醬油渣源副干酪乳桿菌體外安全性評價

1、醬油渣源副干酪乳桿菌體外安全性評價醬油是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品，據(jù)智研咨詢發(fā)布的20222027年中國醬油行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢預(yù)測報告中報道，2022年中國醬油產(chǎn)量達(dá)700.8萬t。醬油渣是醬油釀造過程中的副產(chǎn)物，每生產(chǎn)1 kg醬油產(chǎn)生含水約75%的醬油渣0.67 kg1，即每年產(chǎn)生的醬油渣會超過469萬t，而醬油渣中含有20%30%的粗蛋白，23%左右的粗纖維，10%以上的碳水化合物等，若處理不當(dāng)是資源的巨大浪費(fèi)，也會對環(huán)境造成一定程度的污染。因此，對醬油渣的處理及利用是醬油工業(yè)發(fā)展中急需解決的問題之一。近年來，醬油渣的開發(fā)和應(yīng)用較多，如用作動物飼料、制備生物絮凝劑、提取生物活性化合物等，也有通

2、過接種特定微生物，再次發(fā)酵醬油渣，以有效降解原料中潛在有害物質(zhì)，且轉(zhuǎn)化大量基質(zhì)為有用產(chǎn)品，進(jìn)而改善醬油渣品質(zhì)的研究2。副干酪乳桿菌是乳桿菌屬中的干酪乳桿菌群，廣泛存在于發(fā)酵食品和人的口腔及腸道內(nèi)，在食品、醫(yī)療保健領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，特別是其作為商業(yè)發(fā)酵劑具有良好的發(fā)酵特性和研究價值3。如：POVEDA等4利用副干酪乳桿菌發(fā)酵奶酪，可促使奶酪中游離脂肪酸和醇類物質(zhì)增加，風(fēng)味有明顯提升。也有研究認(rèn)為，部分副干酪乳桿菌具有一定致病性，能引起敗血癥、心內(nèi)膜炎和局部感染等疾病5。由此可見，若副干酪乳桿菌作為發(fā)酵劑使用于食品，則對其進(jìn)行生物安全性評價與研究尤為必要。本實(shí)驗(yàn)室前期從醬油渣中分離鑒定得到6株副干

3、酪乳桿菌，這些菌株具有良好的生長及抗氧化特性6-7，但尚不了解其生物安全性。因此，本研究擬通過藥敏實(shí)驗(yàn)、質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)等，對已分離得到的上述6株菌的體外生物安全性進(jìn)行分析與評價，以充分挖掘利用醬油渣中的副干酪乳桿菌資源，以期為減少醬油渣資源浪費(fèi)、再次應(yīng)用于醬油渣發(fā)酵或飼料生產(chǎn)等提供科學(xué)依據(jù)。2.2 有害代謝產(chǎn)物評價2.2.1 吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析吲哚實(shí)驗(yàn)可檢測菌株能否產(chǎn)生色氨酸酶，其分解色氨酸后能生成吲哚。色氨酸是人體必需氨基酸，其代謝失調(diào)會影響色氨酸的吸收，甚至影響免疫及消化功能，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等。吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。6株副干酪乳桿菌的吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為

4、陰性，而對照菌株大腸桿菌的結(jié)果為陽性，說明6株副干酪乳桿菌不能產(chǎn)生色氨酸酶，不會引起吲哚類物質(zhì)的產(chǎn)生。這與王英等20的副干酪乳桿菌的吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。2.2.2 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析溶血是指細(xì)菌分泌的溶血素使細(xì)胞溶解的現(xiàn)象，與菌株自身致病性相關(guān)。許多革蘭氏陽性菌和陰性菌都能產(chǎn)生溶血素，作用于細(xì)胞膜后造成其結(jié)構(gòu)和功能紊亂，使細(xì)胞內(nèi)成分泄露，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。根據(jù)溶血情況可分為3類：-溶血，是指血平板菌落周圍呈現(xiàn)棕綠色，這類菌通常為條件致病菌；-溶血，是指菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈，這類菌通常具有強(qiáng)致病性，如金黃色葡萄球菌；-溶血，是指菌落周圍顯示正常血平板顏色，這類菌通常沒有致病性21。溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果見

5、圖2和表4。6株副干酪乳桿菌均有溶血性，其中表現(xiàn)為輕微溶血的菌株有2株，分別是HT31和HT111。副干酪乳桿菌HT197為無色透明圈的-溶血，被攝入人體后可能有產(chǎn)生敗血癥的風(fēng)險，因此，不能作為發(fā)酵菌株。乳酸菌出現(xiàn)-溶血的情況較少，此前IBRAHIM等22在埃及發(fā)酵乳制品中分離的乳酸菌中也發(fā)現(xiàn)了1株乳酸菌為-溶血。副干酪乳桿菌HT31、HT90、HT111、HT155、HT159均為呈棕綠色溶血圈的-溶血，乳酸菌產(chǎn)生-溶血的情況比較常見，BIN等23從多個發(fā)酵乳及牛乳中分離的乳酸菌中有30%的菌株出現(xiàn)了-溶血，MARAGKOUDAKIS等24對干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌的溶血實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)小部分菌

6、株會出現(xiàn)-溶血現(xiàn)象，因其沒有出現(xiàn)致病性高的-溶血，故上述研究者認(rèn)為這類菌株是相對安全的。由此可以得出，本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)-溶血的HT31、HT90、HT111、HT155、HT159均相對安全。表4 實(shí)驗(yàn)菌與對照菌的有害代謝產(chǎn)物評價結(jié)果Table 4 Evaluation results of harmful metabolites of experimental and control bacteria注：-陰性；+-陽性，+的數(shù)量表示程度；/-沒有進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)a-HT31；b-HT197；c-S.aureusATCC 25923圖2 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig.2 The results of hemo

7、lysis test2.2.3 氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)可以檢測菌株分解氨基酸生成生物胺的能力。精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸經(jīng)過氨基酸脫羧酶作用后分別形成精胺、尸胺和腐胺，過多的生物胺類物質(zhì)積累會引起許多副作用，如嘔吐、惡心、發(fā)燒等癥狀13。此外，各生物胺之間還可以通過抑制某些生物胺相關(guān)代謝酶的活性，使生物胺數(shù)量增加，進(jìn)而增強(qiáng)人體的不適癥狀。氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。6株副干酪乳桿菌的精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)均呈陰性，對照菌株大腸桿菌呈陽性，說明這6株菌不產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，對人體無害。此結(jié)果與徐傳標(biāo)等25的干酪乳桿菌的氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。3 結(jié)論與討論本研究通過藥敏

8、試驗(yàn)、質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)和氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)，從耐藥性檢測和有害代謝產(chǎn)物研究兩個方面對醬油渣中分離的6株副干酪乳桿菌體外安全性進(jìn)行評價。對菌株抗生素耐藥性的測定，是對現(xiàn)有的和潛在的益生菌菌株體外安全性評估的重要內(nèi)容之一。本研究采用紙片擴(kuò)散法探究了6株副干酪乳桿菌對青霉素、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素的敏感情況，結(jié)果表明，6株菌均對慶大霉素、復(fù)方新諾明表現(xiàn)為耐藥，HT31、HT90、HT155、HT159、HT197對青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素敏感，對環(huán)丙沙星中度耐藥，HT111對青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感，原因可能是副干酪乳桿菌

9、對抑制細(xì)胞壁合成酶和蛋白質(zhì)合成的藥物較為敏感15-16?？股啬退幓蚩赏ㄟ^質(zhì)粒在食品和腸道環(huán)境中發(fā)生轉(zhuǎn)移，通過質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)探究6株副干酪乳桿菌是否有攜帶耐藥基因的質(zhì)粒存在，結(jié)果表明，6株菌均不存在攜帶耐藥基因的質(zhì)粒，與之前多篇文獻(xiàn)研究結(jié)果一致19-20。綜上，6株副干酪乳桿菌對2種抗生素表現(xiàn)為抗性(慶大霉素、復(fù)方新諾明)，其中HT31、HT90、HT155、HT159、HT197對4種抗生素敏感(青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素)，對1種抗生素中度耐藥(環(huán)丙沙星)，HT111對5種抗生素敏感(青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星)，且均不攜帶耐藥質(zhì)粒。菌株的安全性研究還需對其毒性代謝產(chǎn)

10、物的產(chǎn)生予以重視。本研究通過吲哚實(shí)驗(yàn)、氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)探究了6株副干酪乳桿菌毒性代謝產(chǎn)物的生成情況，結(jié)果表明，6株副干酪乳桿菌均不產(chǎn)生色氨酸酶和氨基酸脫羧酶，不會產(chǎn)生吲哚、精胺、尸胺和腐胺等有害物質(zhì)，與之前副干酪乳桿菌相關(guān)有毒代謝產(chǎn)物研究的結(jié)果一致20,25，HT197出現(xiàn)-溶血現(xiàn)象，此前也有研究發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵食品中分離的乳酸菌會產(chǎn)生-溶血22，產(chǎn)生這種溶血現(xiàn)象的菌株安全性較低，有引起敗血癥等疾病的風(fēng)險5，其他5株菌均未出現(xiàn)-溶血現(xiàn)象。綜上，6株副干酪乳桿菌在耐藥性檢測、產(chǎn)有害代謝物吲哚、精胺、尸胺和腐胺方面相對安全，在溶血方面，HT197為-溶血，而其余5株菌沒有出現(xiàn)-溶血，因此認(rèn)為這5株菌具有良好的安全性。當(dāng)前，解決醬油渣資源浪費(fèi)問題的研究主要集中在提取其中附加值較高的物質(zhì)或用作動物飼料方面，對醬油渣中微生物的開發(fā)利用尚不足。醬油渣是醬油發(fā)酵的副產(chǎn)物，微生物種類豐富，從中篩選出性能良好并安全的菌株用作發(fā)酵劑能很大程度改善醬油渣的品質(zhì)和安全性，