發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)

1、第三章 發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)培養(yǎng)基：是人工配制的供微生物或動(dòng)植物細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖、代謝和合成人們所需產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和原料。 廣義上講，凡是支持微生物或動(dòng)植物細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的介質(zhì)或材料都可作為培養(yǎng)基的原料。本章內(nèi)容提要： 第一節(jié) 發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的成分及分類(lèi) 工業(yè)培養(yǎng)基的成分及來(lái)源；培養(yǎng)基的分類(lèi)； 第二節(jié) 淀粉水解糖的制備及糖蜜原料的處理 淀粉水解糖的制備方法；糖蜜原料的處理； 第三節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與優(yōu)化 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)與優(yōu)化的方法第三章 發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)本章學(xué)習(xí)要求：了解發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的類(lèi)型。熟悉發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的成分及來(lái)源。 掌握淀粉水解糖的制備方法及優(yōu)缺點(diǎn)；掌握發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)和優(yōu)化的一般

2、步驟和方法。 第三章 發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)第一節(jié) 發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的成分及分類(lèi) 成分基本營(yíng)養(yǎng)源水生長(zhǎng)因子碳源氮源無(wú)機(jī)鹽和微量元素發(fā)酵調(diào)節(jié)劑一、 培養(yǎng)基的成分1、基本營(yíng)養(yǎng)源（1） 碳源作用：一是提供微生物菌體生長(zhǎng)繁殖所需的能源以及合成菌體所需的碳骨架； 二是提供菌體合成目的產(chǎn)物的原料。常用的碳源：糖類(lèi)、油脂、有機(jī)酸、烴類(lèi)及低碳醇等。（2）氮源作用：組成菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)、合成含氮代謝產(chǎn)物。常用的氮源 有機(jī)氮：黃豆/棉子餅粉、玉米漿、蛋白胨和尿素等 無(wú)機(jī)氮：銨鹽、硝酸鹽和氨水等。（3）無(wú)機(jī)鹽和微量元素作用：構(gòu)成菌體成分；作酶的組成或激活劑；調(diào)滲透壓、pH、電位等。常用的無(wú)機(jī)鹽和微量元素：P、Mg、S、

3、Fe、Na、Cl、Zn、Co、Mn等。2、水（1）作用：良好溶劑，熱導(dǎo)好；運(yùn)輸介質(zhì)；維持cell形態(tài)；水合、脫水作用（2）常用的水源：深井水、自來(lái)水及地表水（3）水質(zhì)的控制：pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量等3、生長(zhǎng)因子 有機(jī)氮源是生長(zhǎng)因子重要來(lái)源4、發(fā)酵調(diào)節(jié)劑（1）前體：指某些化合物在發(fā)酵過(guò)程中直接被微生物在生物合成時(shí)結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，其自身的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入該化合物有較大的提高。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136如在酶制劑生產(chǎn)中，有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶的分泌

4、與生產(chǎn)，也有人認(rèn)為表面活性劑對(duì)酶的表面失活有保護(hù)作用；有些促進(jìn)劑的作用是沉淀或鰲合有害的金屬離子。（2）產(chǎn)物合成促進(jìn)劑和抑制劑：指那些既非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)又不是前體，但加入后卻能提高產(chǎn)物產(chǎn)量的添加物。例如 巴比妥可增加鏈霉素產(chǎn)生菌的抗自溶能力，推遲自溶時(shí)間，增加鏈霉素積累。如酵母厭氧發(fā)酵中加入亞硫酸鹽或堿類(lèi)，可以使酒精發(fā)酵受到抑制，而轉(zhuǎn)入甘油發(fā)酵二、培養(yǎng)基的分類(lèi) 合成培養(yǎng)基按組成分 天然培養(yǎng)基 半合成培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基按物理狀態(tài)分液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基 孢子培養(yǎng)基按用途分 種子培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基第二節(jié) 淀粉水解糖的制備及糖蜜原料的處理一、 淀粉水解糖的制備 淀粉在酸或酶的作用下水解成葡萄糖的過(guò)程稱(chēng)為糖化

5、，制得的水解糖液叫淀粉水解糖。 根據(jù)原料淀粉的性質(zhì)及采用的水解催化劑的不同，水解淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖有三種方法。方法原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)酸解法以無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖簡(jiǎn)單易行；設(shè)備簡(jiǎn)單；水解時(shí)間短，設(shè)備生產(chǎn)能力大要求設(shè)備耐腐蝕、耐高溫高壓；副反應(yīng)多，轉(zhuǎn)化率低；淀粉顆粒度及濃度均低雙酶法用專(zhuān)一性很強(qiáng)的-淀粉酶和糖化酶將淀粉水解為葡萄糖反應(yīng)溫和，不需特殊設(shè)備；專(zhuān)一性強(qiáng)，副反應(yīng)少，糖液純度高；原料粗放且濃度高，轉(zhuǎn)化率高；糖色淺、質(zhì)量高酶解時(shí)間長(zhǎng)（2天3天）；設(shè)備多，需具備專(zhuān)門(mén)培養(yǎng)酶；酶本身是蛋白質(zhì)，容易引起糖液過(guò)濾困難方法原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)酸酶結(jié)合法酸酶法先將淀粉酸水解成糊精或低聚

6、糖，然后再用糖化酶將其水解為葡萄糖液化快，淀粉乳濃度高，用酸量較少，糖色淺，糖液質(zhì)量高不適合粗淀粉，要求淀粉顆粒小且均勻，糖化過(guò)程較慢，純度較雙酶法差酶酸法將淀粉乳先用-淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖可用粗淀粉，淀粉濃度較酸法高，水解副反應(yīng)少，糖色較淺液化過(guò)程較慢，對(duì)糖化設(shè)備有要求，對(duì)質(zhì)地硬的淀粉效果較差 從水解糖液的質(zhì)量及降低糖耗、提高原料利用率方面來(lái)考慮，以雙酶法最好，酸解法最差； 從制糖過(guò)程所需的時(shí)間來(lái)看，酸解法時(shí)間最短，雙酶法時(shí)間最長(zhǎng)。二、糖蜜原料的處理 糖蜜可分為甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜中主要含蔗糖。 糖蜜中干物質(zhì)的濃度很大，含5%12%的膠體物質(zhì)以及10

7、%12%的灰分，如果不進(jìn)行預(yù)處理，則微生物無(wú)法生長(zhǎng)和發(fā)酵。1. 糖蜜的預(yù)處理 預(yù)處理步驟包括稀釋、澄清、脫鈣調(diào)pH、調(diào)節(jié)金屬離子濃度等。2. 谷氨酸發(fā)酵的糖蜜預(yù)處理 一般谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基以含生物素1gL1 5gL1為宜。 糖蜜中的生物素含量為0.04gL1 10gL1，如配成含糖10%的培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基的生物素含量將達(dá)8g2000g。 解決的主要方法包括：糖蜜預(yù)處理法、添加化學(xué)藥劑法、追加糖蜜法及營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異株法等四種方法。第三節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與優(yōu)化一、發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原則（）根據(jù)微生物的特性（）根據(jù)不同用途（）注意營(yíng)養(yǎng)成分的配比（）注意代謝物的阻遏與誘導(dǎo)作用的影響（5） 滿(mǎn)足微生物的

8、培養(yǎng)條件（6） 經(jīng)濟(jì)節(jié)約二、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)與優(yōu)化的方法（1）根據(jù)以前的經(jīng)驗(yàn)以及在培養(yǎng)基成分確定時(shí)必須考慮的一些問(wèn)題，初步確定可能的培養(yǎng)基組分；（2）通過(guò)單因子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定最為適宜的各個(gè)培養(yǎng)基組分及其最適濃度；（3）最后通過(guò)多因子實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基的各種成分及其最適濃度。由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)常采用一些合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。 為提高某微生物產(chǎn)酶效果，選擇了三個(gè)有關(guān)因素進(jìn)行條件試驗(yàn)，碳源用量(A)，氮源用量(B)，無(wú)機(jī)鹽用量(C)，并確定了它們的試驗(yàn)范圍。A：1%-5% B：0.5%-1.5% C：0.03-0.07 試驗(yàn)?zāi)康氖歉闱逡蜃覣、B、C對(duì)產(chǎn)酶效果有什么影響，哪些是主要的，哪些是

9、次要的，從而確定最適培養(yǎng)基組成，即碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽用量各為多少才能使產(chǎn)酶最多。 正交試驗(yàn) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，簡(jiǎn)稱(chēng)正交設(shè)計(jì)，是試驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要組成部分。 這里，對(duì)因子A，在試驗(yàn)范圍內(nèi)選了三個(gè)水平；因子B和C也都取三個(gè)水平：A：A11%， A23% ， A3= 5%B：B10.5% ， B2 1% ， B3= 1.5% C：C10.03， C20.05%， C30.07% 當(dāng)然，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，因子可以是定量的，也可以是定性的。 定量因子各水平間的距離可以相等，也可以不相等。 這個(gè)三因子三水平的條件試驗(yàn)，通常有兩種試驗(yàn)方法。 方法一: 簡(jiǎn)單對(duì)比法 變化一個(gè)因素而固定其他因素，如首先固定B、C于B

10、1、C1，使A變化之： A1B1C1 A2 A3 (好結(jié)果) 如得出結(jié)果A3最好，則固定A于A3，C還是C1，使B變化之 B1A3C1 B2 (好結(jié)果) B3 得出結(jié)果以B2為最好，則固定B于B2，A于A3，使C變化之 C1A3B2C2 (好結(jié)果) C3 試驗(yàn)結(jié)果以C2最好。于是就認(rèn)為最好的工藝條件是A3B2C2。 這種方法也有一定的效果，但缺點(diǎn)很多。這種方法的選點(diǎn)代表性很差，如按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)點(diǎn)完全分布在一個(gè)角上，而在一個(gè)很大的范圍內(nèi)沒(méi)有選點(diǎn)。因此這種試驗(yàn)方法不全面，所選的工藝條件A3B2C2不一定是27個(gè)組合中最好的。方法二: 全面試驗(yàn)法 取三因子所有水平之間的組合，即A1B1C1

11、，A1B1C2，A1B2C1， ，A3B3C3，共有33=27次試驗(yàn)。用圖表示就是圖1 立方體的27個(gè)節(jié)點(diǎn)。這種試驗(yàn)法叫做全面試驗(yàn)法。 全面試驗(yàn)對(duì)各因子與指標(biāo)間的關(guān)系剖析得比較清楚。 但試驗(yàn)次數(shù)太多。 如果應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)法，只做9次試驗(yàn)就行了，而且在某種意義上講，這9次試驗(yàn)代表了27次試驗(yàn)。 特別是當(dāng)因子數(shù)目多，每個(gè)因子的水平數(shù)目也多時(shí)，試驗(yàn)量大得驚人。如選六個(gè)因子，每個(gè)因子取五個(gè)水平時(shí)，欲做全面試驗(yàn)，則需5615625次試驗(yàn)，這實(shí)際上是不可能實(shí)現(xiàn)的。 如果應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)法，只做25次試驗(yàn)就行了， 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本特點(diǎn)是：用部分試驗(yàn)來(lái)代替全面試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)部分試驗(yàn)結(jié)果的分析，了解全面試驗(yàn)的情況。

12、如對(duì)于上述3因素3水平試驗(yàn)，可利用正交表L9(34)安排實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)方案僅包含9個(gè)水平組合，就能反映試驗(yàn)方案包含27個(gè)水平組合的全面試驗(yàn)的情況，找出最佳的生產(chǎn)條件。 我們看到，在9個(gè)平面中每個(gè)平面上都恰好有三個(gè)點(diǎn)而每個(gè)平面的每行每列都有一個(gè)點(diǎn)，而且只有一個(gè)點(diǎn)，總共九個(gè)點(diǎn)。 這樣的試驗(yàn)方案，試驗(yàn)點(diǎn)的分布很均勻，試驗(yàn)次數(shù)也不多。La（bc）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總次數(shù)，行數(shù)因素水平數(shù)因素個(gè)數(shù)，列數(shù)等水平正交表 La（bc） 正交表 表10-2是一張正交表，記號(hào)為L(zhǎng)8(27)。 其中“L”代表正交表；L右下角的數(shù)字“8”表示有8行 ，用這張正交表安排試驗(yàn)包含8個(gè)處理(水平組合) ； 括號(hào)內(nèi)的底數(shù)“2” 表示因素

13、的水平數(shù)， 括號(hào)內(nèi)2的指數(shù)“7”表示有7列 ， 用這張正交表最多可以安排7個(gè)2水平因素。 L9(34)正交表 常用的正交表已由數(shù)學(xué)工作者制定出來(lái)，供進(jìn)行正交設(shè)計(jì)時(shí)選用。 2水平正交表除L8(27)外，還有L4(23)、L16(215)等；3水平正交表有L9(34)、L27(313)等（詳見(jiàn)有關(guān)參考書(shū)）。1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本程序 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本程序包括試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果分析兩部分。明確試驗(yàn)?zāi)康呐c要求選定試驗(yàn)指標(biāo)選因素、定水平因素、水平確定選擇合適正交表表頭設(shè)計(jì)列試驗(yàn)方案試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：試驗(yàn)結(jié)果分析進(jìn)行試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果極差分析計(jì)算K值計(jì)算k值計(jì)算極差R繪制因素指標(biāo)趨勢(shì)圖優(yōu)水平因素

14、主次順序優(yōu)組合結(jié) 論試驗(yàn)結(jié)果分析：試驗(yàn)結(jié)果方差分析列方差分析表，進(jìn)行F 檢驗(yàn)計(jì)算各列偏差平方和、自由度分析檢驗(yàn)結(jié)果，寫(xiě)出結(jié)論1.1 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 例：為提高微生物產(chǎn)酶效率，研究發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成，擬通過(guò)正交試驗(yàn)來(lái)尋找液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基組成。（1） 明確試驗(yàn)?zāi)康模_定試驗(yàn)指標(biāo) 對(duì)本試驗(yàn)而言，試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱颂岣弋a(chǎn)酶效率。所以可以以單位發(fā)酵液的酶活力為試驗(yàn)指標(biāo)，來(lái)評(píng)價(jià)培養(yǎng)基條件的好壞。酶活越高，培養(yǎng)基組成就越好。 根據(jù)專(zhuān)業(yè)知識(shí)、以往的研究結(jié)論和經(jīng)驗(yàn)，從影響試驗(yàn)指標(biāo)的諸多因素中，通過(guò)因果分析篩選出需要考察的試驗(yàn)因素。一般確定試驗(yàn)因素時(shí)，應(yīng)以對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響大的因素、尚未考察過(guò)的因素、尚未完全掌握

15、其規(guī)律的因素為先。 試驗(yàn)因素選定后，根據(jù)所掌握的信息資料和相關(guān)知識(shí)，確定每個(gè)因素的水平，一般以2-4個(gè)水平為宜。對(duì)主要考察的試驗(yàn)因素，可以多取水平，但不宜過(guò)多（6），否則試驗(yàn)次數(shù)驟增。因素的水平間距，應(yīng)根據(jù)專(zhuān)業(yè)知識(shí)和已有的資料，盡可能把水平值取在理想?yún)^(qū)域。（2） 選因素、定水平，列因素水平表 對(duì)本試驗(yàn)分析，影響產(chǎn)酶的因素很多，如碳源種類(lèi)及用量、氮源種類(lèi)及用量、無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及用量、培養(yǎng)基pH 值、培養(yǎng)溫度、接種量、搖瓶轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間等等。經(jīng)全面考慮，最后確定碳源用量、氮源用量、無(wú)機(jī)鹽和微量元素為本試驗(yàn)的試驗(yàn)因素，分別記作A、B、C和D，進(jìn)行四因素正交試驗(yàn)，各因素均取三個(gè)水平，因素水平表見(jiàn)表1所示。

16、 水平試驗(yàn)因素蔗糖（g/100mL）A蛋白胨（g/100mL）BNaCl（g/100mL）CFeSO4 （g/100mL）D110.50.030.0012310.050.002351.50.070.004表1 因素水平表 正交表的選擇是正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的首要問(wèn)題。確定了因素及其水平后，根據(jù)因素、水平及需要考察的交互作用的多少來(lái)選擇合適的正交表。正交表的選擇原則是在能夠安排下試驗(yàn)因素的前提下，盡可能選用較小的正交表，以減少試驗(yàn)次數(shù)。 一般情況下，試驗(yàn)因素的水平數(shù)應(yīng)等于正交表中的水平數(shù)；因素個(gè)數(shù)應(yīng)不大于正交表的列數(shù)。（3） 選擇合適的正交表 此例有4個(gè)3水平因素，可以選用L9(34)或L27(313)

17、 ；因本試驗(yàn)僅考察四個(gè)因素對(duì)液化率的影響效果，故宜選用L9（34）正交表。若要考察交互作用，則應(yīng)選用L27(313)。 所謂表頭設(shè)計(jì)，就是把試驗(yàn)因素分別安排到正交表的各列中去的過(guò)程。 各因素可隨機(jī)安排在各列上。 此例中，可將蔗糖用量(A)、蛋白胨用量(B)、NaCl(C)和FeSO4（D）依次安排在L9(34)的第1、2、3、4列上，見(jiàn)表2所示。（4） 表頭設(shè)計(jì)列號(hào)1234因素ABCD表2 表頭設(shè)計(jì) 把正交表中安排各因素的列（不包含欲考察的交互作用列）中的每個(gè)水平數(shù)字換成該因素的實(shí)際水平值，便形成了正交試驗(yàn)方案（表3）。（5）編制試驗(yàn)方案，按方案進(jìn)行試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)號(hào)因 素ABCD11

18、1112122231333421235223162312731328321393321表3 試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：試驗(yàn)號(hào)并非試驗(yàn)順序，為了排除誤差干擾，試驗(yàn)中可隨機(jī)進(jìn)行； 安排試驗(yàn)方案時(shí)，部分因素的水平可采用隨機(jī)安排。（1）（3）（5）（1）（1.5）（0.5）（0.05）（0.03）（0.07） (0.005) (0.002) (0.001)試驗(yàn)結(jié)果（酶活，U/mL）0172412472811842Kjm，kjm 計(jì)算簡(jiǎn)便，直觀，簡(jiǎn)單易懂，是正交試驗(yàn)結(jié)果分析最常用方法。以上例為實(shí)例來(lái)說(shuō)明極差分析過(guò)程。 2 正交試驗(yàn)的結(jié)果分析2.1 直觀分析法極差分析法極差分析法R法1. 計(jì)算2. 判斷Rj因素主次優(yōu)水平優(yōu)組合4681 26 43表4 試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)正交設(shè)計(jì)的特性，對(duì)A1、A2、A3來(lái)說(shuō)，三組試驗(yàn)的試驗(yàn)條件是完全一樣的（綜合可比性），可進(jìn)行直接比較。如果因素A對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)無(wú)影響時(shí)，那么kA1、