中藥仙茅不同有效成分對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)作用的比較

1、PAGE PAGE - 3 -中藥仙茅不同有效成分對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)作用的比較最近研究表明，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有在一定條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌母細(xì)胞的強大潛能。因此如何誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分化并成功應(yīng)用于臨床成為研究熱點。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為腎主骨生髓，基于幾千年中醫(yī)臨床實踐，常以溫腎壯陽，填精益髓為治療原則，治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。前期研究結(jié)果證明，仙茅作為傳統(tǒng)溫腎壯陽之要藥，其水提物具有明確促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，但其作用核心有效成分或單體成分是什么尚屬空白。本研究選擇仙茅中多糖類和黃酮類兩大主體成分，分別對成年大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)

2、胞進(jìn)行研究，并比較兩類成分作用的差異性，為進(jìn)一步的有效單體成分研究及后期臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。1材料與方法1.1試驗材料和試劑選用2月齡SD大鼠，體重180200g，雌雄各3只（由成都中醫(yī)藥大學(xué)試驗動物中心提供）；仙茅多糖、仙茅黃酮提取物（由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，CO60照射消毒）；胎牛血清（中美蘭州民海生物公司）；胰酶（美國Amresco公司）；改良伊格爾髙糖培養(yǎng)基（DMEM）（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）（美國Gibco公司純度99.5%）；青霉素（成都制藥一廠，批號20220526）；鏈霉素（成都制藥一廠，批號20220326）；D-Hanks平

3、衡鹽溶液（美國Hyclone公司）；TriZol試劑（美國Invitrogen公司）；PCR引物NSE、GFAP，寶生物工程（大連）有限公司，引物序列及產(chǎn)物大小見表1；25cm2塑料培養(yǎng)瓶、6孔板（美國Orange公司）。1.2試驗方法1.2.1大鼠MSCs的分離與培養(yǎng)無菌條件下取出大鼠股骨，剪去股骨兩端，用含10%DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，反復(fù)離心洗滌后，收集骨髓細(xì)胞懸浮液，接種在培養(yǎng)瓶中，37、5%CO2培養(yǎng)。24小時和48小時后，完全換液，去掉未貼壁的細(xì)胞，以后每隔3天半量換液。1014天細(xì)胞接近融和，0.125%胰酶消化傳代。1.2.2定向誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元分化細(xì)胞RT-PCR樣本的

4、制作：將第3代的骨髓細(xì)胞經(jīng)記數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為1105/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞懸液3ml。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，隨機分組為仙茅多糖組、仙茅黃酮組、陽性對照藥物組二甲基亞砜（DMSO）和空白組，各2孔，先移去1.5ml培養(yǎng)液，仙茅多糖組、仙茅黃酮組、陽性對照藥物組分別加入由10%DMEM配置的1%仙茅多糖提取液、0.1%仙茅黃酮提取液、4%DMSO各1.5ml，空白組加入10%DMEM1.5ml。持續(xù)刺激72小時后。0.125%胰酶消化下細(xì)胞送檢。1.2.3誘導(dǎo)細(xì)胞鑒定1.2.3.1RT-PCR檢測以神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白神經(jīng)元烯醇酶（NSE）和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白

5、（GFAP）檢測其mRNA的表達(dá)。1.2.3.2倒置顯微鏡下觀察分別于加藥前和加藥后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。2結(jié)果2.1RT-PCR檢測對mRNA半定量測定結(jié)果經(jīng)測定，4樣本中均有NSE和GFAP表達(dá)。仙茅多糖組樣本、仙茅黃酮組樣本中NSE的mRNA表達(dá)明顯高于空白樣本，仙茅黃酮組樣本NSE表達(dá)接近DMSO樣本，但仙茅多糖組樣本明顯低于DMSO樣本。仙茅多糖組樣本中GFAP的mRNA表達(dá)量明顯高于其余3組樣本，而仙茅黃酮組樣本中GFAP的mRNA表達(dá)量明顯低于其余3組樣本（結(jié)果見表2、3）。2.2倒置顯微鏡小觀察結(jié)果仙茅多糖組樣本、仙茅黃酮組樣本和DMSO樣本在誘導(dǎo)48小時后，卵圓形細(xì)胞明顯減少，72小時后可見大量神經(jīng)元樣細(xì)胞出現(xiàn)，其