脾腎虛型重癥肌無力患者血清雙向電泳圖譜的建立及分析

1、脾腎虛型重癥肌無力患者血清雙向電泳圖譜的建立及分析【摘要】建立脾腎虛型重癥肌無力患者血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，觀察脾腎虛型重癥肌無力患者與正常人血清蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況。方法:采用反復(fù)凍融法抽提血清蛋白質(zhì)，以優(yōu)化的雙向電泳技術(shù)別離血清蛋白質(zhì)，建立脾腎虛型重癥肌無力患者與正常人血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，并采用二維電泳圖譜專用軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)展圖譜分析。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)兩組間比擬所得目的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)展質(zhì)譜鑒定。結(jié)果:通過雙向電泳，建立血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，選取具有明顯差異的蛋白點(diǎn)21個(gè)進(jìn)展質(zhì)譜鑒定，共鑒定出8種蛋白質(zhì)。結(jié)論:通過蛋白質(zhì)組技術(shù)快速建立脾腎虛型重癥肌無力患者血清蛋白

2、表達(dá)圖譜及質(zhì)譜分析，可為進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制及治療手段提供實(shí)驗(yàn)基矗【關(guān)鍵詞】重癥肌無力;蛋白質(zhì)組;電泳;乙酰膽堿受體重癥肌無力yastheniagravis，G主要是由乙酰膽堿受體aetylhlinereeptr，AhR抗體介導(dǎo)的，補(bǔ)體參與，細(xì)胞免疫依賴性，針對(duì)神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體的自身免疫性疾玻對(duì)于G的治療至今仍缺乏有效手段。蛋白質(zhì)組技術(shù)利用其核心技術(shù)雙向電泳t-dien-sinalgeleletrphresis，2-DE對(duì)組織或細(xì)胞總蛋白質(zhì)進(jìn)展別離1，并通過正常與疾病組織的差異表達(dá)蛋白比擬，找到與該疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)分子。本研究通過建立脾腎虛型重癥肌無力患者和正常人血清總蛋白

3、質(zhì)的雙向電泳圖譜，尋找有明顯差異性表達(dá)的蛋白，對(duì)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)展鑒定和研究，為進(jìn)一步研究G發(fā)病機(jī)制以及G診斷治療提供實(shí)驗(yàn)基矗1材料與方法1.1血清采集G患者全血來自20222022年就診于遼寧中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的門診患者。根據(jù)典型臨床表現(xiàn)、新斯的明試驗(yàn)、低頻重復(fù)電刺激及單纖維肌電圖等確診，無其他自身免疫性疾病，未經(jīng)其他免疫抑制治療，并參照1994年版?中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)?辨證為脾腎虛型。正常人血清取自同時(shí)期安康志愿者。-70冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?.2主要試劑固相pH梯度干膠條IPGstripAersha公司產(chǎn)品，非線性pH310，7。3-3-膽酰胺基丙基二甲氨基丙磺酸鹽3-3-hlaidprp

4、yldiethylain-1-prpanesul-fnate，HAPS，二硫蘇糖醇DL-dithithrEitl，DTT，三丁基膦tributylphsphine，TBP，尿素，硫脲，碘乙酰胺idaetaide，IAA，丙烯酰胺arylaide、甲雙丙烯酰胺N，N-ethylenebi-sarylaide，四甲基乙二胺N，N，N，N-tetra-ethyl-ethylenediaine，TEED，過硫酰胺a-niupersulfate，APS，三羥甲基氨基甲烷trishydrxyethylainethane、甘氨酸glyine，Gly和十二烷基磺酸鈉sdiuddeylsulfate，SDS均為

5、Bi-Rad公司產(chǎn)品。瓊脂糖為華美生物公司產(chǎn)品。其他試劑均使用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。所有溶液均用illiQ水配制。1.3主要儀器高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendrf公司產(chǎn)品;EttanTIPGphr，AershaBisi-enes公司產(chǎn)品;P-2000分光光度儀，Hitahi公司產(chǎn)品;SE-600電泳儀，Aersha公司產(chǎn)品;純水裝置，illipre公司產(chǎn)品;GS-710光密度掃描儀，Bi-Rad公司產(chǎn)品;冷卻水循環(huán)系統(tǒng)，le-Parer公司產(chǎn)品;Bruker-DaltnisAutFlexTF-TFLIFTassSpetreter，美國(guó)Bruker-Daltnis公司產(chǎn)品;LQDeaXPPlus，美

6、國(guó)TherFinnigan公司產(chǎn)品。1.4雙向電泳1.4.1血清總蛋白質(zhì)的提取及定量血清-70反復(fù)凍融4次后，用AgilentultipleAffinityRe-vallun處理去除高豐度蛋白。使用Agilent5K超濾管進(jìn)展?jié)饪s除鹽，凍干回收的樣品，-70保存。用裂解液9l/L尿素、4%HAPS、65l/LDTT和ktail酶抑制劑進(jìn)展復(fù)溶，并采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)展蛋白質(zhì)定量。1.4.2等電聚焦自-20取出的膠條，室溫下平衡10in，以500g上樣量在每份樣本中參加上樣緩沖液8l/L尿素、2%HAPS、1%Bi-lyte和1%TBP以及標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子，上樣于泡脹槽中，參加礦物油覆蓋。程序設(shè)置如

7、下:30V12h，500V1h，1000V1h，8000V6h。恒溫20。等電聚焦電泳后IPG膠條在平衡液1Tris-base50l/L、尿素6l/L、甘油30%、SDS2%、溴酚藍(lán)0.002%和DTT100g中于振蕩器上振蕩15in;然后置入平衡液2成分同平衡液1，用400g碘乙酰胺代替100gDTT同樣于振蕩器上振蕩15in。1.4.3SDS垂直電泳采用12.5%的均勻SDS2聚丙烯酰胺凝膠水23.2l，30%丙烯酰胺溶液32.46l，1.5l/LTris-Hl緩沖液pH8.820l，10%SDS0.8l，10%APS0.4l，TEED3.76l，膠總體積80l。將平衡后的IPG膠條移至凝

8、膠的上方，膠條一端放入低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，0.5%的瓊脂糖封膠。上下槽參加電極緩沖液Tris5l/L，Gly192l/L和SDS0.1%。初始電流為每塊膠40A，電泳20in，然后以每塊膠60A電流，直至溴酚藍(lán)前沿。1.4.4銀染色電泳完畢后，采用硝酸銀染色法，通過固定，硝酸銀染色，顯影，停顯及脫色，至背景明晰。1.5圖像分析每個(gè)樣品常規(guī)進(jìn)展3次二維電泳，用GS-710光密度掃描儀對(duì)電泳后的膠圖分別進(jìn)展掃描，所得掃描圖像輸入計(jì)算機(jī)，采用Iage-aster軟件對(duì)圖像進(jìn)展背景消減、蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測(cè)和校正，獲取蛋白質(zhì)點(diǎn)的位置坐標(biāo)和表達(dá)量等分析。選取Rati1.5的蛋白質(zhì)點(diǎn)認(rèn)為有差異。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

9、均采用SPSS12.0軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。1.6基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析用手術(shù)刀片切下膠上目的條帶，進(jìn)展切膠、膠上胰蛋白酶酶解20h，抽提酶解肽段，ZipTip脫鹽后點(diǎn)樣，行基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜atrixassistedlaserdesrptin/inizatintiefflightassspetretry，ALDI-TF-S分析飛行管長(zhǎng)2.7，加速電壓20kV，反射電壓23kV。將第1級(jí)質(zhì)譜得到的肽片段質(zhì)量指紋圖譜、肽質(zhì)量指紋圖譜與第2級(jí)質(zhì)譜得到的肽序列信息一起用來檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，找出匹配的蛋白質(zhì)。1.7數(shù)據(jù)庫(kù)檢索將質(zhì)譜鑒定所得的肽質(zhì)量指紋譜peptid

10、eassfingerprinting，PF數(shù)據(jù)于Bi-rksTherFinnigan，SanJse，A軟件搜索相應(yīng)的庫(kù)。搜索使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為IPIhuan蛋白庫(kù)SEQUEST結(jié)果過濾參數(shù)為:當(dāng)harge+1，Xrr1.9;當(dāng)harge+2，Xrr2.2;當(dāng)harge+3，Xrr3.75;其中DelN0.1以及NBI上Hsapiens的非冗余蛋白庫(kù)redundantdata-base。檢索參數(shù)為胰蛋白酶解;氨基酸固定修飾方式為脲甲基半胱氨酸;形式為單同位素峰;肽片斷最大誤差控制在100pp;肽片斷最大分子量誤差為0.5Da;每個(gè)肽允許有1個(gè)不完全裂解位點(diǎn)。2結(jié)果2.1脾腎虛型重癥肌無力患者血清雙向

11、電泳圖譜的建立及分析經(jīng)2-DE技術(shù)及銀染色后，得到了兩組血清的雙向凝膠電泳圖，并于一樣的條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。在正常對(duì)照組細(xì)胞蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜上可觀察到1463179個(gè)蛋白點(diǎn)，而脾腎虛型重癥肌無力組可見到150889個(gè)蛋白點(diǎn)。見圖13。2.2差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定和功能分析通過對(duì)2-DE凝膠上差異表達(dá)的21個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)展切割，用胰蛋白酶消化后進(jìn)展ALDI-TF-S檢測(cè)。21個(gè)點(diǎn)中獲得了13張PF圖4，另有8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)未獲得PF。將查詢到的結(jié)果再結(jié)合2-DE圖譜上相應(yīng)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和PI值等進(jìn)展綜合分析，在獲得的13張PF數(shù)據(jù)中有5個(gè)無可信搜索結(jié)果。在數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配到符合結(jié)果要求的蛋白質(zhì)有8個(gè)。

12、本次檢測(cè)的8個(gè)質(zhì)點(diǎn)在脾腎虛型重癥肌無力患者血清圖譜中表達(dá)均增加，且差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鑒定的8個(gè)質(zhì)點(diǎn)分別為:載脂蛋白A-I1382號(hào)及1438號(hào)質(zhì)點(diǎn)、白蛋白、胎球蛋白B的前體、載脂蛋白E的前體、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白前體、泰素耐藥相關(guān)基因-3和前血清淀粉樣蛋白P成分。這些蛋白分布廣泛，并具有重要生物學(xué)功能。見表1和2。圖1正常人血清雙向電泳圖譜略Figure1T-diensinaleletrphresisapfnralpersnsseru圖2脾腎虛型重癥肌無力患者血清雙向電泳圖譜略Figure2T-diensinaleletrphresisapfGpatientsseru圖3正常人和脾腎虛型重癥肌無力

13、患者血清蛋白差異性比擬部分放大圖略Figure3AugentedfigurefdifferentiallyexpressedprtEinsparisnbeteenGgrupandnralgrup圖4772號(hào)樣品肽指紋圖譜略Figure4PeptideassfingerprintingfSaple772表1通過ALDI-TF-S質(zhì)譜IPIhuan蛋白庫(kù)搜索情況列表略Table1DifferentiallyexpressedprteinsbeteenGpatientsandnralpersnsidentifiedby2-DEandALDI-TF-SrESI-SanalysisfIPIhuan表2通

14、過ALDI-TF-S質(zhì)譜NBI非冗余蛋白庫(kù)搜索情況列表略Table2DifferentiallyexpressedprteinsbeteenGpatientsandnralpersnsidentifiedby2-DEandALDI-TF-SrESI-SanalysisfNBI3討論免疫功能調(diào)節(jié)異常是重癥肌無力重要發(fā)病機(jī)制之一?，F(xiàn)已證實(shí)，AhR-ab阻滯降解突觸后膜受體，使自身抗原主要為煙堿型乙酰膽堿受體活性降低，突觸后膜外表積減少，神經(jīng)-肌肉接頭傳遞障礙，出現(xiàn)肌無力病癥，T細(xì)胞在該免疫應(yīng)答過程中起關(guān)鍵作用2，3。90%以上病人血清中可檢出AhR-ab4。AhR-ab已成為最重要的G實(shí)驗(yàn)室診斷檢

15、測(cè)指標(biāo)。該疾病與遺傳也有親密關(guān)系。重癥肌無力需要長(zhǎng)期治療，且藥物毒副作用大5。重癥肌無力屬中醫(yī)“瘺證范疇，是以眼瞼下垂，四肢軟弱無力，晨輕暮重，漸進(jìn)性加重或伴有吞咽困難、構(gòu)音不清為特征的疾玻其根本病機(jī)是脾腎虧虛。蛋白質(zhì)組技術(shù)包括蛋白別離技術(shù)和鑒定技術(shù)，也即主要通過2-DE或二維液相色譜分析等蛋白質(zhì)別離技術(shù)，建立蛋白質(zhì)組圖譜，并應(yīng)用外表增強(qiáng)激光解吸電離或基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜技術(shù)，并結(jié)合飛行時(shí)間-質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)展質(zhì)譜分析鑒定。雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)68。2-DE技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于它可以對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分進(jìn)展整體性分析，從而可以分析不同生理和病理?xiàng)l件

16、下蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化。本研究通過雙向電泳技術(shù)，成功建立了脾腎虛型重癥肌無力患者血清2-DE圖譜。其中在正常對(duì)照組細(xì)胞蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜上觀察到了1463179個(gè)蛋白點(diǎn)，而重癥肌無力組共觀察到150889個(gè)蛋白點(diǎn)。PF是對(duì)蛋白酶解或降解后所得到的多肽片段質(zhì)量圖譜。對(duì)質(zhì)譜分析所得肽片與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)的理論肽片進(jìn)展比擬，從而判別所測(cè)蛋白是還是未知，并在一定質(zhì)量誤差范圍內(nèi)記錄每個(gè)蛋白質(zhì)肽質(zhì)量理論值與樣品蛋白質(zhì)肽質(zhì)量測(cè)定值相符的數(shù)目，理論值與測(cè)定值相符數(shù)量最多的蛋白質(zhì)即可能為需鑒定的樣品蛋白質(zhì)。由于不同的蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸序列，因此不同蛋白質(zhì)所得肽片具有指紋的特征。應(yīng)用肽質(zhì)指紋數(shù)據(jù)進(jìn)展數(shù)據(jù)

17、庫(kù)搜索是PF分析蛋白質(zhì)的最后一步，本研究所鑒定的21個(gè)點(diǎn)中共獲得了13張肽質(zhì)量指紋圖譜，并在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)蛋白進(jìn)展了檢索。本研究初步鑒定的蛋白質(zhì)點(diǎn)中，在數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配到符合結(jié)果要求的蛋白質(zhì)有8個(gè)。這8個(gè)點(diǎn)在重癥肌無力患者血清圖譜中表達(dá)均增加。詳細(xì)而言，脾腎虛型重癥肌無力患者載脂蛋白A-I、載脂蛋白E的前體蛋白、白蛋白、胎球蛋白B的前體、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白前體、泰素耐藥相關(guān)基因-3和前血清淀粉樣蛋白P成分均明顯高于正常人。這些蛋白大都與物質(zhì)代謝相關(guān)，能促進(jìn)肌肉淀粉樣變。1587號(hào)轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白是含4個(gè)一樣子單元的四聚體，在單體的情況下可形成淀粉樣纖維，造成組織纖維化，并最終導(dǎo)致肌無力及肌萎縮;其主要在人體

18、的肝臟中合成，通常形成致病的類淀粉沉積。其中1401號(hào)樣品為前血清淀粉樣蛋白Ppre-seruaylidP，pre-SAP成分。SAP是一種人類免疫系統(tǒng)的重要蛋白9，廣泛存在于淀粉類物質(zhì)中，被認(rèn)為與慢性炎癥和自身免疫疾病相關(guān)。與鑒定的958號(hào)樣品匹配的為泰素耐藥相關(guān)基因-3taxlresistantassiatedgene-3，TRAG-3。TRAG-3是Duan等10在尋找泰素耐藥基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的T抗原，其編碼的蛋白屬于腫瘤/睪丸抗原家族成員。TRAG-3是一個(gè)與腫瘤相關(guān)的抗原，被作為一個(gè)免疫治療的靶標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，TRAG-3細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位負(fù)載樹突狀細(xì)胞疫苗在體外可以有效激發(fā)抗

19、瘤細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的免疫反響11。本研究提示，這些基因或蛋白質(zhì)還可能與重癥肌無力發(fā)病的免疫機(jī)制相關(guān)，但尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。重癥肌無力是一與免疫相關(guān)的疾病，其發(fā)病的詳細(xì)分子機(jī)制尚不十清楚確。本研究通過雙向電泳及質(zhì)譜分析技術(shù)，對(duì)照正常組，鑒定了8個(gè)差異表達(dá)蛋白，這為進(jìn)一步研究該疾病的分子機(jī)制提供了基矗4致謝感謝龍華醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)室及中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院蛋白質(zhì)組研究分析中心?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1HanashS.Diseaseprteis.Nature.2022;4226928:226-232.2LanRY，AnsariAA，LianZX，etal.RegulatryTells:develpent，funt

20、inandrleinautiunity.AutiunRev.2022;46:351-363.3InadaK，kuura，ShinH，etal.Rlefpsitiveseletinfthya-assiatedTellsinthepathgenesisfyastheniagravis.JSurgRes.2022;1261:34-40.4daK，ShibasakiH.yastheniagravis:antibdiestextraellularlyexpsedantigenideterinantsfaetyl-hlinereeptr.Neurlgy.1986;3610:1374-1377.5SiebJP.yastheniagravis:eergingnetherapyp-tins.urrpinPharal.2022;53:303-307.6asingerV，rdellSJ，erpa-PljakA，eta1.Pr-gressithgene-prdutappingfthelliutes:y-plasagitaliu.Eletrphresis.1995;167:1090-1094.7PetriinEF，ZnK，KhnE，etal.linialpr-tei