轉(zhuǎn)發(fā)實驗室常用技術(shù)method

1、2007-10-03|軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克隆1.2瓊脂糖與2細胞培養(yǎng)1:1 的體2007-10-03|軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克隆1.2瓊脂糖與2細胞培養(yǎng)1:1 的體積比混0.6的底層瓊脂，6孔板中每個孔1.4ml溫室凝固，取對數(shù)期細胞胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數(shù)，并調(diào)細胞濃度為 10000 /ml，將 0.6瓊脂糖與2細胞培養(yǎng)基以1:1 的體積比混合0.3的上層瓊脂1ml 上層瓊脂和100ul 單細胞懸（1000cell/well)，混勻，室溫凝固。置于 37，5CO2 的細胞 率圖像2007-10-03|MTT細胞以每孔3000 個接種至96 孔板，分成不同組，每組3

2、孔，利用10DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 之后，向培養(yǎng)液中加一定工作濃度的藥物（單體或混合物），繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 或 48h結(jié)束，直接向每孔5mg/ml MTT 10l，孵育24 小時（應(yīng)在顯微鏡下觀察）。去除培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 100l，充分振3 分鐘，立即在酶標儀上測定 490nm 的吸光度值由于這種方法基于琥珀酸脫氫酶的活性，因而加入 MTT 之后應(yīng)該在微鏡下觀察，藥物是否可以改變細胞琥珀酸脫氫酶的活性。若是改變不可以使用此種方法另有根據(jù)細胞 ATP 含量測定細胞增殖的方法，但是都要考慮藥物對ATP 是否另有根據(jù)細胞 ATP 含量測定細胞增殖的方法，但是都要考慮藥物對ATP 是

3、否有影響所以測定細胞增殖，最簡單，最原始，最麻煩的方法，進行細胞計數(shù)們感覺還是最好的方 2 5， 細胞培養(yǎng)液參照。96/241 細胞，可以將細胞調(diào)至濃度十萬，之后利用排槍，吸取96/241 細胞，可以將細胞調(diào)至濃度十萬，之后利用排槍，吸取 100ul，至 96 孔板中3， 241ml190%FBS，10%DMSO的凍存液，DMSO 加入 1ml 細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱/冷凍日期/操作 1.25 0.005 0.0630.123 30.003 0.0670.128 50.006 0.0650.120 8533胞數(shù)/ml4大格細胞總數(shù)/41000020-50l。 具體實驗步驟如下：

4、利用RIPA細胞裂解液，提取經(jīng)處理細胞的總蛋白，根據(jù)RIPA30min45l10倍之后，利用BCA利用BCA100 蛋白質(zhì)定量測定試劑盒（購自 璃放置在制膠架上，根據(jù)上述PAGE璃放置在制膠架上，根據(jù)上述PAGE膠的配置方法配制分離膠，之后將配制膠灌于兩個玻璃之0.5cm 1.5cm 處標記(膠會收縮)1cm，置PH8.8）未聚合的丙烯酰胺，濾紙（普通）吸干（帶手套，Whatman3mm濾紙）。加樣（冰上4mM 6mM 樣品量06546B, 將上述加好的樣品放于酶標板 C3730min D，取出酶標板，利用酶標儀測定其OD570 50l-950l50l-950l （預(yù)染蛋白質(zhì)marker）色，

5、室溫2.5h。之后快速利用washbuffer洗滌一次15min,再洗兩次各5min首先按要求將一抗利用PBSTTBSTPVDF4冰箱過夜；之后浸于Washbuffer，按照4ml/cm2室溫洗滌15minWash buffer25min 洗滌。將二抗按照要求進行稀釋于PBST或TBST將kit 中的solution1 和solution2 等體積混和，之后按照 0.125/cm2 等體積覆蓋于膜上（ 軟瓊脂克隆法鼠軟瓊脂克隆法鼠體內(nèi)接種法檢測細胞致瘤性的比將膜蛋白面向上，放于XrayFilmcassette,在暗室中將film放于膜上，蓋上分鐘?？焖贈_洗,之后放于第二個film，放置 10min.將沖洗的膠片放于室溫涼干2007-09-29|PCRPCR現(xiàn)在已經(jīng)是一種常規(guī)的生物學(xué)實驗技術(shù) ，俺也有相當(dāng)一段時間采用這種技術(shù)來分析 的表達。現(xiàn)將此技術(shù)與大家 。PCRPCR一樣，只是此技術(shù)的PCR 最大的麻煩是特異性和污染問題。首先采用別人 的引物為佳。當(dāng)然采用的p r的級別要高點為好，例如PNAS以上等