紫外可見分光光度法在食品中的應(yīng)用

1、紫外可見分光光度法在食品中的應(yīng)用09 質(zhì)量 錢丹 20090803109紫外可見分光光度法是利用物質(zhì)分子對(duì)紫外可見光譜區(qū)的輻射的吸收來進(jìn) 行分析的一種儀器分析方法。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價(jià)電子和分子軌道上的電 子在電子能級(jí)間的躍遷，它廣泛用于無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的定性和定量分析。朗伯一 比耳定律（LambertBeer）是光吸收的基本定律，俗稱光吸收定律，是分光光度 法定量分析的依據(jù)和基礎(chǔ)。當(dāng)入射光波長一定時(shí)，溶液的吸光度A是吸光物質(zhì)的 濃度C及吸收介質(zhì)厚度l（吸收光程）的函數(shù)。紫外可見分光光度計(jì)是基于紫外可見 分光光度法的原理丁作的常規(guī)分析儀器。根據(jù)光路設(shè)計(jì)的不同，紫外可見分光光 度計(jì)可以分為單光

2、束分光光度計(jì)、雙光束分光光度計(jì)和雙波長分光光度計(jì)。各種 型號(hào)的紫外可見分光光度計(jì)，就其基本結(jié)構(gòu)來說，都是由5個(gè)基本部分組成，即 光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器及信號(hào)指示系統(tǒng)。這里著重介紹的是食品檢測(cè)中 應(yīng)用的上海元析紫外可見分光光度計(jì)，其使用波長范圍為1901100 nm，光譜帶 寬1 nm （固定），準(zhǔn)雙光束，紫外可見分光光度計(jì)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用當(dāng)分子中含有1個(gè)或更多的生色基團(tuán)（即具有不飽和鍵的原子基團(tuán)），輻射就 會(huì)引起分子中電子能量的改變。常見的生色基團(tuán)有：C=0, 一N=N一，一N=O，一 C；N，C=S如果2個(gè)生色基團(tuán)之間只隔1個(gè)碳原子，則形成共軛基團(tuán)，會(huì)使吸收 帶移向較長的波長處（即紅

3、移），且吸收帶的強(qiáng)度顯著增加；當(dāng)分子中含有助色基 團(tuán)（0時(shí)），也會(huì)產(chǎn)生紅移效應(yīng)。常見的助色基團(tuán)有：一OH， 一NH2，SH，一 C1，一Br，I這些基團(tuán)在食品和食品添加劑中大量存在，所以紫外分光光度 計(jì)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用有著無可比擬的優(yōu)越性，其主要用途有以下幾點(diǎn)。光度測(cè)量在食品生產(chǎn)中為了保證有顏色的飲料（如可樂、果汁及茶飲料）產(chǎn)品的顏色一 致，可以在可見光區(qū)用紫外可見分光光度計(jì)來測(cè)定其吸光度值，使色差符合產(chǎn)品 要求。在發(fā)酵業(yè)中也可通過測(cè)定吸光度值來確定產(chǎn)品的發(fā)酵完成程度。對(duì)于一些 成分比較單一的產(chǎn)品也可通過測(cè)定吸光度值來確定產(chǎn)品合格與否。比如，判定營 養(yǎng)增強(qiáng)劑維生素Bl的質(zhì)量就可以在400 n

4、m下測(cè)定其吸光度值，當(dāng)其值不超過 0. 020時(shí)，即可確定為合格品。成分的定性分析物質(zhì)的吸收光譜本質(zhì)上就是物質(zhì)中的分子和原子吸收了入射光中的某些特 定波長的光能量，相應(yīng)發(fā)生了分子振動(dòng)能級(jí)躍遷和電子能級(jí)躍遷的結(jié)果。由于各 種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況 也就不會(huì)相同，因此，每種物質(zhì)就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸 收光譜上的某些特性波長處的最大吸收峰（峰值）和波形圖來判斷某種物質(zhì)是否 存在。在食品生產(chǎn)中會(huì)使用一些食品添加劑，為了確定食品添加劑的質(zhì)量，可以 用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行光譜掃描。例如，對(duì)食品中涉及的一些復(fù)合甜味 劑、復(fù)合防腐劑和復(fù)合

5、鮮味劑等就可以用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行一個(gè)全面掃描 以排除違禁添加劑的使用。另外，此方法還可以在物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方面作為紅外光 譜（IR）、核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（Ms）等方法的輔助手段。DNA /蛋白分析DNM蛋白質(zhì)為生物大分子，所產(chǎn)生的紫外光吸收往往是其分子內(nèi)的小基團(tuán)所 引起的，例如嘌吟堿、嘧啶堿、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和肽鍵等。嘌吟堿、 嘧啶堿以及由它們參與組成的核苷、核苷酸及核酸對(duì)紫外光有強(qiáng)烈的吸收，在吸 收波長260 nm處有最大吸收值。在蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸（T、苯丙氨酸（Phe）、 色氨酸（Trp）殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，該共軛雙鍵對(duì)紫外光有吸收（其中最大吸收Tyr在吸收波長27

6、4 fiB； Phe在吸收波 長257 nm； Trp在吸收波長280 Flm），從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)對(duì)紫外光有吸收。肽鍵對(duì) 紫外光的最大吸收在吸收波長238 nm。利用這個(gè)特性可以準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定乳制 品中蛋白質(zhì)含量。紫外-可見分光光度計(jì)在食品酶分析中的應(yīng)用B一半乳糖苷酶 B一半乳糖苷酶，又稱乳糖酶（Lactase）。能水解乳 糖來降低乳制品的乳糖含量，從而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非 結(jié)晶型濃縮牛奶的生產(chǎn)及奶酪風(fēng)味的改變，同時(shí)還可用于生產(chǎn)低聚半乳糖。超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，簡(jiǎn)稱SOD）是一種十分重要的生物體防止氧化損傷的酶類，是生物體內(nèi)

7、超氧陰離子清除劑， 保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD廣泛存在于各類生物體內(nèi)，所有好氧微生物細(xì)胞中都含 有SOD。自1969年Mccord等人首次發(fā)現(xiàn)了SOD生物活性后，醫(yī)學(xué)界對(duì)其醫(yī)療作用做 了許多研究，證明它具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗缺血、提高人體免疫力等 作用，被專家稱為21世紀(jì)最有前途的藥用酶。歐美國家已開始將其應(yīng)用于醫(yī)療、 食品、保健、化妝品等領(lǐng)域。多酚氧化酶多酚氧化酶（PPO）是一類由核基因編碼在細(xì)胞質(zhì)中合成的含銅質(zhì)體的金屬酶，其作用機(jī)理在于銅的氧化-還原作用。大麥中的多酚物質(zhì) 經(jīng)過PP O的催化氧化后，具有單寧性質(zhì)，易和蛋白質(zhì)起交聯(lián)作用而沉淀出來，進(jìn) 而影響啤酒的色澤、泡沫、風(fēng)味和非生物

8、穩(wěn)定性。大麥中部分PPO以“潛伏”狀 態(tài)存在，在浸麥過程中，可通過去除一些酶抑制劑、蛋白酶作用或其他的一些方 式使其活性在浸麥過程中提高。在大麥發(fā)芽過程中，PPO的活力較高，影響著麥 芽的質(zhì)量。因此，在制麥過程中應(yīng)該降低PPO活性。葡萄糖氧化酶 上世紀(jì)60年代以前，葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工 業(yè)，除去葡萄糖，防止發(fā)生Maillard反應(yīng)，穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，延長保質(zhì)期。80年代 末，又陸續(xù)開發(fā)了去除啤酒溶解氧和瓶頸氧改善風(fēng)味延長保質(zhì)期、果汁果酒除氧 護(hù)色穩(wěn)定質(zhì)量、面粉品質(zhì)改善、海產(chǎn)品和肉類保鮮、飼料添加去氧平衡畜禽胃腸 代謝等用途，并建立了葡萄糖氧化酶專業(yè)生產(chǎn)車間。果膠酶 果膠酶可以改善葡萄酒的色

9、澤、增加酒香，并提高葡萄酒出 汁率等，對(duì)提高紅葡萄酒的品質(zhì)有重要作用。 向具塞試管中加入1.8mL0.30% 聚半乳糖醛酸溶液（用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3緩沖溶液配制，調(diào)節(jié)pH 10.0）， 于55C水浴下保溫5 min，然后加入一定稀釋倍數(shù)的酶液0.2 mL反應(yīng)15 min，加 入DNS試劑1.5 mL，混勻，在沸水中加熱10min，立即用自來水冷卻，再加入21.5 mL蒸餾水，混勻，于分光光度計(jì)上520 nm測(cè)定吸光度?？瞻子弥蠓惺Щ畹拿敢捍?替。胰a-淀粉酶 用移液管將0.5 mL酶溶液移入試管，并在水浴中調(diào)溫至 25C。加0.5 mL已同樣預(yù)熱到25C的1%淀粉

10、溶液。3 min后加1.0 mL DNS顯色劑。 置試管于沸水中5 min，冷卻后用10 mL蒸餾水稀釋。用分光光度計(jì)于540 nm處以 空白作對(duì)照測(cè)定吸光度。以0.5 mL磷酸鹽緩沖液代替酶液測(cè)定空白值。 植酸酶以植酸鈉為底物，采用釩鉬酸銨法測(cè)定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/1的植酸鈉（酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸鈉緩沖液配 制）1.0 ml，37 oC預(yù)熱5 min后，準(zhǔn)確加入適當(dāng)稀釋的酶液0.5 ml（對(duì)照組先加反 應(yīng)終止液），37 oC水浴反應(yīng)30min后，再加入4 ml反應(yīng)終止液（現(xiàn)用現(xiàn)配）冷卻至 室溫，在415 nm處測(cè)定OD值，利用無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

11、計(jì)算出酶活。羧甲基纖維素酶在0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.625%的羧甲基纖維素鈉溶液，于50C水浴中保溫30min，為口2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的 NaOH溶液終止反應(yīng)，再加入2.5mLDNS試劑，于沸水浴中煮沸15min，冷卻，在550 nm波長處比色，要求光密度讀數(shù)盡可能在標(biāo)準(zhǔn)曲線的0. 5 mg葡萄糖處。每次測(cè) 定均設(shè)立空白對(duì)照，對(duì)照管先加入0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的NaOH溶液將酶滅活，再依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.625%的底物2. 0 mL，與待測(cè)管 一起保溫，加入DNS，煮沸、冷卻、稀釋比色、與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照。木聚糖酶 木聚糖酶能水解不

12、可溶戊聚糖（阿拉伯木聚糖），使其成為 水溶性的，水解率達(dá)65%。面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能提高面團(tuán)的持水 性和機(jī)械強(qiáng)度，使面團(tuán)具有更好的持氣能力和操作耐力，進(jìn)而提高饅頭和面包的 品質(zhì)。以木聚糖為底物，用DNS法測(cè)定還原糖的生成量。取稀釋酶液0.1ml，加1% 木聚糖液0.9ml，置50C水浴保溫30min后，口DNS 2ml于沸水浴中顯色3min，用 自來水冷卻后，加蒸餾水定容25ml，測(cè)O.D值。每毫升酶液每分鐘水解木聚糖生 成1mo l木糖所相當(dāng)?shù)拿噶?。蛋白?中性蛋白酶在一定的溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含 有酚基的氨基酸,在堿性條件下，將福林試劑還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，其顏色

13、深淺 與酚基氨基酸含量成正比。通過在660 nm測(cè)定其吸光度，可得到酶解產(chǎn)生的酚基 氨基酸的量,計(jì)算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的總酶活力。a-淀粉酶 在10 mL試管中依次加入0. 5%可溶性淀粉溶液1 mL , pH2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液2. 5 mL, 40 C預(yù)熱10 min。然后加入多倍稀 釋的0. 5 mL酶液，40 C保溫5 min后，加入0. 1 mol/L H2 SO4 1 mL終止反應(yīng)。 再取2 mL反應(yīng)液與0. 5% KI - I2溶液0. 5 mL顯色，測(cè)定OD620。與淀粉梯度標(biāo) 準(zhǔn)曲線對(duì)照得反應(yīng)液淀粉濃度后,計(jì)算酶活力。脂肪酶利用脂肪酶作用后釋放出的鏈較短的脂

14、肪酸，增加和改進(jìn)食品的風(fēng)味和香味;利用脂肪酶催化的醇解和酯化反應(yīng)來生產(chǎn)各種香精酯，作調(diào)料 劑;用有專一性的微生物脂肪酶提高食用油營養(yǎng)價(jià)值和增加食用油的花色品種， 制備代可可酯等高檔油脂;另外，脂肪酶還可以用于酒類的去濁除渣、改善面包 質(zhì)量、改善蛋白的發(fā)泡等方面。漆酶3.0mL反應(yīng)液中含20 mmol/LABTS 0.7mL，酶液0.lmL和25mmol/L琥珀酸緩沖液（pH4.5），在25C下反應(yīng)2min后立即用冰浴終止反應(yīng)，測(cè)定 436nm處吸光度的增量。木質(zhì)素過氧化物酶30C條件下反應(yīng)體系中含酶液，濃度為0.2mol/L，且pH值為2.4的酒石酸緩沖液及濃度為0.008mol/L的黎蘆醇各lmL，加 人濃度為0.016mol/L的H2O2 lmL啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)最初4min內(nèi)在310nm處的吸 光度，以滅過酶活的酶