實(shí)驗(yàn)1細(xì)胞培養(yǎng)概述

1、 實(shí)驗(yàn)1細(xì)胞培養(yǎng)概述一）細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)置和無(wú)菌操作【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無(wú)菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。一般標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)室應(yīng)包括配液室、準(zhǔn)備室和培養(yǎng)室。三室既相互連接又相對(duì)獨(dú)立，各自完成培養(yǎng)過(guò)程中的不同操作?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私馀囵B(yǎng)室的設(shè)置和設(shè)備。學(xué)習(xí)無(wú)菌概念和無(wú)菌操作要領(lǐng)?！静僮鞑襟E】1實(shí)驗(yàn)室設(shè)置（1）配液室（2）準(zhǔn)備室（3）培養(yǎng)室培養(yǎng)室內(nèi)要完全密閉，保持恒定的溫度，在設(shè)計(jì)上要注意以下幾點(diǎn)：培養(yǎng)室的位置最好設(shè)在陰面，陽(yáng)光不能直接照射的地方，防止室內(nèi)溫度增高。天花板的高度不要超過(guò)2米，以保證紫外燈的有效殺菌效應(yīng)，門(mén)一般用拉門(mén)，以防止空氣流動(dòng)。

2、天花板、地板和四周墻壁要光滑無(wú)死角，要鑲瓷磚或涂油漆，這樣設(shè)計(jì)，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墻角堆積灰塵。2實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備（1）準(zhǔn)備室的設(shè)備雙蒸餾水蒸餾器：制備雙蒸水。酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。干燥箱：洗滌完的玻璃器皿用干燥箱烘干。高壓鍋：玻璃器皿、解剖用具、部分液體、塑料器具等滅菌。不同物品其有效滅菌壓力和時(shí)間不同。儲(chǔ)品柜1：放置未消毒物品。儲(chǔ)品柜2：放置已消毒物品。準(zhǔn)備室注意事項(xiàng)：預(yù)防蒸餾器被烤干。勿將酸液濺到衣物或地面。勿將高壓鍋排氣閥和安全閥堵塞。已消毒物品應(yīng)與未消毒物品分柜存放。（2）配液室的設(shè)備天平（扭力天平和電子天平）：稱(chēng)量用pH計(jì)。磁力攪拌器。（3）細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)備超凈工

3、作臺(tái)：超凈工作臺(tái)的種類(lèi)很多，有單面單人、單面雙人、雙面雙人或雙面四人等，其工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)，使通過(guò)高效濾氣的空氣，徐徐通過(guò)臺(tái)面，這樣使工作環(huán)境中具無(wú)菌而均勻的空氣。根據(jù)層流方式的不同，超凈工作臺(tái)主要分為水平層流式和垂直層流式兩種，基本原理大致相同，都是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過(guò)濾器初濾，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過(guò)濾器，由此送出的潔凈氣流從一定的均勻的斷面風(fēng)速通過(guò)無(wú)菌，從而形成無(wú)塵無(wú)菌的高潔凈度工作環(huán)境。但兩種凈化臺(tái)的氣流方向不同。使用超凈工作臺(tái)應(yīng)注意的幾點(diǎn)問(wèn)題：A凈化工作臺(tái)最好安裝在無(wú)塵的房間內(nèi)，最好為隔離好的無(wú)菌間內(nèi)，以免塵土過(guò)多易使濾器阻塞，降低凈化效果，縮短使用壽命。新安裝的或長(zhǎng)期未

4、使用的工用臺(tái)，工作前必須對(duì)工作臺(tái)和周?chē)h(huán)境用真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的工具進(jìn)行清潔工作，再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌法進(jìn)行滅菌處理。每次使用工作臺(tái)時(shí)，應(yīng)先用75%酒精擦洗臺(tái)面，并提前以3050min紫外線滅菌燈處理凈化工作區(qū)內(nèi)積累的微生物。在關(guān)閉紫外燈后應(yīng)啟動(dòng)送風(fēng)機(jī)使之運(yùn)轉(zhuǎn)兩分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作。D凈化工作區(qū)內(nèi)不應(yīng)存放不必要的物品，以保持潔凈氣流型不受干擾。般情況下，高效過(guò)濾器三年更換一次。更換高效濾器應(yīng)請(qǐng)專(zhuān)業(yè)人員操作，以保持密封良好。要定期將粗過(guò)濾器中的過(guò)布（無(wú)紡布）拆下清洗，時(shí)間應(yīng)根據(jù)環(huán)境潔凈程度而定，通常間隔36個(gè)月進(jìn)行一次。每次使用凈化臺(tái)要及時(shí)清除工作臺(tái)面上的物品，并用灑精擦洗臺(tái)面使之始

5、終保持潔凈。4C冰箱和低溫冰箱：CO2培養(yǎng)箱：A.定濃度的CO2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)，尤其是原代培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)有促進(jìn)作用（5%）。定濃度的CO2可維持培養(yǎng)液恒定的pH。適用于開(kāi)放培養(yǎng)，培養(yǎng)箱封后，可在一般恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，但是采用培養(yǎng)皿或多孔板培養(yǎng)時(shí)，則需要高濕度和高CO2含量的空氣。它增加了濕度，箱體內(nèi)裝有水浴，可以保證培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度。D.培養(yǎng)箱內(nèi)裝有紫外燈。通過(guò)氣體流量計(jì)可以調(diào)節(jié)CO2和空氣的比例。在水中可加入防腐劑（二氧乙酸）?？煞乐挂駽O2培養(yǎng)箱中濕度較高，易長(zhǎng)霉菌。離心機(jī)：CO2鋼瓶：液氮罐：儲(chǔ)品柜：用來(lái)存放雜物紫外燈：空氣凈化系統(tǒng)倒置顯微鏡3無(wú)菌操作（1）無(wú)菌室的滅菌：紫外燈無(wú)人時(shí)就要打開(kāi)

6、；進(jìn)無(wú)菌室要穿無(wú)菌服、戴帽子和罩；每周清洗消毒一次；所用物品要以外科手術(shù)方式嚴(yán)格消毒；室內(nèi)臺(tái)面要要保持潔凈，做完實(shí)驗(yàn)后，用75%酒精或千分之三新潔爾滅棉球擦拭超凈工作臺(tái)的臺(tái)內(nèi)、邊臺(tái)的臺(tái)面、倒置顯微鏡的載物臺(tái)等；所用物品要一次性準(zhǔn)備好；瓶要用酒精火焰消毒；盡量減少出入。（2）實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：肥皂洗手穿好隔離衣酒精棉球擦手【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】畫(huà)出一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)室的草圖，標(biāo)明各室的必須設(shè)備?！舅伎碱}】1觀看演示填寫(xiě)出無(wú)菌操作的要領(lǐng)。2在無(wú)菌室工作時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)是什么？3實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如何才能在頭腦中形成良好的無(wú)菌概念？（二）器械的清洗與消毒【實(shí)驗(yàn)原理】在組織培養(yǎng)過(guò)程中，離體細(xì)胞對(duì)任何毒性物質(zhì)都十分敏感。毒

7、性物質(zhì)包括解體的微生物及細(xì)胞殘余物以及非營(yíng)養(yǎng)的化學(xué)物質(zhì)，因此對(duì)新采用和重新使用的培養(yǎng)皿等培養(yǎng)用品都要嚴(yán)格清洗和消毒?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)并掌握細(xì)胞培養(yǎng)使用的器皿、器械的洗滌和消毒?！緝x器、材料及試劑】1儀器：超凈工作臺(tái)，干燥箱，高壓鍋，過(guò)濾器。2材料：0.22例微孔濾膜。3試劑：75%酒精，0.1%新潔爾滅，高錳酸鉀，重鉻酸鉀，濃硫酸。【操作步驟】1清洗（1）玻璃器皿的清洗步驟：按浸泡一刷洗一浸酸一沖洗等四步程序進(jìn)行。浸泡：新購(gòu)進(jìn)的玻璃器皿常帶有灰塵，呈弱堿性，或帶有鉛、碑等有害物質(zhì)，故先用自來(lái)水浸泡過(guò)夜、水洗，然后再用2%5%鹽酸浸泡過(guò)夜或煮沸30min，水洗。要領(lǐng)：培養(yǎng)用后的玻璃器皿要立即泡入

8、清水中，使下道刷洗工作能順利進(jìn)行。用后的玻璃器皿常帶有大量的蛋白質(zhì)附著，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。刷洗：用軟毛刷、優(yōu)質(zhì)洗滌劑，刷去器皿上的雜質(zhì)，沖洗晾干。要領(lǐng)：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗滌劑去器皿上的雜質(zhì)、刷洗次太多，會(huì)損害器皿的表面光潔度，洗滌劑有使pH上升的趨勢(shì)，所以易選用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)洗滌劑。禁止用去污粉。因其中含有砂粒。會(huì)嚴(yán)重破壞玻璃器皿的光潔度。特別注意刷洗瓶角部位。酸浸之前要把洗滌劑沖干凈。浸酸：將器皿浸泡于清潔液24h，如急用也不得少于4h。清潔液由重鉻酸鉀、濃硫酸及蒸餾水配制而成，具有很強(qiáng)的氧化作用，去污能力很強(qiáng)。經(jīng)清潔液浸泡后，玻璃器皿殘留的末刷洗掉的微量雜質(zhì)可被

9、完全清除。沖洗：先用自來(lái)水充分沖洗，吸管等沖流10min，瓶皿需每瓶灌滿、倒掉，反復(fù)10次以上。然后再經(jīng)蒸餾水漂洗3次，不留死角。晾干或烘干備用。對(duì)已用過(guò)的器皿，凡污染者必先經(jīng)煮沸30min或放3%鹽酸中浸泡過(guò)夜，未污染者可不需滅菌處理，但仍要刷洗、清潔液浸酸過(guò)夜，沖洗等?！靖健壳鍧嵰旱呐渲坪褪褂米⒁馐马?xiàng)1.清潔液（配方見(jiàn)表2-1）配方成分弱酸次強(qiáng)液強(qiáng)液重鉻酸鉀（g）5010060清水（ml）10001000200濃硫酸（ml）90160800硫酸濃度（v/v）8%14%80%選用耐酸塑料桶或不銹鋼桶配制為宜。先將重鉻酸鉀溶于水（用玻璃棒攪拌助溶，有時(shí)不能完全溶解）。緩緩加入濃硫酸，切忌過(guò)急，

10、否則將產(chǎn)熱而發(fā)生危險(xiǎn)（絕不可將重錯(cuò)酸餌液倒入濃硫酸中）。清潔液配好呈棕紅色，待變綠色時(shí)表明失效。由于清潔液的腐蝕性極強(qiáng)，配制與應(yīng)用時(shí)必須小心，并做好防護(hù)。2矽酸鈉洗液貯存液（X100）砂酸納80克加偏磷酸鈉9克加熱溶在1000ml水中。使用時(shí)用水稀釋100倍，將器皿放入煮沸20min，冷卻后沖洗，再用2%HCl浸泡2h后，自來(lái)水沖洗。矽酸鈉洗液較清潔液安全，但價(jià)格較貴。（2）塑料器皿清洗自來(lái)水充分浸泡一沖洗一2%NaOH浸泡過(guò)夜一自來(lái)水沖洗一2%5%鹽酸浸泡30min-自來(lái)水沖洗一蒸餾水漂洗3次一晾干一紫外線照射30min（或先用75%酒精浸泡、擦拭，再用紫外線照射30min）。凡能耐熱的塑料

11、器皿，最好經(jīng)101.3kPa（121.程）高壓滅菌。（3）膠塞等橡膠類(lèi)處理新購(gòu)置者先經(jīng)自來(lái)水沖洗一2%NaOH煮沸15min-自來(lái)水沖洗一2%5%HCl煮沸15min-自來(lái)水沖洗5次以上一蒸餾水沖洗5次以上一蒸餾水煮沸10min，倒掉沸水讓余熱烘干瓶塞等?；蛘麴s水沖洗晾干，整齊擺放于小型金屬盒內(nèi)經(jīng)101.3kPa高壓滅菌。（4）金屬器械的清洗新購(gòu)進(jìn)的金屬器械常涂有防銹油，先用沾有汽油的紗布擦去油脂，再用水洗凈，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用過(guò)的金屬器械應(yīng)先以清水煮沸消毒，再擦拭干凈。使用前以蒸餾水煮沸10min，或包裝好以101.3kPa高壓15min。（5）除菌濾器的處理用過(guò)的濾器將濾膜去除，

12、用三蒸水充分洗凈殘余液體，置干燥箱中烘干備用。2包裝包裝的目的是防止消毒滅菌后再次遭受污染，所以經(jīng)清洗烤干或晾干的器材，應(yīng)嚴(yán)格包裝后再行消毒滅菌處理。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。包裝分為局部包裝和全包裝兩類(lèi)，前者用于較大瓶皿，一般用硫酸紙和牛皮紙將瓶口包扎好；后者適于較小培養(yǎng)瓶皿、吸管、注射器、金屬器械和膠塞等，以下為常用瓶皿、吸管、無(wú)菌衣帽等的包裝方法，其它物品可參照處理瓶類(lèi)：硫酸紙罩以瓶，外罩二層牛皮紙用繩扎緊。小瓶皿、膠塞、刀剪等器械可裝人飯盒，飯盒再以牛皮紙包好，繩扎好。吸管、滴管用脫脂棉塞上不要太緊或太松）裝人消毒筒內(nèi)，濾器、濾瓶、橡

13、皮管等都要用牛皮紙包好瓶口等，外罩一層牛皮紙包好，再用包布包好。無(wú)菌衣、帽、罩，均以牛皮紙或包布包好，繩扎好。3消毒滅菌嚴(yán)格的消毒滅菌對(duì)保證細(xì)胞培養(yǎng)的成功是極為重要的，其方法分為物理法和化學(xué)法兩類(lèi)。前者包括干熱、濕熱、濾過(guò)、紫外線及射線等，后者主要指使用化學(xué)消毒劑等。熱滅菌：玻璃器皿，160170C，90120min或180C4560min。蒸氣滅菌：用于玻璃器皿、濾器橡膠塞、解剖用具、耐熱塑料器具、受熱不變性的溶液等，不同物品其有效滅菌壓力和時(shí)間不同，如培養(yǎng)用液、橡膠制品、塑料器皿等用68kPa（115C）高壓滅菌1Omin;布類(lèi)、玻璃制品、金屬器械等用103kPa（121.r）高壓滅菌15

14、20mino濾過(guò)除菌：適于含有不耐熱成分的培養(yǎng)基和試劑的除菌，用孔徑為0.22例微孔濾膜可除去細(xì)菌和霉菌等，用此濾膜過(guò)濾兩次，可使支原體達(dá)到某種程度的去除，但不能除去病毒。紫外線：紫外線的波長(zhǎng)為200300nm，最強(qiáng)是在254nm，615平方米最少一只紫外燈，高度要在2.5m以下，濕度45%60%，桿菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)不低于30分鐘的照射時(shí)間。熏蒸消毒：當(dāng)遇有細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)多次污染，或?qū)嶒?yàn)室兩個(gè)月一次的常規(guī)消毒，均可用高錳酸鉀57.5g加甲醛（40%）1015ml，混合放入一開(kāi)放容器內(nèi)，立即可見(jiàn)白色甲醛煙霧，消毒房間需封閉24h，至少4h以上。煮沸消毒：緊密情況時(shí)使用

15、，金屬器械和膠蹇在水中煮2030分鐘，趁熱傾去水分即可使用?；瘜W(xué)消毒：化學(xué)藥品消毒滅菌法是應(yīng)用能殺死微生物的化學(xué)制進(jìn)行消毒滅菌的方法。實(shí)驗(yàn)室桌面、用具及洗手用的溶液均常用化學(xué)藥品進(jìn)行消毒殺菌。常用的有：2%煤酚皂溶液（來(lái)蘇爾）、0.25%新潔爾滅、1%升汞、35%甲醛溶液、75%酒精?！緦?shí)驗(yàn)報(bào)告】玻璃器皿的清洗步驟和要領(lǐng)是什么？【思考題】消毒除菌的方式有哪些？各適用于什么物品或場(chǎng)所的消毒除菌？實(shí)驗(yàn)2細(xì)胞培養(yǎng)液的配制【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴炀氄莆张囵B(yǎng)基（DMEM）的配制，了解其它培養(yǎng)基的配制方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，它是根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的

16、需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子和其它輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細(xì)胞外液相似。小牛血清含有一定的營(yíng)養(yǎng)成分，更重要的是它含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的生長(zhǎng)因子、激素、貼附因子等，這是合成培養(yǎng)基無(wú)法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性。故一般體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)要加入一定量的小牛血清（10%）?！緝x器、材料和試劑】?jī)x器：蠕動(dòng)泵1套，濾器1套，蒸餾器，高壓蒸汽滅菌鍋，磁力攪拌器，pH計(jì)。材料：500mL、250mL鹽水瓶，250mL或500mL培養(yǎng)液瓶，0.22m的微孔濾膜。3試劑：雙蒸水，小牛血清，合成培養(yǎng)基（DMEM），NaHCO3【操作步驟】過(guò)濾器的準(zhǔn)備

17、和安裝清洗好過(guò)濾器，干燥，放入一張0.22m的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20min進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理。在超凈工作臺(tái)內(nèi)安裝好過(guò)濾裝置，準(zhǔn)備過(guò)濾。合成培養(yǎng)基的配制將干粉型培養(yǎng)基溶于總量1/3的三蒸水中，再用1/3水沖洗包裝內(nèi)面兩次，倒入培養(yǎng)液中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液。攪拌使其溶解。將干粉溶于450毫升水中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，用水沖洗包裝內(nèi)面，確保干粉都溶解成培養(yǎng)液根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明的要求和實(shí)驗(yàn)補(bǔ)加3.7gNaHCO3。加抗生素：最終濃度青霉素為100U/ml，鏈霉素100“g/ml。一般市售青霉素為80萬(wàn)U/瓶，將其溶解在4ml體積內(nèi)，每1000ml培養(yǎng)液中加0.5ml，即成最終濃度為100

18、U/ml。市售鏈霉素為100萬(wàn)U/瓶，將其溶解5ml體積內(nèi)，也是每1000ml加0.5ml，使其最終濃度為100“g/ml。調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值為7.27.41000毫升容量瓶定容。過(guò)濾法除菌。分裝于玻璃瓶中，4C冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)加血清。小牛血清的處理市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理，即通過(guò)加熱的方法破壞補(bǔ)體。將血清放入56C水浴中30min,其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。4生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制除無(wú)清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需要加入一定量的小牛血清（約10%）?！咀⒁馐马?xiàng)】1培養(yǎng)液配好后，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)在37C溫箱內(nèi)置2448h,

19、以檢測(cè)培養(yǎng)液是否有污染。然后再用于實(shí)驗(yàn)。2配制培養(yǎng)液所需血清的質(zhì)量要合格并保持穩(wěn)定。一個(gè)批號(hào)試用效果良好后，就可一次購(gòu)入較多同一批號(hào)的血清，這樣實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，配液時(shí)調(diào)整pH值較易。3每次配液量以使用兩周左右的量為宜。一次配液不要太多，一是營(yíng)養(yǎng)成分有損失，二是容易污染?！緦?shí)驗(yàn)報(bào)告】列出詳細(xì)細(xì)驗(yàn)操作過(guò)程，并在每步操作之后標(biāo)明該步驟常發(fā)生的問(wèn)題，如何解決這些問(wèn)題及該步驟應(yīng)注意的事項(xiàng)?！舅伎碱}】1為什么進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液中需要加入一定量的小牛血清？2如何確認(rèn)你所配制的培養(yǎng)基沒(méi)有被細(xì)菌污染？實(shí)驗(yàn)3細(xì)胞傳代培養(yǎng)與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制（MTT法）【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞

20、能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。生長(zhǎng)曲線是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，為培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。典型的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可分為生長(zhǎng)緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長(zhǎng)期，呈平臺(tái)狀的平頂期及退化衰亡四個(gè)階段。以存活細(xì)胞數(shù)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間作圖即生長(zhǎng)曲線。生長(zhǎng)曲線一般有兩種測(cè)定方法：計(jì)數(shù)法和MTT比色法間接測(cè)量。生長(zhǎng)曲線常用于測(cè)定藥物等外來(lái)因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。MTT比色法的基本原理是：MTT（溴化噻唑藍(lán)四唑）

21、被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原后，生成不溶于水的藍(lán)色的甲臜（Formazan顆粒，甲臜被助溶劑溶解后，可在酶標(biāo)儀上讀取其光吸收值（0D）。因?yàn)榫€粒體脫氫酶的含量與細(xì)胞的數(shù)目成正相關(guān)，所以藍(lán)色顆粒的多少可以代表細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。又由于死細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶失去活力，MTT并不能被其還原。所以通過(guò)在酶標(biāo)儀上測(cè)定0D值，就可以反映出活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆占?xì)胞傳代培養(yǎng)的方法掌握每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程及生長(zhǎng)特點(diǎn)，掌握細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制方法。掌握體外培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查內(nèi)容及方法。掌握無(wú)菌操作技術(shù)，熟練各實(shí)驗(yàn)器材的使用?！酒鲀x、材料及試劑】1儀器：倒置顯微鏡，二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)等。2材料：

22、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板、針孔濾器、注射器、滴管（吹打管）移液槍、細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。3.試劑：0.2眺胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液（含胎牛血清FBS）、5mg/mlMTT、0.玖臺(tái)盼藍(lán)、雙抗（青霉素+鏈霉素）、DMSO【操作步驟】細(xì)胞傳代：取70%-80%匯合的培養(yǎng)細(xì)胞，使培養(yǎng)瓶的細(xì)胞面向上，倒去原瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液。2向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.2玖胰蛋白酶ImL，輕輕振動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞面與胰蛋白酶接觸5s,即倒掉胰蛋白酶。再加入胰蛋白酶ImL，將培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)觀察到大部分細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞變圓現(xiàn)象時(shí)，立即將培養(yǎng)瓶直立，終止消化。3去除消化液，加入培養(yǎng)液2mL，用

23、吹打管吸取培養(yǎng)液吸取培養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞（注意：整個(gè)細(xì)胞面都要吹打到，包括邊角細(xì)胞）。吹打勿用力過(guò)猛，以免傷害細(xì)胞。4將細(xì)胞懸液分成兩份，一份（ImL）接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)齊培養(yǎng)液至3mL，用于傳代。一份用于細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制：1取上述細(xì)胞懸液（ImL）滴，滴到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)所計(jì)數(shù)結(jié)果將原液稀釋成4X104個(gè)/mL。2將細(xì)胞接種到96孔板中，100uL/孔，最后每孔再加100uL培養(yǎng)液，補(bǔ)齊至200uL。（注意：接種時(shí)要將細(xì)胞懸液吹打均勻，每隔段時(shí)間要吹打次，以防細(xì)胞聚集沉底，保證每孔加入的細(xì)胞總數(shù)致）3接種后，每24h取3個(gè)孔加入無(wú)菌的MTT液，10

24、uL孔（操作時(shí)避光）4.4h后，將孔內(nèi)的溶液全部吸出，加入DMSO，100uL/孔，混勻，將孔內(nèi)溶液移到新96孔板中，于酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處的光吸收值（0D值）。5以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，0D值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。【注意事項(xiàng)】傳代培養(yǎng)時(shí)要注意嚴(yán)格的無(wú)菌操作，并防止細(xì)胞之間的交叉污染。酶解消化過(guò)程中要不斷觀察，消化過(guò)度會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害，消化不夠則難于將細(xì)胞解離下來(lái)。傳代后每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，包括培養(yǎng)液顏色變化，細(xì)胞形態(tài)改變，是否污染，細(xì)胞是否健康生長(zhǎng)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好。掌握好傳代時(shí)機(jī)：健康生長(zhǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)致密，7080鋪滿瓶底時(shí)，即可傳代5做MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線時(shí)，接種細(xì)胞的數(shù)量

25、要準(zhǔn)確，否則后面的工作無(wú)法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)報(bào)告】1試述傳代培養(yǎng)的步驟和注意事項(xiàng)，并以文字描述細(xì)胞傳代后細(xì)胞每天的生長(zhǎng)情況。2繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線?！舅伎碱}】1細(xì)胞傳代培養(yǎng)的目的是什么？2判斷細(xì)胞健康的標(biāo)準(zhǔn)是什么？3貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞在傳代方法上有什么不同？4MTT法從根本上是反映細(xì)胞的代謝和增殖活力，而非細(xì)胞數(shù)量。為什么？實(shí)驗(yàn)4原代細(xì)胞培養(yǎng)乳鼠組織塊法原代培養(yǎng)【實(shí)驗(yàn)原理】直接從生物體內(nèi)獲取組織細(xì)胞進(jìn)行的首次培養(yǎng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步，是從事培養(yǎng)工作人員應(yīng)熟悉和掌握的最基本的技術(shù)。根據(jù)培養(yǎng)方法不同分為組織塊培養(yǎng)法和單層細(xì)胞培養(yǎng)法（消化培養(yǎng)法）。原代培養(yǎng)是獲取細(xì)胞的主要手段，但原

26、代培養(yǎng)的組織由多種細(xì)胞成分組成，比較復(fù)雜，因而原代培養(yǎng)細(xì)胞部分生物學(xué)特征尚不穩(wěn)定，如要做較為嚴(yán)格的對(duì)比性實(shí)驗(yàn)研究，還需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆赵?xì)胞培養(yǎng)的一般方法和步驟及培養(yǎng)過(guò)程中的無(wú)菌操作技術(shù)，熟悉原代培養(yǎng)細(xì)胞的觀察方法?！緝x器、材料及試劑】1儀器：培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、彎頭吸管、移液管、手術(shù)器械材料：新生1一3天的乳鼠試劑：DMEM培養(yǎng)基，Hank液，酒精?！静僮鞑襟E】組織塊直接培養(yǎng)法將新生大鼠引頸處死，置75%酒精泡23S（時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)、以免酒精從和肛門(mén)浸入體內(nèi)）再在超凈臺(tái)內(nèi)將新生小鼠解剖，取肝臟，置平皿中。用Hank液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。用手術(shù)剪將肝

27、臟剪成小塊（1mm2），再用Hank液洗三次。將組織塊用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用彎頭吸管將組織塊在瓶壁上均勻擺置，每小塊間距0.5cm左右。25mL的培養(yǎng)瓶以2030塊為宜。組織塊放好后，翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊，置37C培養(yǎng)箱靜置35h,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37C繼續(xù)培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)3一5d后進(jìn)行換液。【注意事項(xiàng)】1自取材開(kāi)始，保持所有組織細(xì)胞處于無(wú)菌條件。2在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過(guò)久，以免溶液蒸發(fā)。3操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼后應(yīng)該待其冷卻才能夾取組織。4操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太

28、快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。5待組織塊略干燥能黏貼附于瓶壁時(shí)再使之與培養(yǎng)基接觸，勿使組織塊漂浮起來(lái)。如果組織塊沒(méi)有貼壁，則細(xì)胞不易生長(zhǎng)，即使生長(zhǎng)也因沒(méi)有貼在瓶壁上面而無(wú)法收集到。附胰酶消化法同組織塊法前三步。視組織塊量加入510倍的0.25%胰酶液，37C水浴中消化2040min每隔5min振蕩一次，使細(xì)胞分離。待組織變得疏松，顏色略為發(fā)白時(shí)，加入35ml培養(yǎng)液（含10%小牛血清）以終止胰蛋白酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。1000rpm，離心10min棄上清液。消化后將細(xì)胞懸液通過(guò)100目孔徑不銹鋼網(wǎng)濾過(guò)，以除掉未充分消化的大組織。加入Hank液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。加入培養(yǎng)液l2ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將細(xì)胞調(diào)整到5X105個(gè)/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37C下培養(yǎng)。上述消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步分離不同細(xì)胞。細(xì)胞分離的方法各實(shí)驗(yàn)室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質(zhì)酶等）?！緦?shí)驗(yàn)報(bào)告】記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程和細(xì)胞生長(zhǎng)情況【思考題】1.細(xì)胞培養(yǎng)中如何防止污染？2組織塊培養(yǎng)3一5d后進(jìn)行換液的目的是什么？比較組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法獲得原代培養(yǎng)物的效果和各自的優(yōu)缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)5細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196C液氮中低溫保存，以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)