環(huán)孢菌素A、雷洛昔芬及其聯(lián)合應(yīng)用逆轉(zhuǎn)K562A02細(xì)胞多藥耐藥的研

1、環(huán)孢菌素A、雷洛昔芬及其團(tuán)結(jié)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥的研鮑文,陳寶安,岑嶺,丁家華,許文林1,沈惠玲1,高沖,孫耘玉,程堅(jiān),王駿,趙剛,馬燕【關(guān)鍵詞】環(huán)孢菌素A;雌激素受體按捺劑;雷洛昔芬；K562/A02細(xì)胞;多藥耐藥EffetfylsprineA,RalxifeneandTheirbinatinntheReversinfultidrugResistaefK562/A02LineKeyrdsylsprineA;estrgen-reeptrinhibitr;ralxifene;K562/A02;drugresistane多藥耐藥(ultidrugresistane,DR)系多因素所

2、致,腫瘤細(xì)胞dr1基因過分表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞膜上相對(duì)分子質(zhì)量170103的糖卵白(P-glyprtein,P-gp)增多是產(chǎn)生DR的重要機(jī)制,P-gp具有藥物泵的成效,能將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物自動(dòng)地泵出細(xì)胞外以淘汰細(xì)胞內(nèi)藥物積蓄,從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生DR1。腫瘤化療失敗的重要緣故原由之一是多藥耐藥性的產(chǎn)生，因此怎樣樂成地逆轉(zhuǎn)多藥耐藥是當(dāng)前腫瘤治療學(xué)中的一個(gè)研究熱門。已有文獻(xiàn)報(bào)道，屈洛昔芬不克不及顯著加強(qiáng)化療藥物柔紅霉素DNR對(duì)K562敏感細(xì)胞的殺傷作用,但能顯著加強(qiáng)DNR對(duì)K562/A02耐藥細(xì)胞的殺傷作用2。外洋有文獻(xiàn)報(bào)道,單獨(dú)應(yīng)用環(huán)孢菌素(sA)或雷洛昔芬在體外實(shí)行中得到了必然的逆轉(zhuǎn)結(jié)果,我們

3、以白血病細(xì)胞系K562及其耐藥細(xì)胞系K562/A02為實(shí)行研究工具舉行體外實(shí)行。質(zhì)料和要領(lǐng)細(xì)胞系和造就條件K562/A02細(xì)胞是經(jīng)阿霉素漸漸誘導(dǎo)、具有DR表型的不變細(xì)胞系,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供,實(shí)行前無藥造就2周。K562敏感株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供。細(xì)胞造就液由RPI1640造就液(GibBRL)、10%小牛血清和青霉素、鏈霉素各100U/l構(gòu)成。K562細(xì)胞置于37、5%2造就箱中,2-3天傳代1次。藥物及試劑柔紅霉素(DNR)為意大利Faritalia公司產(chǎn)物，環(huán)孢菌素AsA為瑞士山德士公司產(chǎn)物，雷洛昔芬由江蘇省藥物所提供，四甲基偶氮唑鹽(TT)為Fluka公司產(chǎn)

4、物,用PBS配制成5g/L。PR引物dr1(436bp)(上海生工生物工程技能辦事提供)F:5-TGGTTTGATGTGAGATGTTGGG-3,R:5-AGATAGAGGAAAGAGATA-3;-atin(內(nèi)參照)(270bp)F:5-TAAATGAGTGGTGTGG-3,R:5-AGGTAGAGAGGATGG-3。逆轉(zhuǎn)劑對(duì)DNR細(xì)胞毒性影響的TT法測(cè)定取對(duì)數(shù)生恒久細(xì)胞,參加逆轉(zhuǎn)劑單用或團(tuán)結(jié)，sA終濃度1g/L,雷洛昔芬終濃度2.5g/L作用1小時(shí),按所設(shè)梯度參加差異濃度DNR,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。另設(shè)不加逆轉(zhuǎn)劑、不加DNR、不加細(xì)胞的比較組，接種于96孔板,每孔含2105個(gè)細(xì)胞懸液200l

5、。置于37、5%2造就箱孵育48小時(shí)后取出,加TT反響液20l，繼承造就4小時(shí)后,于平板離心機(jī)上2500g離心10分鐘,棄上清,每孔加150l二甲亞砜溶解,微量振蕩器混勻,酶標(biāo)儀上測(cè)定540n波長的吸光度(A)。盤算細(xì)胞的生長按捺率：生長按捺率(%)=(1-試驗(yàn)孔A/比較孔A)100%按照生長按捺率接納綜正當(dāng)盤算半數(shù)按捺量(I50)。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥株I50/加逆轉(zhuǎn)劑后I50實(shí)行重復(fù)5次,每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔,取均勻值為最閉幕果。dr1基因RNA表達(dá)程度的RT-PR測(cè)定反響條件為逆轉(zhuǎn)錄反響:3010分鐘,4230分鐘,995分鐘,55分鐘;PR反響:942分鐘,預(yù)變性;9430秒,5630秒,724分

6、鐘,30個(gè)循環(huán)。PR產(chǎn)物于4下短期保存。PR產(chǎn)物的檢測(cè)和闡發(fā)拔取5lPR產(chǎn)物，取擴(kuò)增產(chǎn)物舉行1%瓊脂糖凝膠電泳50分鐘,溴化乙錠染色，紫外燈下照相,用IageasterVDS圖像闡發(fā)處置懲罰體系掃描。圖像輸入盤算機(jī),用IageasterTtalLab闡發(fā)軟件舉行灰度闡發(fā),并以-atin校正作相對(duì)量闡發(fā),數(shù)值以兩者之積分吸光度的比值表現(xiàn)。P-gp表達(dá)的F檢測(cè)取K562/A02細(xì)胞株,終濃度2105/l，分組加藥，別離孵育48小時(shí)、網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞。冷PBS液洗3次,2500g離心5分鐘,棄上清,參加P-gp單克隆抗體5l(標(biāo)有熒光素PE)。避光,常溫保存20分鐘后,加生理鹽水洗1次,2500g離心5分鐘

7、,棄上清,加0.5l生理鹽水,上流式細(xì)胞儀FASalibur美國BetnDikinsn公司產(chǎn)物檢測(cè)。細(xì)胞內(nèi)DNR濃度測(cè)定取K562/A02細(xì)胞株，終濃度2105/l，分組加藥，別離孵育48小時(shí)，另設(shè)K562細(xì)胞及不加逆轉(zhuǎn)劑K562/A02細(xì)胞比較組(細(xì)胞終濃度2105/l)，別離參加DNR(濃度：1g/L)，置于37、5%2造就箱孵育2小時(shí)，冷PBS液洗3次,2500g離心5分鐘,棄上清用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNR濃度。統(tǒng)計(jì)學(xué)處置懲罰分組實(shí)行比力接納t查驗(yàn)。用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件舉行闡發(fā)。結(jié)果逆轉(zhuǎn)劑處置懲罰前后DNR對(duì)K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞的毒性作用逆轉(zhuǎn)劑對(duì)耐藥基因RNA表達(dá)的

8、調(diào)治作用P-gp卵白的F檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNR濃度測(cè)定未加逆轉(zhuǎn)劑的K562/A02耐藥株細(xì)胞內(nèi)DNR濃度為562敏感株的12。K562/A02經(jīng)sA(1g/L),雷洛昔芬2.5g/L及sA(1g/L)+雷洛昔芬2.5g/L聯(lián)互助用48小時(shí),細(xì)胞內(nèi)DNR濃度別離為K562敏感株的33、12.78和45.29。sA處置懲罰組及sA團(tuán)結(jié)雷洛昔芬處置懲罰組，細(xì)胞內(nèi)DNR濃度顯著增長，與K562/A02比較組間有明顯性差異P0.05(圖2)。討論如今的研究表白，DR的產(chǎn)生是多種基因產(chǎn)物配互助用的結(jié)果，到場(chǎng)多藥耐藥產(chǎn)生的因素重要有以下幾方面3：腫瘤細(xì)胞外貌ATP團(tuán)結(jié)膜糖卵白的表達(dá)增長或活性進(jìn)步，包羅P-gp、多

9、藥耐藥相干卵白R(shí)P、肺抗藥性相干卵白(LRP)、乳腺癌抗藥性相干卵白(BRP)等幾類；谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶glutathineStransferase的表達(dá)增長或活性加強(qiáng)；TP含量淘汰及活性低落；卵白激酶(prtEinkinase,PK)的表達(dá)增長或活性加強(qiáng)；腫瘤細(xì)胞抗凋亡本領(lǐng)加強(qiáng)。耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研究也是從以上幾個(gè)方面來舉行。楊純粹傳授等4以為,如今能在臨床證明跟一些腫瘤耐藥相干的基因只有dr1/P-gp。以是P-gp還是臨床落服多藥耐藥重要的靶點(diǎn)和不雅察指標(biāo)。臨床用來落服耐藥的本領(lǐng)重要有兩個(gè)：只管選擇患者敏感的藥物，加大化療藥物劑量；應(yīng)用多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑團(tuán)結(jié)化療以落服耐藥。在上述二類藥物中前者是應(yīng)用

10、比力普及的要領(lǐng)，但療效不抱負(fù)，患者每每因出現(xiàn)種種嚴(yán)峻的并發(fā)癥而殞命。在如今，團(tuán)結(jié)利用逆轉(zhuǎn)劑已成為耐藥逆轉(zhuǎn)研究的生長趨勢(shì)。公正利用差異作用機(jī)制、毒副反響無疊加的兩種或多種耐藥逆轉(zhuǎn)劑不單可起到協(xié)同增敏作用,并且可低落單一逆轉(zhuǎn)藥物劑量,淘汰副作用,進(jìn)步耐受性5。sA是最早用于耐藥逆轉(zhuǎn)研究的、且為體外實(shí)行結(jié)果最好的經(jīng)典藥物之一。它重要通過與化療藥物競(jìng)爭(zhēng)和糖卵白團(tuán)結(jié),從而使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度增長而逆轉(zhuǎn)耐藥6。研究表白sA是廣譜DR相干卵白的調(diào)治因子，除了與P-gp團(tuán)結(jié)還能影響RP、BRP活性7。它有顯著的劑量效應(yīng),當(dāng)?shù)竭_(dá)10l/L時(shí)逆轉(zhuǎn)作用最強(qiáng),但其毒副作用也隨之增大,以是在臨床應(yīng)用有必然的范圍性。本課題組

11、曾接納逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響(RT-PR)和estenblt要領(lǐng)檢測(cè)漢防己甲素1l/L團(tuán)結(jié)屈洛昔芬5l/L)應(yīng)用于K562細(xì)胞的作用，48小時(shí)后K562細(xì)胞br/ablRNA表達(dá)開始下調(diào),K562細(xì)胞210BR/ABL卵白表達(dá)于72小時(shí)開始下調(diào)。這一結(jié)果說明兩藥團(tuán)結(jié)應(yīng)用可下調(diào)K562細(xì)胞br/abl的表達(dá),這大概是兩藥聯(lián)用逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制之一8。雷洛昔芬是新一代非選擇性雌激素受體拮抗劑，也是一種卵白激酶(PK)按捺劑,與屈洛昔芬有雷同作用，比屈洛昔芬副作用小，重要用于防范骨質(zhì)疏松和治療乳腺癌，它既無異搏定的嚴(yán)峻心血管毒性反響,也無環(huán)孢菌素A的腎臟毒性及過敏反響9，10。剪切因子SPF45(RB17)

12、在很多實(shí)體瘤上高表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素及長春新堿耐藥，雷洛昔芬可以逆轉(zhuǎn)SPF45誘導(dǎo)耐藥的作用11。最新的研究表白，雷洛昔芬的汲取滲出性PAB低于排泄?jié)B出性PBA，但在sA及維拉帕米作用下雷洛昔芬PAB升高12。外洋已有人開始研究雷洛昔芬與多藥耐藥的干系，海內(nèi)尚無相干報(bào)道?；谏鲜鏊剂?本實(shí)行團(tuán)結(jié)環(huán)孢菌素A和新藥雷洛昔芬逆轉(zhuǎn)臨床產(chǎn)生的多藥耐藥。作為逆轉(zhuǎn)劑,應(yīng)具有逆轉(zhuǎn)作用而自己又無細(xì)胞毒作用。我們通過TT預(yù)實(shí)行，sA在5g/L及以下濃度，雷洛昔芬在10g/L及以下濃度，對(duì)K562細(xì)胞系及K562/A02細(xì)胞系均無直接細(xì)胞毒性,我們選用sA(1g/L)和雷洛昔芬(2.5g/L)時(shí)創(chuàng)造，兩藥不克不及加強(qiáng)化療藥物DNR對(duì)K562細(xì)胞系的殺傷作用，但能顯著加強(qiáng)DNR對(duì)K562/A02細(xì)胞系的殺傷作用。本實(shí)行用RT-PR的要領(lǐng)檢測(cè)了dr1RNA的表達(dá)程度，結(jié)果表現(xiàn)K562細(xì)胞系無dr1RNA表達(dá),而K562/A02細(xì)胞系dr1RNA高表達(dá),sA及雷洛昔芬單獨(dú)作用后耐藥株dr1RNA表達(dá)下調(diào)薄弱，聯(lián)適用藥下調(diào)結(jié)果顯著。P-gp具有藥物泵的的成效,能將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物自動(dòng)地泵出細(xì)胞外以淘汰細(xì)胞內(nèi)藥物積蓄,從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生DR。P-gp卵白的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞膜上卵白的表達(dá)量成正比。本實(shí)行表現(xiàn)，sA及雷洛昔芬處置懲罰過的耐藥株P(guān)-gp卵白的熒光強(qiáng)度下調(diào)，兩藥團(tuán)結(jié)下調(diào)更顯著，這表白sA