DNA體外合成與序列測定

1、DNA體外合成與序列測定DNA體外合成與序列測定1. 合成的原理核酸固相合成的基本原理是將所要合成的核酸鏈的末端核苷酸先固定在一種不溶性高分子固相載體上，然后再從此末端開始將其他核苷酸按順序逐一接長。每接長一個核苷酸殘基則經(jīng)歷一輪相同的操作，由于接長的核酸鏈始終被固定在固相載體上，所以過量的未反應物或反應副產(chǎn)物可通過過濾或洗滌的方法除去。合成至所需長度后的核酸鏈可從固相載體上切割下來并脫去各種保護基，再經(jīng)純化即可得到最終產(chǎn)物。 石河子大學生命科學學院1. 合成的原理石河子大學生命科學學院DNA的化學合成合成的原理 核酸固相磷酰亞胺法合成時，末端核苷酸的3-OH與固相載體成共價鍵，5-OH被4，

2、4-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保護，下一個核苷酸的5-OH亦被DMTr保護，3-OH上的磷酸基上有 -N(C3H7)2和-OCH3兩個基團。2022/9/213石河子大學生命科學學院DNA的化學合成2022/9/215石河子大學生命科學學院2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院4每延伸一個核苷酸需四步化學反應：(1) 脫三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脫去，游離出5-OH 。(2) 縮合：新生成的5-OH 在四唑催化下與下一個核苷3-磷酰亞胺單體縮合使鏈增長。(3) 蓋帽：有少量(小于0.5%)未縮合的5-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙?；忾]，

3、以防進一步縮合造成錯誤延伸。(4) 氧化：新增核苷酸鏈中的磷為三價亞磷，需用碘氧化成五價磷。上述步驟循環(huán)一次，核苷酸鏈向5方向延伸一個核苷酸。石河子大學生命科學學院2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院6每延伸一個核苷DNA的化學合成2. 合成后處理合成后的寡核苷酸鏈仍結合在固相載體上，且各種活潑基團也被保護基封閉著，要經(jīng)過以下合成后處理才能最后應用。切割：合成的寡核苷酸鏈仍共價結合于固相載體上，用濃氨水可將其切割下來。切割后的寡核苷酸具有游離的3-OH。脫保護：切割后的寡核苷酸磷酸基及堿基上仍有一些保護基，這些保護基也必須完全脫去。磷酸基的保護基-氰乙基在切割的同時即可脫掉，而堿基上的

4、保護基苯甲?；彤惗□；鶆t要在濃氨水中55放置15h左右方能脫掉。純化：純化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，鹽及各種保護基等雜質。通常采用的純化方法有電泳法、高效液相色譜法和高效薄層色譜法等。純化這一步操作是可以選擇的，對要求不高的應用如PCR等可不純化。近年來發(fā)展了一些修飾試劑，可在合成寡核苷酸時，對某些核苷酸進行一定的修飾，為寡核苷酸探針的非放射性標記提供了新途徑。 2022/9/215石河子大學生命科學學院DNA的化學合成2022/9/217石河子大學生命科學學院第二節(jié) DNA的體外合成聚合酶鏈式反應（PCR）聚合酶鏈式反應是上世紀80年代發(fā)展起來的一種體外快速擴增特異DNA序列的技術

5、。此技術于1985年由Mullis發(fā)明，1988年耐熱TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)令該技術使用更加方便、有效。PCR可以說是20世紀核酸分子生物學研究領域的最重大發(fā)明之一，這不僅表現(xiàn)在該方法本身的簡單和巧妙，而且還表現(xiàn)在它的出現(xiàn)高速發(fā)展了大量在以前看來似乎不可能的生物學技術。Mullis因其卓越的貢獻而獲1993年的諾貝爾化學獎。2022/9/216南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院石河子大學生命科學學院第二節(jié) DNA的體外合成聚合酶鏈式反應（PCR）2022/聚合酶鏈式反應（PCR）PCR的原理：原理類似于DNA的天然復制過程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存

6、在的條件下，由耐熱的TaqDNA聚合酶催化DNA的復制，合成靶DNA。PCR包括三個基本過程：變性。加熱模板使其解離成單鏈。退火。降低溫度使人工合成的寡核苷酸引物與模板 DNA 中所要擴增的靶序列的兩側按堿基配對原則相結合。延伸。在適宜條件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3端向前延伸，合成與模板堿基完全互補的DNA鏈。這樣變性、退火和延伸構成一個循環(huán)，每一次循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過3035個循環(huán)后，界于兩個引物之間的靶序列得到大量復制，拷貝數(shù)約增加106107倍。2022/9/217石河子大學生命科學學院聚合酶鏈式反應（PCR）2022/9/219石河子大學生命科2022

7、/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院8石河子大學生命科學學院2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院10石河子大學生核酸序列測定DNA測序是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA測序則通常將RNA提取后，反轉錄為DNA后使用DNA測序的方法進行測序。在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前應用最廣泛的是：Sanger雙脫氧鏈終止法。Maxam-Gilbert DNA化學降解法。新技術：雜交測序法， 質譜法， 單分子測序法， 原子探針顯微鏡測序法，DNA 芯片法 。2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院9石河子大學生命科學學院核酸

8、序列測定DNA測序是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就Sanger雙脫氧鏈終止法60年代末就已掌握了充分的理論知識，只是當時在某些技術能力上和研究思路上，存在著弱點，阻礙了從理論轉變?yōu)楝F(xiàn)實。第一，如何分離寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都沒有擺脫蛋白質序列分析的束縛。1965，Cornall大學以SWHolle，為首的科學家小組，首次完成75個核苷酸的酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定。即利用各種RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，經(jīng)分離純化后，再分別測定短片段順序。返回DNA核酸序列分析歷程石河子大學生命科學學院Sanger雙脫氧鏈終止法60年代末就已掌握了充分的理論知識Sanger雙脫氧鏈

9、終止法原理利用DNA聚合酶的兩種酶催反應特性：1、利用單鏈DNA模板，合成DNA互補鏈；2、利用2，3雙脫氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核酸鏈的末端，從而終止DNA鏈的生長。有時也稱引物合成法，或酶催引物合成法。石河子大學生命科學學院Sanger雙脫氧鏈終止法原理利用DNA聚合酶的兩種酶催反應核酸序列測定Sanger雙脫氧鏈終止法基本原理：在模板指導下，DNA聚合酶不斷將dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延長，合成出新的互補的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于雙脫氧核糖的3位置上缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5-引物端和以ddN

10、MP殘基為3端結尾的一系列長短不一片段的混合物。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸單鏈DNA，從而讀取DNA核苷酸序列。2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院12石河子大學生命科學學院核酸序列測定Sanger雙脫氧鏈終止法2022/9/21南京反應：同時加入引物和模板、DNA聚合酶1、一種ddNTP、以及 四種dNTP（有一種帶放射性標記）。變性膠電泳分離反應混合物。放射自顯影術，檢測單鏈DNA片段的放射性帶。結果判讀，從放射性X光底片上，直接讀出DNA的核酸順序?？伎寄悖悍磻旌衔镏?，標記什么最方便？石河子大學生命科學學院反應：

11、同時加入引物和模板、DNA聚合酶1、一種ddNTP、以Sanger雙脫氧鏈終止法基本原理：測序所用的ddNTPddNTPs 是反應終止劑，可以當作正常堿基參與復制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs（一般1：34）。2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院14在自動測序中將熒光素連在4種ddNTP上石河子大學生命科學學院Sanger雙脫氧鏈終止法2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生Sanger雙脫氧鏈終止法基本步驟：測序模板的純化與定量測序反應PCR儀測序反應產(chǎn)物純化與變性上樣電泳測序儀分析結果2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院15

12、石河子大學生命科學學院Sanger雙脫氧鏈終止法2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生2022/9/2116南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院石河子大學生命科學學院2022/9/2118南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院石河子大學生2022/9/2117南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院毛細管電泳熒光檢測石河子大學生命科學學院2022/9/2119南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院毛細管電泳石Sanger雙脫氧鏈終止法測序結果：2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院18石河子大學生命科學學院Sanger雙脫氧鏈終止法2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生DNA測序儀的多種應用：2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院19石

13、河子大學生命科學學院DNA測序儀的多種應用：2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命Sanger雙脫氧-M13體系 DNA序列分析法引物合成DNA序列測定法的特點及缺陷分析：這樣處理后，能策得高分子量DNA嗎？為了將這些降解的DNA片段，按其原來的順序“拼排”起來，至少還需要用一種或數(shù)種其它內切限制酶，對同種DNA作酶切消化，并進行電泳純化和序列分析。實際上可行嗎？高分子量DNA分子消化降解成一組具一定長度的限制片段，然后再用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠作電泳分離純化，從膠中抽取DNA片段，供進一步分析。石河子大學生命科學學院Sanger雙脫氧-M13體系 DNA序列分析法引物合成DN這些供作序列測

14、定的DNA片段絕大多數(shù)都僅為數(shù)百個核酸。因此需要用物理方法分離大量的DNA片段。費時費錢，因為商品提供的核酸內切限制酶的價格是十分昂貴。為了保證能夠獲得所有的限制片段，就需要制備足多數(shù)量的DNA，而其中有許多步驟都要用不同濃度的凝膠進行電泳再純化。在這種純化過程中，會加劇DNA的損傷和丟失。石河子大學生命科學學院這些供作序列測定的DNA片段絕大多數(shù)都僅為數(shù)百個核酸。因此需克服缺點的一種途徑DNA分子克隆將不同限制酶消化切割的DNA限制片段，隨機地克隆到載體分子上。選用天然的單鏈 DNA噬菌體，例如 M13作為載體，重組體噬菌體的DNA分子，可直接用作模板。引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是從親

15、本單鏈噬菌體DNA中分離出來的一種限制片段。其特點是能夠特異性地同載體分子上與克隆位點相連的單鏈DNA區(qū)段雜交。稱做“通用引物” 。石河子大學生命科學學院克服缺點的一種途徑DNA分子克隆將不同限制酶消化切割的DNM13載體克隆DNA片段將DNA片段克隆在M13mp載體特定位點上，即位于 Lac區(qū)段中含有多克隆位點的多聚銜接物（polylinker）內。重組體噬菌體，在含有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上形成白色的噬菌斑，而非重組體的噬菌體則形成藍色的噬菌斑。從白色的噬菌班中分離重組體噬菌體，并制備出單鏈DNA，就可以直接按雙脫氧鏈終止法進行序列分析。石河子大學生命科學學院M13載體克隆DNA片

16、段將DNA片段克隆在M13mp載體特定當然這種隨機的方法，也需要通過順序的測定將派生的序列拼連起來，恢復成原來結構形式的總DNA序列。石河子大學生命科學學院當然這種隨機的方法，也需要通過順序的測定將派生的序列拼連起來熒光標記物ddGTPddATPddTTPddCTP石河子大學生命科學學院熒光標記物ddGTPddATPddTTPddCTP石河子大學聚合反應及產(chǎn)物OH 3P 55PHODNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP5PddATPddGTP5PddTTP5PddCTP5P石河子大學生命科學學院聚合反應及產(chǎn)物OH 3P 55PHODNA聚合

17、酶，dA單泳道電泳及信號收集正極負極石河子大學生命科學學院單泳道電泳及信號收集正極負極石河子大學生命科學學院核酸序列測定Maxam-Gilbert DNA化學降解法基本原理：在一個末端標記的DNA片段在幾組互相獨立的的化學反應分別得到部分降解，其中每一組反應特異地針對某一種或某一類堿基。因此生成一系列放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續(xù)到發(fā)生化學降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。鮮明特點是可以探測DNA構象中的蛋白質DNA相

18、互作用。2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院28石河子大學生命科學學院核酸序列測定Maxam-Gilbert DNA化學降解法20Maxam Gilbert化學修飾法的原理化學試劑處理末端標記DNA片段，堿基的特異性切割產(chǎn)生的DNA片段混合物,電泳分離顯影后顯現(xiàn)譜帶，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序。石河子大學生命科學學院Maxam Gilbert化學修飾法的原理化學試劑處理末端出發(fā)材料：局部消化的DNA分子群體中純化出特定的末端帶有放射性標記的DNA片段 (雙鏈或單鏈）關鍵：4種核苷酸堿基中，有12種發(fā)生特異性的化學切割僅應，包括堿基的修飾、修飾的堿基從其糖環(huán)上轉移出去以及在失去堿

19、基的部位發(fā)生DNA鏈的斷裂三個主要的內容。由于化學切割反應特異性是由堿基的修飾作用決定的，顯然，隨后的切割反應必定是定量的，而且同副反應無關。石河子大學生命科學學院出發(fā)材料：局部消化的DNA分子群體中純化出特定的末端帶有放射Maxam-Gilbert DNA化學降解法基本原理：2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院31石河子大學生命科學學院Maxam-Gilbert DNA化學降解法2022/9/2MaxamGilbert化學修飾法優(yōu)點不需要體外酶催合成反應單雙鏈都可以需要末端標記兩端采用不同的標記，測序可從兩端進行石河子大學生命科學學院MaxamGilbert化學修飾法優(yōu)點不需要體外酶

20、催合成反Maxam-Gilbert測序法的特異斷裂32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATSpecific Reaction to G 化學法無放射線片段不能顯像斷裂處斷裂處ATCGATCGAT石河子大學生命科學學院Maxam-Gilbert測序法的特異斷裂32P32PATCG反應： DMS使鳥嘌呤的7位氮原子甲基化，其后斷開第8位碳原子和第9位氮原子間的化學鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結合。 G+A反應： 甲酸使嘌呤環(huán)上的氮原子質子化，削弱了腺嘌呤脫氧核糖核苷酸和鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸中的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。 T+C反應： 肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生的堿基片段能被哌啶

21、所置換。 C反應： 在NaCl存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應，隨后被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。 石河子大學生命科學學院G反應： DMS使鳥嘌呤的7位氮原子甲基化，其后斷開第8位碳5PP 53HOOH 35HOOH 53HOOH 3532PP32 53HOOH 3532POH 3硫酸二甲酯甲酸肼肼NaClGG+AT+CC堿性磷酸單酯酶除去 5磷酸基 多核苷酸磷酸激酶-32P-ATP分離單鏈DNA分別在4個試管中進行特異斷裂石河子大學生命科學學院5PP 53HOOH 35HOOH 53HOOGG+AT+CC5 32P -GTCATGTGCTAG5 32P GTCATGTGCTA5 32P GTCAT

22、GTGCT5 32P GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCATGT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5 32P G斷裂產(chǎn)物分別在4個泳道電泳從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列石河子大學生命科學學院GG+AT+CC5 32P -GTCATGTGCTAG化學降解法與雙脫氧法的比較Maxam-Gilber化學降解法所能測定DNA序列的長度要比Sanger法短一些，通常說來，化學降解法對放射性標記末端250個核苷酸以內的DNA序列效果最佳。如今雙脫氧核苷酸末端終止法遠比Maxam-Gilbert化學降解法

23、應用得更為廣泛。但是，化學降解法具有一個Sanger 法所不具備的明顯優(yōu)點：即所測核酸序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應所產(chǎn)生的拷貝，因此，利用Maxam-Gilbert法可以對合成的寡核苷酸進行測序，分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，也可以通過化學保護及修飾干擾實驗來研究DNA二級結構及蛋白質與DNA的相互作用。然而，由于Sanger法的簡便快速，仍不失為現(xiàn)今DNA測序的最佳選擇方案。2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院37石河子大學生命科學學院化學降解法與雙脫氧法的比較2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生核酸序列測定基因組測序在大規(guī)模DNA測序中，目標DNA分子的長度可達上百萬個

24、bp?，F(xiàn)在還不能直接測定整個分子的序列，然而，可以得到待測序列的一系列序列片段。序列片段是DNA雙螺旋中的一條鏈的子序列（或子串）。這些序列片段覆蓋待測序列，并且序列片段之間也存在著相互覆蓋或者重疊。在一般情況下，對于一個特定的片段，我們不知道它是屬于正向鏈還是屬于反向鏈，也不知道該片段相對于起點的位置。另外，這樣的序列片段中還可能隱含錯誤的信息。序列片段的長度范圍3001000 bp，而目標序列的長度范圍是3100萬bp，總的片段數(shù)目可達上千個。DNA序列片段組裝（又稱序列拼接）的任務就是根據(jù)這些序列片段，重建目標DNA序列。如果能夠得到DNA一條鏈的序列，那么根據(jù)互補原則，另一條鏈的序列也

25、就得到了。2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院38石河子大學生命科學學院核酸序列測定基因組測序2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科基因組測序基因組的測序過程一般包括三個步驟：建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體YAC克隆、細菌人工染色體BAC克隆等；利用鳥槍法測定每個克隆的序列；序列拼裝和注釋：當?shù)玫揭欢蜠NA序列之后，可以利用序列分析工具，進行序列的拼接；繼而通過與數(shù)據(jù)庫序列的比較，得到與該序列相關的信息，進而對序列的生物學特性進行注釋。 2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院39鳥槍測序法：大分子DNA被隨機地“敲碎”成許多小片段，收集這些隨機小片段并將它們全部連接到合適的

26、測序載體；小片段測序完成后，根據(jù)重疊區(qū)計算機將小片段整合出大分子DNA序列。這就是所謂的鳥槍測序法。石河子大學生命科學學院基因組測序2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院41鳥基因組測序鳥槍法測序的缺點隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加，造成重復測定，也易丟失某些序列，且數(shù)據(jù)處理分析工作量大。高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復序列，導致判斷失誤。引物步移策略將待測DNA片斷克隆在質粒載體上，利用引物步移延伸，從DNA片斷的一端開始逐步進行序列測定，直至另一端為止?？朔锁B槍法的盲目性，并省去亞克隆制備步驟，也減輕了數(shù)據(jù)分析工作量。但由于測定下一段序列前要預先知道上游序列的堿基順序，才能合成適當?shù)囊镞M行測序。2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院40石河子大學生命科學學院基因組測序2022/9/21南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院42石序列分析的自動化石河子大學生命科學學院序列分析的自動化石河子大學生命科學學院DNA雜交測序原理石河子大學生命科學學院DNA雜交測序原理石河子大學生命科學學院石河子大學生命科學學院石河子大學生命科學學院雜交的檢測石河子大學生命科學學院雜交的檢測石河子大學生命科學學院雜交測序的應用檢測單堿基的變化序列比較分析基因的表達狀況驗證其他測序石河子大學生命科學學院雜交測序的應用檢測單堿基的變化石河子大學生命科