèn)為在乳腺癌發(fā)生的早期，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為激素依賴(lài)性生

5、長(zhǎng)，因此可以使用激素拮抗劑進(jìn)展治療,但腫瘤細(xì)胞會(huì)逐漸演變?yōu)榧に胤且蕾?lài)性生長(zhǎng)，產(chǎn)生這種變化的分子機(jī)制目前仍不清楚。隨著RT-PR技術(shù)和RNA酶抑制劑的使用,1991年前后已在RNA程度發(fā)現(xiàn)了20余種ER的剪切變異體,被認(rèn)為是乳腺癌激素非依賴(lài)性生長(zhǎng)的一個(gè)可能因素。在這些剪切變異體中，ERE5是少數(shù)幾種功能域陽(yáng)性的變異體之一。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)乳腺癌組織和癌旁乳腺組織中ER剪切變異體ERE5的表達(dá)，討論ERE5在乳腺癌臨床診治中的意義。1資料與方法1.1一般資料搜集我科乳腺中心2022年410月間收治的乳腺癌患者59例，均為女性，年齡3178歲，平均年齡53歲。均行乳腺癌切除術(shù)，以乳腺癌組織為實(shí)驗(yàn)組

6、，取腫瘤邊緣外5的癌旁乳腺組織作為對(duì)照組。所有標(biāo)本均經(jīng)病理科醫(yī)師確診后，立即存放于液氮中冷凍儲(chǔ)存自取材到冷凍儲(chǔ)存的時(shí)間控制在30in內(nèi)，直至實(shí)驗(yàn)中開(kāi)場(chǎng)使用。59例乳腺癌標(biāo)本中ER陽(yáng)性44例，ER陰性15例，HER-2陽(yáng)性22例，HER-2陰性37例；臨床分期：期19例，期26例，期10例，期1例，未分期3例；病理類(lèi)型包括浸潤(rùn)性小葉癌1例，黏液癌2例，導(dǎo)管原位癌2例，混合癌10例其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌并浸潤(rùn)性小葉癌6例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌并黏液癌4例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌44例。1.2主要試劑與儀器人乳腺導(dǎo)管上皮癌細(xì)胞株ZR-75-1購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院根底所；RT-PR引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成；Sup

7、erSriptTFirst-StrandSynthesisSystefrRT-PR購(gòu)自Invitrgen公司；Taq酶、RNA提取劑Trizl購(gòu)自Prega公司；RPI1640購(gòu)自GIB公司。主要儀器包括倒置顯微鏡LYPUS,日本、酶標(biāo)儀Bi-Rad，日本、紫外分光光度儀PharaiaBiteh，英國(guó)、臺(tái)式高速離心機(jī)HERAEUS,德國(guó)、凝膠成像分析儀Bi-Rad，日本、恒溫恒流電泳儀北京東方儀器廠、水浴搖床EYELA,日本、2培養(yǎng)箱N(xiāo)AP，法國(guó)等。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)以RPI1640液為培養(yǎng)基含2l/L谷氨酰胺，10%FBS，100U/L青霉素鈉，100U/L鏈霉素，于37、5%

8、2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ZR-75-1細(xì)胞株。當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶時(shí)棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)適當(dāng)?shù)奶幚砗蟛捎肞rega公司的RNA提取液Trizl提取細(xì)胞總RNA。1.3.2檢測(cè)RNA質(zhì)量取細(xì)胞總RNA樣品30g，經(jīng)適當(dāng)處置后于65變性15in，同時(shí)制備1%的瓊脂糖甲醛變性凝膠含1PS，2.2l/L的甲醛，預(yù)電泳5in，以1PS為電泳緩沖液，加樣后以35V/恒壓電泳，檢測(cè)RNA的質(zhì)量圖1。1.3.3RT反響將提取的總RNA5g在總體積為20L的反響體系中，用SuperSriptRT進(jìn)展逆轉(zhuǎn)錄反響。65變性5in，4冷卻3in，42參加逆轉(zhuǎn)錄酶后反響52in，72滅活逆轉(zhuǎn)錄酶15in，4保存。1.3.4PRERE5上游

9、引物：5TGTATATGGAGAAG3，下游引物：5ATTTTTGGTTTGGA3；內(nèi)參上游引物：5AAGGTGAGAAGGGAAGTTGTATAAT3，下游引物：5TTGTTAGTAGGGATGATTG3。PR總體積為50L，RT反響產(chǎn)物為8L，內(nèi)參基因GAPDH的PR反響溫度及時(shí)間設(shè)定如下：94變性5in；94變性30s，55退火45s，72延伸90s，共30個(gè)循環(huán)；然后72延長(zhǎng)7in，4保存。目的基因ERE5的PR溫度及時(shí)間設(shè)定如下：94變性5in；94變性30s，65退火90s，72延伸2in共40個(gè)循環(huán)；然后72延長(zhǎng)15in，4保存。1.3.5PR的反響產(chǎn)物電泳及基因測(cè)序PR的反響產(chǎn)

10、物分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳GAPDH和2%瓊脂糖凝膠電泳ERE5檢測(cè)特異基因條帶，于凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)展拍照，檢測(cè)目的基因是否表達(dá)。PR反響產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，送上?？】粕锛夹g(shù)測(cè)序，將測(cè)序的結(jié)果與的人ERE5序列做Blast分析。以上細(xì)胞反響的過(guò)程作為實(shí)驗(yàn)體系的陽(yáng)性對(duì)照。1.4乳腺標(biāo)本目的基因檢測(cè)乳腺癌標(biāo)本及癌旁對(duì)照標(biāo)本在液氮冷凍狀態(tài)下研磨后，將組織粉末放入無(wú)RNA酶的離心管中，按50g組織1Trizl將研磨后的組織和Trizl混合并用勻漿機(jī)制備勻漿。余實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)局部。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用STATAversin8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展數(shù)據(jù)處理。每組數(shù)據(jù)均采用2檢驗(yàn)，可信區(qū)

11、間I為95%，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果本研究所有標(biāo)本提取的RNA經(jīng)過(guò)1%的瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)合格后進(jìn)展目的基因的檢測(cè)。ZR-75-1細(xì)胞株及局部乳腺癌組織中檢測(cè)到含有730bp的目的基因ERE5，含500bp的內(nèi)參基因GAPDH均陽(yáng)性表達(dá)圖在ER陽(yáng)性乳腺癌標(biāo)本中ERE5陽(yáng)性率為.20/44，ER陰性的乳腺癌標(biāo)本中ERE5陽(yáng)性率為40.06/15，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.7170；HER-2陽(yáng)性的乳腺癌標(biāo)本中，ERE5陽(yáng)性率為90.9%20/22，HER-2陰性的乳腺癌標(biāo)本中ERE5陽(yáng)性率為16.2%6/37；采用單因素分析，乳腺癌標(biāo)本中ERE5的陽(yáng)性表達(dá)與HER-2的陽(yáng)

12、性表達(dá)成正相關(guān)(P0.0001，表1)。在乳腺癌標(biāo)本中ERE5的陽(yáng)性表達(dá)率為44.07%(26/59)，在癌旁乳腺組織中未見(jiàn)ERE5的表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0001)。在3例未分期乳腺癌標(biāo)本中，ERE5陽(yáng)性2例；在19例期乳腺癌標(biāo)本中，ERE5陽(yáng)性8例；在26例期乳腺癌標(biāo)本中，ERE5陽(yáng)性12例；在10例期乳腺癌標(biāo)本中，ERE5陽(yáng)性3例；1例期乳腺癌標(biāo)本陽(yáng)性表達(dá)ERE5，臨床分期與ERE5的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.9048。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論年ER基因首次被發(fā)現(xiàn)3，其功能和臨床意義受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)約60%的乳腺癌患者ER陽(yáng)性。諸多臨床研究結(jié)果顯示，ER是乳腺癌獨(dú)

13、立的預(yù)后因素，而且可以用來(lái)指導(dǎo)內(nèi)分泌治療4。1991年前后人們相繼發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種ER剪切變異體,但是這些變異體在乳腺腫瘤的發(fā)生、開(kāi)展過(guò)程中所起的作用及其與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系尚不明確5-6。有研究說(shuō)明，ERE5在癌旁乳腺組織及腫瘤組織中均有表達(dá)，但在癌旁組織中表達(dá)量顯著低于腫瘤組織7。但本研究只發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中.26/59表達(dá)730bp的ERE5，而癌旁組織中那么沒(méi)有表達(dá)。Indra等8研究發(fā)現(xiàn)不同人種中ERE5的表達(dá)狀況亦不同，如在高加索白人女性正常乳腺組織和腫瘤組織中都不曾發(fā)現(xiàn)ERE5的表達(dá)；而在非裔黑人美國(guó)女性的腫瘤組織和正常乳腺組織中均可以發(fā)現(xiàn)3種ERE5，分別為730bp、540bp和420

14、bp。因此推測(cè)，研究結(jié)果可能與人種有關(guān)，尚需大樣本臨床研究驗(yàn)證。ERE5已發(fā)現(xiàn)十余年，是一種功能域陽(yáng)性的ER剪切變異體，體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ERE5可以發(fā)生二聚化，在不依賴(lài)雌激素的情況下激活目的基因9-10，因此有學(xué)者認(rèn)為它可能在乳腺癌由激素依賴(lài)型向激素非依賴(lài)型轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮了重要作用11。雖然ERE5無(wú)配體結(jié)合區(qū)，但它仍具備激活轉(zhuǎn)錄的功能，通過(guò)與ER競(jìng)爭(zhēng)SR-1e抑制ER對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)12-13。此外，等發(fā)如今ER陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染ERE5后細(xì)胞對(duì)他莫昔芬耐藥。本研究證實(shí)在乳腺癌組織中ERE5的表達(dá)顯著增加，這種變化可能通過(guò)不同途徑改變雌激素對(duì)乳腺組織的調(diào)控，進(jìn)而改變?nèi)橄侔┗颊邔?duì)雌激素受體

15、拮抗劑和其他治療的反響。關(guān)于ERE5與乳腺癌預(yù)后關(guān)系的研究報(bào)道較少，Indra等8研究發(fā)現(xiàn)非裔美國(guó)女性與高加索白人女性乳腺癌患者相比預(yù)后差，基因程度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)非裔黑人美國(guó)女性乳腺癌患者中ERE5的表達(dá)顯著高于高加索白人女性乳腺癌患者，因此考慮ERE5的異常表達(dá)可能與兩類(lèi)患者預(yù)后不同有相關(guān)性。本研究未發(fā)現(xiàn)目的基因的表達(dá)與臨床分期有相關(guān)性，但經(jīng)單因素分析發(fā)現(xiàn)，ERE5的表達(dá)與HER-2的表達(dá)呈顯著正相關(guān)P0.0001。2000年，AS發(fā)表了新的乳腺癌、結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)記物使用綱要，文中明確指出，HER-2為乳腺癌的腫瘤標(biāo)記物之一6。目前認(rèn)為，乳腺癌組織中HER-2的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化差、淋巴結(jié)陽(yáng)性呈正

16、相關(guān)15；HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者對(duì)他莫昔芬治療的反響差。本研究發(fā)現(xiàn)HER-2的表達(dá)與目的基因的表達(dá)顯著相關(guān)，提示ERE5可能是一種可以預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后和選擇內(nèi)分泌治療的新指標(biāo)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1larkeR,LippanE.Antiestrgenresistane：ehanissandreversalJ.DrugResistaneinnlgy,1992，501-536.2PfefferU,FearttaE,VidaliG.expressinfultipleestrgenreeptrvariantessengerRNAsinnralandneplastibreasttissueandinF-7el

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