綠色熒光蛋白標(biāo)記銅綠假單胞菌生物膜形成的動(dòng)態(tài)觀察及結(jié)構(gòu)定量分

1、綠色熒光卵白標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟銅綠假單胞菌生物膜形成的動(dòng)態(tài)不雅察及布局定量分陳波曼余加林劉官信胡琳燕李芳楊華【關(guān)鍵詞】生物膜；銅綠假單胞菌；定量闡發(fā)；布局KEYRDSBifil;Pseudnasaeruginsa;Quantitativeanalysis;Struture恒久以來，人們對(duì)細(xì)菌的熟悉停頓在浮游態(tài)程度上，但天然界中99%的細(xì)菌以生物膜(bifil，BF)的情勢(shì)存在。細(xì)菌BF是細(xì)菌為順應(yīng)保存環(huán)境黏附惰性或活性子料外貌形成的一種與浮游細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)方法，具有環(huán)境順應(yīng)本領(lǐng)更強(qiáng)，對(duì)抗吞噬細(xì)胞作用，躲避宿主免疫，尤其耐藥性極強(qiáng)等生物學(xué)特性，而BF的很多特性均與其特別形態(tài)布局有關(guān)。銅綠假單胞菌(P

2、seudnasaeruginsa，Pa)是我國病院和社區(qū)得到性熏染及重癥監(jiān)護(hù)病房熏染的緊張條件致病菌，比年來研究證實(shí)，該菌極易形成BF1，臨床上，有BF表型的Pa每每引起難以治愈的嚴(yán)峻熏染。以往研究多接納光鏡、掃描或透射電鏡等不雅察細(xì)菌BF布局，但樣本在脫水、結(jié)實(shí)、染色等處置懲罰歷程中易產(chǎn)生布局扭曲及干系改變。本實(shí)行通過創(chuàng)立體外Pa1菌株BF模子，結(jié)合綠色熒光卵白(GFP)標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟技能，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡(nfallasersanningirspy，LS)攝取BF生長(zhǎng)成熟各階段差異層面的圖像，所獲圖片堆經(jīng)圖象布局闡發(fā)(iagestrutureanalyer，ISA)軟件闡發(fā)，得到PA1菌

3、株BF生長(zhǎng)歷程相干空間布局變革的數(shù)據(jù)，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌BF的無損傷不雅察，并對(duì)BF空間布局的定量化闡發(fā)舉行了開端探究。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1試劑和菌株銅綠假單胞菌PA1菌株(本實(shí)行室保存)，pGFPuv質(zhì)粒(lnteh公司)，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(日本BiFlux公司)，限定型內(nèi)切酶ERI和HindIII(寶生物公司)，ISA軟件(美國ntana州立大學(xué)HalukBeyenal傳授提供)。(1)PA1菌株電感覺態(tài)制備參考單志英等2實(shí)行要領(lǐng)，將留宿增菌的PA1菌株轉(zhuǎn)接于50lSB造就基中，37，200r/in振蕩造就；A600值為0.7擺布時(shí)中斷造就；2，6000r/in離心15in；菌體沉淀依次

4、用等體積、1/2體積、1/5體積的0.3l/L冰浴蔗糖溶液重新懸浮，洗滌菌體；2，6000r/in離心15in，末了按照菌體幾多參加差異體積的0.3l/L蔗糖溶液將菌體混勻；分裝成每管100l，直接用于電轉(zhuǎn)化。1.2激光共聚焦顯微鏡不雅察氬激光(488n)引發(fā)，物鏡20，每個(gè)模子由外(BF游離的一面)向內(nèi)(BF和玻片相貼的一面)逐層掃描(沿Z軸掃描)，每個(gè)標(biāo)本掃描816張。1.3運(yùn)用ISA軟件對(duì)PA1菌株BF布局定量化闡發(fā)將上述得到的各時(shí)間組模子圖片堆調(diào)入ISA3D軟件，確認(rèn)圖片的完備性及挨次后運(yùn)行ISA及ISA3D下令，運(yùn)行效果包羅：布局參數(shù)：如布局熵(texturalentrpy，TE)、

5、布局能(energy，E)、均一性(hgeneity，H)；平面參數(shù)：地區(qū)孔率(arealprsity，AP)、均勻擴(kuò)散間隔(averagediffusindistane，ADD)、最大擴(kuò)散間隔(axiudiffusindistane，DD)等指標(biāo)；別的參數(shù)：如生物量(bivlue，BV)、比外貌積(surfaeareabeteenbiassandvid，SA)、單元面積生物膜體積(biassvluetsurfaearearati，V2SA)等3。輸出數(shù)據(jù)以EXEL格式保存。2效果2.1GFP標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的PA1菌株構(gòu)建與發(fā)光表型不雅察通過電轉(zhuǎn)化要領(lǐng)對(duì)PA1菌株舉行了pGFPuv標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟。

6、轉(zhuǎn)化菌株天然光下即可見綠色熒光，在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)綠色熒光；熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)化菌株菌體發(fā)出豁亮的綠色熒光，細(xì)菌形態(tài)呈短棒狀，提示pGFPuv已經(jīng)樂成轉(zhuǎn)入了PA1菌株中，該轉(zhuǎn)化菌株可以作為BF空間布局定量化闡發(fā)研究的形式菌。2.2轉(zhuǎn)化菌株質(zhì)粒提取斷定及雙酶切斷定轉(zhuǎn)化菌株抽提質(zhì)粒后，電泳效果表如今2000和3500bp之間有一條約3300bp帶，條帶與質(zhì)粒巨細(xì)符合。提取的質(zhì)粒舉行ERI和HindIII雙酶切，電泳表如今2000和3500bp之間有一條約2500bp帶，在500和1000bp之間有一條約800bp帶，與預(yù)期效果符合，提示pGFPuv已樂成轉(zhuǎn)入PA1菌株，并以游離質(zhì)粒情勢(shì)表達(dá)。2.3LS

7、不雅察GFP標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟BF模子6h擺布，PA1已經(jīng)在玻片上黏附聚攏，發(fā)出綠色熒光；1d組模子多為綠色熒光，細(xì)菌呈微菌落聚攏，已具有必然厚度；隨著時(shí)間延伸，BF變厚，3d組及6d組模子肉眼可見一層灰白色膜狀物平鋪于玻片上，鏡下可見大片狀BF，細(xì)菌麋集，層疊如積云狀，棉絮樣，具備龐大空間布局，細(xì)菌之間有很多非綠色的玄色地區(qū)，呈管道或泡狀。2.4ISA軟件布局定量化闡發(fā)3討論細(xì)菌BF是一個(gè)三維立體空間布局的生態(tài)系，是一個(gè)具有高度布局性、和諧性和成效性的構(gòu)造群體，BF布局的維持對(duì)BF生物學(xué)舉動(dòng)具有緊張意義。深化熟悉BF的布局特點(diǎn)，不克不及停頓在某一平面的形態(tài)形貌，還必要對(duì)BF的空間布局睜開定量化闡發(fā)

8、。由于報(bào)道基因中常用的綠色熒光卵白(GFP)的基因具有基因孝性子不變、對(duì)細(xì)胞寧靜等長(zhǎng)處，本實(shí)行運(yùn)用電轉(zhuǎn)化要領(lǐng)，樂成地將pGFPuv轉(zhuǎn)入PA1中，創(chuàng)立體外PA1菌株BF模子，運(yùn)用LS不雅察以包管細(xì)菌BF布局的完備性，一連檢測(cè)其在玻片外貌定植形成BF的歷程，結(jié)合盤算機(jī)圖像處置懲罰闡發(fā)體系，對(duì)BF布局舉行定量化闡發(fā)。BF形成生長(zhǎng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)歷程，生長(zhǎng)周期一樣平常分為5個(gè)階段：最初的定植階段、不成逆黏附階段、布局分化階段、生長(zhǎng)成熟階段息爭(zhēng)聚再定植階段4。本實(shí)行通過LS一連動(dòng)態(tài)不雅察PA1菌株BF形成，根本反響了如許一個(gè)歷程：6h擺布PA1菌株開始在玻片外貌黏附聚攏，1d擺布開端形成BF，3d時(shí)BF根本形

9、成，具備三維布局，今后BF漸漸生長(zhǎng)到達(dá)一個(gè)平衡，這與文獻(xiàn)報(bào)道根本同等5。隨著造就時(shí)間延伸，BF厚度漸漸增長(zhǎng)，但趨勢(shì)漸緩，大概與BF營(yíng)養(yǎng)滲出屏蔽有關(guān)。本實(shí)行還接納ISA軟件得到了BF空間布局參數(shù)的定量化數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)BF底子布局特性的定量化闡發(fā)。該軟件由美國ntana州立大學(xué)的生物膜工程中央2000年開拓，接納主動(dòng)定閾體系6，低落了圖片處置懲罰中主不雅因素的影響，對(duì)BF的二維和三維布局舉行更多參數(shù)的測(cè)定和比力。ISA提供厚度參數(shù)表現(xiàn)，GFP標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的BF模子均勻厚度在前3d內(nèi)增長(zhǎng)速率顯著快于后3d，提示BF生長(zhǎng)速率的不均一性。細(xì)菌黏附后初期，BF敏捷增厚，但隨著時(shí)間延伸，BF厚度增長(zhǎng)趨勢(shì)減慢

10、，其緣故原由除與營(yíng)養(yǎng)限定有關(guān)外，也大概是BF增長(zhǎng)到必然厚度后，為包管底層細(xì)菌得到必然的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而維持自身布局，對(duì)自身發(fā)出密度感到(qurusensing，QS)信號(hào)產(chǎn)生反響，到達(dá)平衡狀態(tài)。本實(shí)行對(duì)BF的不雅察中還創(chuàng)造BF并非一層單純的致密膜，其內(nèi)部存在很多玄色彼此交通的間隙及孔道，Stdley等7以為這些大、小不一的間隙和通道是BF布局的緊張構(gòu)成部門，此中布滿了胞外多糖和卵白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與深層BF中的細(xì)菌生長(zhǎng)干系嚴(yán)密。d等8在牙菌斑BF也創(chuàng)造雷同的間隙和通道貫串于整個(gè)BF之中，其成效雷同低級(jí)循環(huán)體系，活菌牢牢圍繞在這些孔和通道的四周，包管營(yíng)養(yǎng)的獵取和去除代謝廢物。別的，BF還可以借這些通道來

11、感知QS信號(hào)。BF這種布局特點(diǎn)決定BF具有一個(gè)能順應(yīng)多種理化變革的內(nèi)環(huán)境。ISA軟件通過地區(qū)孔率(AP)寧靜均擴(kuò)散間隔(ADD)這兩個(gè)參數(shù)，客不雅反響B(tài)F布局生長(zhǎng)歷程中央隙孔道及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給間隔變革。本實(shí)行創(chuàng)造隨著造就時(shí)間延伸，BF厚度漸漸增長(zhǎng)，AP漸漸減低，ADD漸漸增長(zhǎng)，提示BF漸漸生長(zhǎng)，細(xì)菌聚攏越來越致密，BF布局中央隙及通道的孔徑和數(shù)量淘汰，相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給間隔增長(zhǎng)，細(xì)菌物質(zhì)代謝受到必然限定而將漸漸生長(zhǎng)到達(dá)一個(gè)相對(duì)穩(wěn)態(tài)。BF不但在布局上存在多樣、開放、不均一性特點(diǎn)，并且環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、信號(hào)分子等物質(zhì)在BF各個(gè)層面也出現(xiàn)不均一性，使得各層BF菌生理活性及耐藥程度也表示出不均一

12、性，終極操縱了BF的生長(zhǎng)成熟和團(tuán)體生物學(xué)舉動(dòng)。這種不均一性大概是BF的“庇護(hù)效應(yīng)(insuraneeffets)，是細(xì)菌保存的緊張計(jì)謀9，它使BF無論受到作用于阿誰代謝環(huán)節(jié)的抗微生物因子的打擊，都市有一些細(xì)菌存活“重修故里。ISA軟件通過TE參數(shù)反響了BF布局生長(zhǎng)歷程中這種不均一性的變革。實(shí)行效果表現(xiàn)隨著造就時(shí)間延伸，TE值漸漸增大，說明在必然范疇內(nèi)，陪同BF生長(zhǎng)成熟，BF的不均一度愈來愈強(qiáng)，布局越來越龐大，對(duì)外界環(huán)境變革的對(duì)抗本領(lǐng)也增強(qiáng)。ISA軟件具有較強(qiáng)的闡發(fā)成效，按照美國ntana州立大門生物膜工程中央的研究積聚創(chuàng)造，平面參數(shù)中以AP、ADD最有有用代價(jià)，這兩個(gè)參數(shù)能直不雅地形貌BF的布局特點(diǎn)及營(yíng)養(yǎng)供給環(huán)境；而布局參數(shù)中以TE最有有用代價(jià)，可用于差異BF的比力闡發(fā)。ISA還能提供FD、DD、AVRL、AHRL、E、H等參數(shù)，但是它們與BF生長(zhǎng)的埋伏干系尚不明白，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證10。本實(shí)行還使用LS的三維重立成效對(duì)部門模子舉行了三維重修，得到了PA1菌株BF的三維立體圖像，圖像反響B(tài)F是一個(gè)多樣，開放、不均一的布局，與ISA軟件闡發(fā)效果同等。必要說明，外源基因表達(dá)卵白質(zhì)，需斲喪宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物、能量及相干酶等，是宿主細(xì)胞的分外負(fù)組，可導(dǎo)致重組質(zhì)粒不變性低落11，而BF中底層細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最差，大概影響了GFP的充實(shí)表達(dá)