放射性配體受體結(jié)合試驗(yàn)

1、放射性配體受體結(jié)合試驗(yàn)1、定義:放射性配基與受體結(jié)合分析簡(jiǎn)稱(chēng)為受體放射分析（radioassayofreceptors）,它是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記配基與特異受體相結(jié)合，研究受體的親和力和受體的數(shù)量，以及研究受體亞型的常用方法。2、原理:1）、放射性標(biāo)記配基（激動(dòng)劑或拮抗劑）和組織、細(xì)胞，或含有受體的制劑一起溫育，使受體和配基充分結(jié)合，形成受體-配基復(fù)合物，終止反應(yīng)后，用過(guò)濾或離心的方法除去未被結(jié)合的標(biāo)記物，測(cè)定濾膜或沉淀物中的放射性，即可計(jì)算出和配基結(jié)合的受體的量。2）、放射配基與受體制備物（含受體的組織或細(xì)胞制備物）作用時(shí)，其結(jié)合形式有兩種，一種是配基與受體的特異性結(jié)合，其特點(diǎn)是親和力高；且由

2、于受體有限，故具有飽和性。另一種是配基與受體制備物的非受體分子的結(jié)合，稱(chēng)為非特異性結(jié)合。其特點(diǎn)是親和力低但結(jié)合點(diǎn)多，不易飽和。用放射性配基研究特異性受體時(shí)，必須設(shè)法減除非特異性結(jié)合。一般采用的方法是制備總結(jié)合管和非特異結(jié)合管，兩者計(jì)數(shù)之差即為特異性結(jié)合量。總結(jié)合管：將放射性配基與受體制備物反應(yīng)，除去游離的放射性配基，測(cè)定結(jié)合的放射性配基的計(jì)數(shù)，（其中包含特異性結(jié)合與非特異性結(jié)合，稱(chēng)為總結(jié)合）。非特異性結(jié)合管：將大量（一般為5001000倍）非標(biāo)記特異性配基與標(biāo)記的放射性配基相混，然后共同與受體制備物反應(yīng)。由于非標(biāo)記配基與標(biāo)記配基兩者比例懸殊，所以受體幾乎全部被非標(biāo)記配基飽和，標(biāo)記配基只能與組織

3、制備物中的非特異結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。這時(shí)測(cè)出的標(biāo)記配基的結(jié)合量，反映的是非特異結(jié)合量。用總結(jié)合管的計(jì)數(shù)減去非特異結(jié)合管的計(jì)數(shù)，即可得到特異結(jié)合計(jì)數(shù)。RBA用放射性核素來(lái)標(biāo)記配基，與相應(yīng)的受體進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)，可對(duì)受體的性質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析。1、定性RBA：是通過(guò)反應(yīng)的量效關(guān)系的變化來(lái)判斷受體的類(lèi)型，單位點(diǎn)或多位點(diǎn)結(jié)合式，及受體與配體結(jié)合的特點(diǎn)，反應(yīng)的可逆性、協(xié)作性等。2、定量RBA：是在已知配體與受體反應(yīng)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過(guò)結(jié)合反應(yīng)，給出一定量的組織或細(xì)胞中能與該放射性配體結(jié)合的受體數(shù)及結(jié)合的平衡解離常數(shù)或結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（最大結(jié)合容量）。4、實(shí)驗(yàn)材料:動(dòng)物組織儀器（組織勻漿機(jī)、旋渦混合器、低溫高速離

4、心機(jī)、電熱恒溫水溫箱、-80C冰箱、制冰機(jī)、抽慮瓶、液閃儀等）材料（2ml/6ml分離管、10ul/200ul/1ml槍頭、微纖維濾紙等）藥品（放射性配基、各種非標(biāo)計(jì)化合物等）5、實(shí)驗(yàn)具體步驟：1）、配制各種緩沖液及試劑按處方配比配制各種緩沖液貯備液配制各種非標(biāo)記配體溶液配制各種受試藥物溶液注意：該項(xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：分析天平、移液槍、燒杯、量筒、容量瓶、試管、EP管等試劑：無(wú)水乙醇、超純水、Tris、抗血酸、優(yōu)降寧、HCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、DMSO、甲苯、PPO、POPOP、Methysergide、Butaclamol及5HT等2）、制備膜受體分離出目標(biāo)組織

5、加10倍體積Tris-HCl溶液冰冷的緩沖液，用組織勻漿機(jī)勻漿3次，每次數(shù)秒鐘，制成組織勻漿液組織勻漿液用低溫高超離心機(jī)離心（12000轉(zhuǎn)/分）3次，每次20分鐘棄上清液，沉淀（膜受體）放-80度超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。注意：該?xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：手術(shù)器械、組織勻漿機(jī)、制冰機(jī)、超低溫冰箱、低溫高超離心機(jī)試劑：超純水3）、加樣：取出膜受體，加入一定體積的冰冷的緩沖液，混勻，使成一定濃度的膜受體溶液。取放射性配體母液，用無(wú)水乙醇稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度按以下順序及比例加入各種反應(yīng)液。（1）總結(jié)合管：100ul膜受體+200ul緩沖液+10ul放射性配體（2）非特異管：100ul膜受體+100ul緩沖液

6、+100ul非標(biāo)記配體+10ul放射性配體（3）受試物管：100ul膜受體+100ul緩沖液+100ul藥物溶液+10ul放射性配體注意：該項(xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：移液槍、燒杯、量筒、EP管等試劑：超純水、無(wú)水乙醇、放射性配體母液4）、受體配體結(jié)合反應(yīng)：以上各管在加完放射性配體后，立即放入37度的水浴鍋中，孵育20分鐘。20分鐘后把各管放入冰中終止反應(yīng)。注意：該項(xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：恒溫水浴鍋，制冰機(jī)試劑：無(wú)5）、分離游離及結(jié)合的放射性配體上述各管在反應(yīng)結(jié)束后，分別倒入抽濾裝置進(jìn)行過(guò)濾，并用5-10ml冰冷的緩沖液沖洗濾膜2次。濾膜放入85度烘箱中烘干，隨后放入測(cè)試管中，關(guān)加入一定體積的

7、閃爍液，浸泡過(guò)夜。注意：該項(xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：抽濾器、烘箱、濾紙、移液槍、液閃杯試劑：甲苯、PPO、POPOP6）、測(cè)定結(jié)合型放射配體每分鐘放射計(jì)數(shù)采用放射性計(jì)數(shù)儀，測(cè)定各測(cè)試管中結(jié)合型放射配體每分鐘放射計(jì)數(shù)注意：該項(xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：液閃儀試劑：無(wú)7）、數(shù)據(jù)處理按以下公式計(jì)算各化合物對(duì)同位素配基結(jié)合的抑制率百分率：抑制率（I%）=（總結(jié)合管cpm化合物cpm）/（總結(jié)合管cpm一非特異結(jié)合管cpm）X100%化合物每次實(shí)驗(yàn)做兩復(fù)管，進(jìn)行兩次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)。8）、各種指標(biāo)IC50:半數(shù)抑制濃度KD：平衡解離常數(shù)（mol/L）,物理意義為受體有一半結(jié)合配基時(shí)所需要的配基濃度。Bmax:受體

8、最大結(jié)合容量（fmol/mg蛋白質(zhì)）nH：Hill系數(shù)9）、Seatchard方程與作圖（飽和實(shí)驗(yàn)）簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)受體和配體結(jié)合反應(yīng)（Clark模型）條件：（1）配基與受體結(jié)合反應(yīng)為可逆雙分子反應(yīng)；（2）所有受體都是等效和獨(dú)立的，同一受體的不同分子對(duì)配基的親和力都相等，而且不受鄰近受體分子結(jié)合配基與否的影響；（3）配體本身不代謝，也不與其它位置結(jié)合；（4）生物效應(yīng)的強(qiáng)度與濃度近似于總配基濃度。10）、飽和曲線(xiàn)固定的受體數(shù)量，固定數(shù)量的非標(biāo)和不同濃度體積的放射性配體1）飽和曲線(xiàn)受體數(shù)量一定，當(dāng)配體（一般是不同濃度體積的放射性配體與固定數(shù)量的非標(biāo)）的濃度從零開(kāi)始上升時(shí)，形成的復(fù)合物也逐漸增多。但由于受體數(shù)量有限，又是可逆反應(yīng)，因此RL（受體配體復(fù)合物）的增加不是直線(xiàn)上升，而是一條上升先快后慢的曲線(xiàn)，最后絕大部分受體與配體結(jié)合時(shí)，RL的增加就非常緩慢，漸趨水平，即受體已經(jīng)飽和了，此即飽和曲線(xiàn)。2）曲線(xiàn)的高度取決于RT。在曲線(xiàn)起始段，曲線(xiàn)上升的快慢即曲線(xiàn)的斜率取決于配基與受體的親和力，所以，KD越?。ㄓH和力越大），飽和曲線(xiàn)上升越快,KD越大（親和力越小），飽和曲線(xiàn)上升越慢。（即：親和力越大，受體與配件結(jié)合速度越快，時(shí)間越短）k1,v1R+LRLk2,v2KD=K2/K1=RL/RL圖1KD對(duì)飽和曲線(xiàn)的影響飽和曲線(xiàn)曲線(xiàn)的高度取決于RT（如圖