葡萄酒中蘋果酸的測定

1、19/19葡萄酒中蘋果酸的測定原理:利用MegaQuantTM (專利技術(shù))測定L-蘋果酸需要進行三步酶解反應(yīng)，第一步：在L-蘋果酸脫氫酶(L-MDH)的催化作用下，L-蘋果酸被煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化生成草酰乙酸：(1) L-蘋果酸 + NAD+ (L-MDH) oxaloacetate + NADH + H+第二步：加入過剩的L-谷氨酸，在谷草轉(zhuǎn)氨酶的作用下，生成L-天門冬氨酸和2酮戊二酸(2) Oxaloacetate + L-glutamate (GOT) L-aspartate + 2-oxoglutarate第三步：在心肌黃酶的催化作用下，NADH還原碘硝基氯化四氮唑(

2、INT)，生成甲基- INT(3) NADH + INT + H+ (diaphorase) NAD+ +甲基-INT生成的甲基- INT的量取決于L-蘋果酸的量，甲基- INT的吸光度值可在505nm下測量。特異性, 靈敏度, 測量范圍和精確度:該實驗方法是專門用于測定L-蘋果酸含量的。最小可調(diào)吸光光度為0.01個吸光單位，樣品體積為20uL，現(xiàn)在的L-蘋果酸濃度為7.7 mg/L。假如最小可調(diào)吸光光度為0.02吸光光度，樣品體積為20uL，現(xiàn)在的L-蘋果酸檢測線為15.4 mg/L。該實驗的測量范圍為0.15-15ug L-蘋果酸(關(guān)于20uL樣品液中的濃度為0.007-0.75 g/L)

3、，同一樣品分不進行兩次測定，其吸光度值會有0.01-0.02吸光單位的變化，關(guān)于樣品體積為20uL，現(xiàn)在的L-蘋果酸濃度大約在7.7-15.4 mg/L之間，假如樣品是通過稀釋的，在計算結(jié)果時候需要乘以相應(yīng)的稀釋系數(shù)（F）,假如在樣品制備時期，樣品的重量是被稱量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的細(xì)微差不能夠被分辨。干擾:紅酒中的酚醛樹脂會對本試驗造成干擾，引起INT的“緩慢反應(yīng)”（圖2），因此在對未稀釋的紅酒進行測定時，必須首先用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）凈化樣品?！熬徛磻?yīng)”同樣也發(fā)生在未稀釋的白葡萄酒中，按照提供的方法進行測定，其緩慢反應(yīng)速率特不的慢。在用MegaQua

4、ntTM測定L-蘋果酸的時候，關(guān)于存在的兩種潛在的次要誤差緣故的認(rèn)但是特不有必要的：使用PVPP去除了紅酒中的大部分酚醛樹脂，然而依舊存在著 “緩慢反應(yīng)”，由于用PVPP處理過的葡萄酒（導(dǎo)致潛在的高估白葡萄酒中的L-蘋果酸0.00-0.01g/L，或紅葡萄酒中的濃度0.00-0.03g/L）其中存在的“緩慢反應(yīng)”特不的慢，因此能夠忽略不計（實驗方法A），然而，假如想得到精確的結(jié)果，能夠通過實驗方法B精確計算得到。推舉使用PVPP藥片的測試方法（如每5 mL葡萄酒用1個藥片）中，導(dǎo)致了對樣品濃度進行了2 % (v/v)稀釋，計算方法中考慮了這一點（請參照用PVPP處理樣品方法）還原性物質(zhì)能夠干擾

5、試驗，引起“緩慢反應(yīng)”，如：亞硫酸亞和抗壞血酸鹽，然而僅僅能夠?qū)舛炔皇菍ｉT高的葡萄酒樣品進行測定，如亞硫酸鹽濃度在4 g/L，假如樣品中的抗壞血酸鹽含量特不高( 400 mg/L)，則不能進行測定。向已完成反應(yīng)的試管中添加L-蘋果酸（每20uL添加7.5 ug），通過增加的吸光度值進一步驗證其他干擾的阻礙，利用附帶的內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控能夠?qū)Ω蓴_物質(zhì)進行鑒定。通過向樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控做定量回收試驗，計算樣品在處理和提取時的損失。安全性:L-蘋果酸測定所使用的試劑沒有有毒物質(zhì)。然而濃縮緩沖液中含有作為防腐劑用的疊氮化鈉(0.02 % w/v)，需要按照實驗室安全操作規(guī)程進行試驗。試劑盒:MegaQu

6、antTM L-蘋果酸含量測定試劑盒能夠進行60次的測定試驗，并提供有全部的試驗方法：58次測定試劑盒(cat. no. K-LMALR)瓶1: 雙甘氨肽緩沖液 (100 mL, 100 mM, pH10.0) +L-谷氨酸(100 mM)+疊氮化鈉(0.02 % w/v)穩(wěn)定性 2年，4C保存。瓶2: 藥片（60粒）-含有心肌黃酶, GOT, INT, FAD和NAD+，使用前要先恢復(fù)至室溫在打開穩(wěn)定性 2年，-20C;干燥保存。瓶3: L-蘋果酸脫氫酶(1.3 mL, 15,000 U/mL)穩(wěn)定性 2年，4C保存。瓶4: L-蘋果酸質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)液(5 mL, 0.375 mg/mL)穩(wěn)定性

7、2年，4C保存。瓶5: 藥片（65粒）-含有PVPP穩(wěn)定性 5年，室溫保存。試劑制備:1. 備用試劑盒中的瓶1溶液隨時使用。每個試驗用量1.5 mL，也能夠同等量的蒸餾水稀釋，然后每個試驗用3 mL。2. 備用試劑盒中的瓶2隨時使用。保存于-20C下穩(wěn)定性 2年。3. 預(yù)備瓶3中的溶液，第一次打開前，需要充分晃動瓶子，不要讓酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。每次使用前還需要充分混合其中的內(nèi)溶物。4. 備用試劑盒中的瓶4溶液隨時使用。使用前恢復(fù)到室溫，每個試驗用量20uL5. 預(yù)備瓶5溶液隨時使用。注意:當(dāng)您懷疑分光光度計的準(zhǔn)確性或懷疑樣品中的物質(zhì)抑制了試驗，再使用L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控溶液進行

8、測定，通過提供的公式計算L-蘋果酸的濃度。實驗需要的設(shè)備:1. 檢測儀中提供有特定的測試用試管(平底; 16 x 100 mm)，同時我們也提供提取用試管(cat. no. G-MQTB25)2. 10 mL聚丙烯試管3. 微量移液器(20 uL).4. 連續(xù)分配器5. 玻璃刻度移液管及吸球6. MegaQuantTM測定儀7. 定時鐘注意:此方法是專門用于測定通過蘋果乳酸發(fā)酵的葡萄酒，假如葡萄酒中的L-蘋果酸濃度 0.75 g /L，需要對樣品進行稀釋。 稀釋葡萄酒或葡萄汁必須使用純凈水（蒸餾水或高質(zhì)量的水），假如使用飲用水，首先需要用D-果糖標(biāo)準(zhǔn)品驗證是否適合使用。測試用試管使用前必須清洗

9、潔凈并烘干。操作步驟:去除酚醛樹脂:(關(guān)于紅酒通常需要進行處理)取5 mL紅葡萄酒加入到10 mL的聚丙烯試管中加入1片PVPP藥片（瓶5），擰緊試管蓋，充分混合5分鐘，用Whatman No. 1 (9 cm)濾紙過濾，收集大約1 mL的濾液，濾液的顏色不能深于淺粉色（一般處理法），然而，具有深顏色的葡萄酒每5 mL需要加入2片PVPP，充分?jǐn)D壓收集濾液1 mL。取20uL濾液進行測定A. 測試方法A. (簡單法 參照圖1)取1.5 mL 溶液1( 23C或更高)和1.5 mL蒸餾水加入到測試管中，或取3.0 mL用等體積蒸餾水稀釋的溶液1（參照試劑配置方法第1點）。用提供的鑷子夾取1片藥片

10、（瓶2），充分混合1-2分鐘至完全溶解。加入20uL葡萄酒樣品經(jīng)PVPP處理的(未稀釋的紅/白葡萄酒), 未經(jīng)PVPP處理的(未稀釋的白葡萄酒)或經(jīng)稀釋的葡萄酒或葡萄汁，充分振蕩混合。大約1分鐘后，將試管插入到MegaQuantTM測定儀，按下開關(guān)直到屏幕上顯示（大約2秒鐘）。當(dāng)屏幕上出現(xiàn)“0.00”松開開關(guān)（表示A1）取下試管，加入20uL瓶3溶液（L-蘋果酸脫氫酶），充分混勻確保全部全部溶解，同時記錄時刻。再次將試管插入MegaQuantTM測定儀，5分鐘后按下開關(guān)直到屏幕上顯示1 second,記錄下數(shù)值A(chǔ)2。為了確保試劑完全反應(yīng)完全，在5分鐘內(nèi)每間隔1分鐘讀取一下數(shù)值，直到每間隔1分鐘

11、數(shù)值不再變化。（參考圖1和圖2）注意:假如數(shù)值A(chǔ)2 1.00，10倍以上稀釋樣品，并再次測定，假如數(shù)值A(chǔ)2 0.10，樣品不要進行過分稀釋（將100倍稀釋改為10倍稀釋）。由于INT對光有敏感性（顯色劑在藥片中），長時刻的反應(yīng)將導(dǎo)致溶液顏色加深，因此必須按照推舉的操作方法進行測定。在進行試驗前，瓶1提早從冰箱中取出，并恢復(fù)到室溫，假如溫度 23C，反應(yīng)過程將專門快結(jié)束。添加藥片到1.5 mL溶液1和1.52 mL蒸餾水中，確保藥片全部溶解后測定的 0 吸光度值作為空白對比，然后加入20uL 的L-蘋果酸脫氫酶（瓶3），5分鐘后測定增加的吸光度值(A2)，微小的吸光度變化(A2)是沒有意義的（如

12、由0.00到0.01）。計算:AL-蘋果酸 = 增加的吸光度值 (A2)按照常規(guī)AL-蘋果酸 的數(shù)值至少要在0.10個吸光單位，才能獲得中意的試驗結(jié)果。L-蘋果酸的含量能夠依照下列公式計算（參照圖3中的標(biāo)準(zhǔn)曲線）:未經(jīng)PVPP處理過的樣品中的L-蘋果酸濃度20uL未經(jīng)稀釋的樣品c = 0.771 x AL-蘋果酸 g/L20uL經(jīng)稀釋的樣品c = 0.771 x 稀釋系數(shù) x AL-蘋果酸 g/L經(jīng)PVPP處理過的樣品中的L-蘋果酸濃度20uL未經(jīng)稀釋的樣品c = 0.771 x AL-蘋果酸 x 102/100 g/L= 0.786 x AL-蘋果酸 g/L20uL經(jīng)稀釋的樣品c = 0.7

13、86 x 稀釋系數(shù) x AL-蘋果酸 g/L注釋:102/100 = 經(jīng)PVPP處理的葡萄酒的容差圖 1. 用分光光度儀測定(25C, 1 cm管徑)的MegaQuantTM L-蘋果酸隨時刻的變化。注意: 用此方法測定的L-蘋果酸濃度比圖3中測定的濃度要低，是由于此方法中使用的測試管管徑為1 cm，而MegaQuantTM測試管大約為1.3 cm.測試方法 B (對 “緩慢反應(yīng)”的處理)取1.5 mL 溶液1( 23C或更高)和1.5 mL蒸餾水加入到測試管中，或取3.0 mL用等體積蒸餾水稀釋的溶液1（參照試劑配置方法第1點）。用提供的鑷子夾取1片藥片（瓶2），充分混合1-2分鐘至完全溶解

14、。加入20uL葡萄酒樣品經(jīng)PVPP處理的紅葡萄酒，充分振蕩混合。大約1分鐘后，將試管插入到MegaQuantTM測定儀，按下開關(guān)直到屏幕上顯示（大約2秒鐘）。當(dāng)屏幕上出現(xiàn)“0.00”松開開關(guān)（表示A0），同時記錄時刻。取下試管5分鐘，再次插入試管按下開關(guān)直到屏幕上顯示1 second，插入試管前不要按壓按鈕，否則將導(dǎo)致測定儀讀取錯誤 ,記錄下數(shù)值A(chǔ)1（通過5分鐘由于存在緩慢反應(yīng)將導(dǎo)致顏色增深）。取下試管，立即加入20uL瓶3溶液（L-蘋果酸脫氫酶），充分混勻確保全部全部溶解，同時記錄時刻。再次將試管插入MegaQuantTM測定儀，5分鐘后按下開關(guān)直到屏幕上顯示吸光度,記錄下數(shù)值A(chǔ)2。為了確保

15、試劑完全反應(yīng)完全，在5分鐘內(nèi)每間隔1分鐘讀取一下數(shù)值，直到每間隔1分鐘數(shù)值變化不超過0.01個吸光單位。（參考圖1和圖2）計算:AL-蘋果酸 = (A2-A1) - (A1-A0)由于A0數(shù)值為0，因此能夠簡化為：AL-蘋果酸 = A2 - (2 x A1)例如（參照圖1）: A2 = 0.42；A1 = 0.02AL-蘋果酸 = 0.42 - (2 x 0.02) = 0.42 - 0.04 = 0.38按照常規(guī)AL-蘋果酸 的數(shù)值至少要在0.100個吸光單位，才能獲得中意的試驗結(jié)果。L-蘋果酸的含量能夠依照下列公式計算（參照圖3中的標(biāo)準(zhǔn)曲線）:經(jīng)PVPP處理過的樣品中的L-蘋果酸濃度20u

16、L未經(jīng)稀釋的樣品c = 0.771 x AL-蘋果酸 x 102/100 g/L= 0.786 x AL-蘋果酸 g/L20uL經(jīng)稀釋的樣品c = 0.786 x 稀釋系數(shù) x AL-蘋果酸 g/L注釋:102/100 = 經(jīng)PVPP處理的葡萄酒的容差圖 2. 用分光光度儀測定(25C, 1 cm管徑, 492nm)的MegaQuantTM L-蘋果酸隨時刻的變化。測試樣品為用PVPP處理并過濾的不同濃度的紅葡萄酒（0-18ug），加入樣品后測得A0，通過5分鐘反應(yīng)測定吸光度A1，可計算出“緩慢反應(yīng)”比率，然后加入L-蘋果酸脫氫酶（20uL）接著反應(yīng)10分鐘5分鐘后測定吸光度值A(chǔ)2，假如使用M

17、egaQuantTM測試儀進行測定，A0的吸光度值為0。制備樣品:稀釋樣品.比色杯中（如：分析20 uL的樣品）的L-蘋果酸含量必須在1.54-15ug之間，因此樣品溶液必須被充分的稀釋到濃度在0.007 -0.75 g/L之間?？赡躄-蘋果酸濃度(g/L)蒸餾水稀釋稀釋系數(shù)F 0.750.75-7.57.5-75不用稀釋1 + 91 + 99110100樣品處理事例:(a) 測定葡萄汁和白葡萄酒中的L-蘋果酸含量測定白葡萄酒和葡萄汁中的L-蘋果酸含量，樣品通常不需要處理，可直接進行測定。如有必要能夠進行稀釋。樣品處理事例:(b) 測定紅葡萄酒中的L-蘋果酸含量取5 mL紅葡萄酒加入到10 m

18、L的聚丙烯試管中，加入1片PVPP藥片（瓶5），擰緊試管蓋，充分混合5分鐘，用Whatman No. 1 (9 cm)濾紙過濾，收集大約1 mL的濾液，濾液的顏色不能深于淺粉色（一般處理法），然而，假如濾液為深紅色，還要在進行處理，但需要加入2片PVPP，充分?jǐn)D壓收集濾液1 mL。澄清的或淺粉色的濾液能夠直接進行測定。(c) 測定葡萄中的L-蘋果酸含量取200 mL蒸餾水加入到500 mL的量筒中，加入葡萄使體積剛剛超過400 mL，再加入400 mL以上的等體積蒸餾水（如: 總體積為420 mL，需另外加入蒸餾水20 mL），如此就等同于對葡萄進行了2倍稀釋，然后充分均質(zhì)3分鐘，然后用Wha

19、tman No. 1（9 cm）濾紙過濾，棄去最初的幾mL濾液，收集后來的5-10 mL濾液，稀釋后能夠直接進行測定。單個葡萄也能夠進行測定，壓碎葡萄收集葡萄汁到10 mL的量筒中，然后用等體積的蒸餾水稀釋，混合均勻后過濾，收集的提取液稀釋后能夠直接進行測定。圖 3. 用MegaQuantTM 測定儀測定的L-蘋果酸濃度(ug/每個測定)相關(guān)于吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（室溫; 505 nm）參考文獻:McCleary, B.V. and Charnock, S. J. (2005). Reagent components in tablet form for colorimetric assays o

20、f food and beverage analytes. Patent submitted.Mollering, H. (1985). L-Malate. In Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.), 3rd ed., Vol.VII, pp. 39-47, VCH Publishers (UK) Ltd., Cambridge, 驗證MegaQuantTM 測定儀和L-蘋果酸測試的精確性和可靠性:我們能夠提供用于MegaQuantTM 測定儀校驗標(biāo)準(zhǔn)，儀器參數(shù)在使用過程中不應(yīng)改變。能夠通過試劑盒中提供的L-蘋果酸質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)驗證MegaQuantTM 測定儀的準(zhǔn)確性，將樣品替換為L-蘋果酸質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)20uL，按照試驗步驟進行測定，能夠得到的吸光度(A2-A1)為0.49，假如存在差