綜述-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在代謝組學中的應(yīng)用進展

1、高效液相色譜頃譜聯(lián)用技術(shù)在代謝組學中的應(yīng)用進展摘要：代謝組學是對一個生物系統(tǒng)的細胞在給定時間和條件下所有小分子代謝物質(zhì)的定性定量分析, 從而定量描述生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其對內(nèi)因和外因變化應(yīng)答規(guī)律的科學。而高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)作為代謝組學中一種重要的分離檢測方法，在代謝組學中有著方方面面的應(yīng) 用。本文介紹代謝組學中的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，并從藥物分析、生理病理代謝、臨床診斷 標志物和細胞鑒定等方面介紹高效色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在代謝組學中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；代謝組學代謝組學的研究目的就是從尿液、血漿、 血清、唾液和膽汁等生物體終端樣本中檢測

2、代 謝物，或跟蹤代謝水平整體的動態(tài)變化，提取 “組學”信息，以此來反映生物體在外源刺激作 用下的體內(nèi)生物學過程變化情況。代謝組學研究 的基本流程包括樣品采集、預處理、代謝組分析、 數(shù)據(jù)分析以及研究結(jié)果的解釋與應(yīng)用等。1.檢測工具其中的樣品采集分離與分析離不開分離檢 測工具。常用的分離檢測工具包括色譜 (Chromatography)、質(zhì)譜(Mass Spectrometry， MS)、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance， NMR)等?！?】1.1核磁共振(NMR)NMR快速、選擇性好，其樣品處理簡單且不造 成破壞，只要含氫的代謝物都可以被檢測，即可 以對所有的分析對

3、象達到無歧視分析。對樣品無 損傷且重復性好，能夠廣泛應(yīng)用于藥物工業(yè)和病 人的尿、血樣分析。樣本制備簡單且易自動化。 但是復雜混合物的NMR譜的解析非常困難。對全 面的代謝譜圖分析，NMR最大的缺陷是靈敏度相 對較低，從而使得它不適合分析大量的低濃度 代謝物。【2】所需硬件投資也比較大1.2 色譜(Chromatography)氣相色譜(Gas Chromatography，GC)廣泛用 于微量、痕量組分的分析。但是，氣相色譜受組 分揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，需對樣品進行衍生 化處理。液相色譜(LiquidChromatography，LC)主要 是指高效液相色譜(HighPerformance

4、Liquid Chromatography，HPLC)，液相色譜不受樣品揮 發(fā)性的約束，適用范圍較廣，尤其適用于揮發(fā)性 低、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。1.3 質(zhì)譜(Spectrometry)質(zhì)譜(Mass Spectrometry)是一種與光譜 并列的譜學方法，通過制備、分離、檢測來鑒定 化合物。質(zhì)譜法在一次分析中可提供豐富的結(jié)構(gòu) 信息，將分離技術(shù)與質(zhì)譜法相結(jié)合是分離科學方 法中的一項突破性進展。在眾多的分析測試方法 中，質(zhì)譜學方法被認為是一種同時具備高特異性 和高靈敏度且得到了廣泛應(yīng)用的普適性方法。1.4色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)當液相色譜或氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用時，分析 范圍很廣，已成為重要的檢測手段。色譜與

5、質(zhì)譜 聯(lián)用能夠使使樣品的分離、定性、定量一次完成， 且具有較高的靈敏度和選擇性。常用的聯(lián)用技術(shù) 包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry， GC-MS) 和液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry， LC-MS) 等?！?】1.4.1氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)采用G -MS可以同時測定幾百個化學性質(zhì)不 同的化合物，包括有機酸、大多數(shù)氨基酸、糖、 糖醇、芳胺和脂肪酸，具有分辨率高、峰容量大、 靈敏度高及分析時間短等優(yōu)勢，有利于微量物質(zhì) 的分析另外，GC-MS最大的優(yōu)勢是有大量可檢索

6、 的質(zhì)譜庫。1.4.2液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)相對于GC-MS，LC-MS能分析更高極性和更 高相對分子質(zhì)量的化合物。LC-MS的一個很大的 優(yōu)勢是， 它大多數(shù)情況下不需要對非揮發(fā)性代 謝物進行化學衍生。過去10年，LC-MS技術(shù)中的 軟電離方式使得質(zhì)譜儀更加完善和穩(wěn)健，尤其 是最近幾年，整體式毛細管柱和超高效液相色 譜(UPLC)在分離科學中的應(yīng)用為復雜的生物混 合物提供了更好的分離能力；另一方面，現(xiàn)代離 子阱多級質(zhì)譜儀的發(fā)展使LC-MS可提供未知化合 物的結(jié)構(gòu)解析信息，因此LC-MS在代謝組學研究 中越來越受青睞。1.4.3優(yōu)缺點比較氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)需要先對 樣品進

7、行衍生化預處理，這一步驟耗時而且容易 引起樣品的變化。受此限制，GC-MS技術(shù)不能分 析難揮發(fā)性物質(zhì)熱、不穩(wěn)定物質(zhì)和一些大分子的 代謝產(chǎn)物而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)是具有 高效、快速分離效能的LC技術(shù)與靈敏、準確的MS 技術(shù)或MSn技術(shù)的結(jié)合，被廣泛應(yīng)用于難揮發(fā)性 化合物、極性化合物、熱不穩(wěn)定化合物和大分子 化合物(包括蛋白質(zhì)、多肽、多糖、多聚物等) 的分析，既可定性，也可定量。LC-MS聯(lián)用與GS-MS 聯(lián)用相比，更適合那些穩(wěn)定、不易衍生化、不易 揮發(fā)或分子量較大的化合物?！?】高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)始于20世紀 70年代，HPLC可以直接分離不揮發(fā)性化合物、 極性化合物和大

8、分子化合物(包括蛋白質(zhì)、多肽、 多糖和多聚物等)；MS靈敏度高，樣品用量少， 分析速度快，可得到更多的化合物的結(jié)構(gòu)信息。 分析的化合物多數(shù)直接進樣在HPLC上得到分離， 然后在MS上獲得準確的定性和定量，從而大大地 縮短了分析時間，提高了分析的靈敏度和準確性。 1.5高效液相色譜-質(zhì)譜分類根據(jù)數(shù)據(jù)采集方式的不同可分為：傳統(tǒng)高 效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用(conventional highperformance liquid chromatography-mass spectrometry conventional HPLC- MS)毛細管 HPLC- MS(capillary HPLC- MS)超

9、高效液相色譜 和質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-performance liquid chromatographyUPLC- MS )聯(lián)機多維 HPLC- MS(on-li nemultidimensional high-performancechromatographymethod for metabolomics )四類?！?】傳統(tǒng)HPLC- MS具備HPLC- MS的一般特點，毛 細管HPLC- MS具備HPLC的分離程度、高峰容量、 高信噪比及需要檢驗樣品量少等優(yōu)點。UPLC- MS 可提高檢驗速率，從而大大降低離子壓抑作用， 并且檢驗敏感性及檢驗效能得到一定的提高，聯(lián) 機多維HPLC- MS進

10、一步實現(xiàn)樣本檢測自動化，有 選擇性進行樣品初步分離及分析。2 HPLC-MS在代謝組學中的應(yīng)用2.1藥物分析2.1.1中藥成分檢驗、中藥指紋圖譜中藥是一個多成分(包括有機成分、微量元 素成分及其絡(luò)合物成分)的復雜體系，并具有多 效性和整體的平衡調(diào)節(jié)性。由多種化學成分不同 的中藥配伍組合，達到最佳藥效是中藥在治療疑 難雜癥方面具有獨特療效的優(yōu)勢所在?！?】由 于含有的化學成分往往種類眾多、結(jié)構(gòu)復雜、含 量低，相當一部分穩(wěn)定性差，采用常規(guī)的分離鑒 定技術(shù)，難度較大。使用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)分析 這種相對難以處理的中草藥樣品，只需進行簡單 的預處理或樣品衍生化，而且測試過程高效快速， 檢測結(jié)果靈敏

11、度高。中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑 經(jīng)適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能 夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖，它是一種 綜合的，可量化的鑒定手段?！?】作為分離和測定中藥材和中成藥的有效成 分、活性成分或主要成分的先進手段，中藥指紋 圖譜的建立將促進我國中藥質(zhì)量的標準化和規(guī) 范化【6】六味地黃丸是應(yīng)用中藥復方治療疾病的經(jīng) 典名方之一。研究結(jié)果表明六味地黃丸在改善人 體亞健康狀態(tài)，提高免疫力，治療腫瘤、糖尿病 等復雜慢性疾病方面，具有比西藥更為獨特的優(yōu) 勢。BaogangXie等建立了基于高效液相色譜紫外 檢測器(HPLC-uV)聯(lián)用技術(shù)的大鼠尿液指紋圖 譜方法，通過對該方法的優(yōu)化后

12、發(fā)現(xiàn)該方法具有 較好的重復性。結(jié)果表明給藥組(六味地黃丸， 50%乙醇提取物)和角叉菜致炎癥模型組具有不 同的代謝表型，說明此技術(shù)可用于代謝組學研究?！?】段天璇等測定甘草甲醇提取物的HPLC-DAD 及HPLC-MS指紋圖譜。結(jié)合文獻對指紋圖譜主要 色譜峰進行鑒定，推斷出17個色譜峰中19個可 能的成分，給甘草質(zhì)量評價等各類研究提供較全 面的化學依據(jù)?！?0】林澤彬等使用UPLC-Q-TOF/MS分析方法對口 服復方丹參片的大鼠生物樣品進行分析研究。確 定體內(nèi)14種為復方丹參片的原型化合物，8個為 其代謝產(chǎn)物。【11】2.1.2藥物研究開發(fā)中的應(yīng)用快速發(fā)展的藥物研發(fā)對分析手段的效率和 可靠性

13、提出了更高的要求。藥物直接或通過某些 代謝渠道間接產(chǎn)生的代謝物積累可能造成毒理 終點的產(chǎn)生；【8】另外，藥物通過代謝產(chǎn)生的 物質(zhì)進入血液，進而分布到一些組織器官發(fā)揮作 用，也可能形成毒性作用。而這種造成的生化改 變是LC-MS技術(shù)所可以檢測到的。利用液質(zhì)聯(lián)用 技術(shù)對藥物及其代謝物的分離、鑒定、體內(nèi)體外 代謝的比較、代謝途徑的追蹤，可以用于研究藥 物對人體發(fā)揮作用、對機體傷害以及新藥研制過 程中的鑒定。浙江大學附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重 點實驗應(yīng)用線性梯度的超高效液相色譜飛行時 間質(zhì)譜在正離子模式下對藥物性肝損害患者的 血清進行分析，對獲取的數(shù)據(jù)應(yīng)用主成分分析 (PCA)、正交偏最小二乘法聚類

14、分析法(OPLS)進 行模式識別，用基于超高效液相色譜質(zhì)譜的代謝 組學方法分析藥物性肝損害患者血清當中小分 子代謝物質(zhì)，與正常對照組相比，發(fā)現(xiàn)藥物性損 害患者血清當中甘氨鵝去氧膽酸、甘氨膽酸的濃 度顯著升高，還發(fā)現(xiàn)藥物性肝損害患者血清脂肪 酰胺類濃度的顯著變化，油酰胺血清濃度明顯降 低，而十四酰胺、硬脂酰胺血清濃度顯著升高?！?2】Wagner等采用LC- MS技術(shù)研究男性和女性 患者口服阿司匹林的代謝差異；Sun【13】等 通過LCMS進行兒茶酚氧位甲基移位酶抑制劑在 大鼠體內(nèi)代謝輪廓分析，為藥物的藥理毒理研究 提供依據(jù)；Zhao【14】等通過LC- MS技術(shù)檢測 小鼠服用傳統(tǒng)中藥后代謝物改

15、變。2.1.3藥物代謝在研究藥物代謝中的應(yīng)用藥物代謝是研究 藥物進入人體后，在體液、酶等的作用下進行的 生化反應(yīng)過程。對藥物代謝的研究，可以進行藥 物代謝、藥代動力學方面的研究。戴偉東等通過構(gòu)造大鼠過度疲勞模型，并分 別用通心絡(luò)和人參進行干預，采用快速液相色譜 -離子阱飛行時間質(zhì)譜獲取大鼠血漿代謝輪廓， 并用正交偏最小二乘法進行多變量統(tǒng)計分析，找 出用于區(qū)分通心絡(luò)和人參干預組大鼠同正常對 照組大鼠，過度疲勞組大鼠的重要差異代謝物。 顯示過度疲勞大鼠體內(nèi)色氨酸、膽汁酸等代謝通 路發(fā)生較大變化，經(jīng)通心絡(luò)或人參干預的大鼠整 體代謝輪廓趨向正常水平，并能部分調(diào)節(jié)上述發(fā) 生變化的代謝通路使之往正常方向變

16、化?！?5】 2.2病理學研究2. 2.1異常代謝標志物肌體任何部位出現(xiàn)異常，在體液組成上都會 有所反映。因此，由于病理原因造成的代謝紊亂 同樣也在LC-MS的檢測范圍之內(nèi)?！?】糖代謝異常(AGM)包括糖尿病(DM)和糖調(diào)節(jié) 異常(IGR)。趙素敏等利用LC-MS聯(lián)用技術(shù)對糖代 謝異常分別進行了代謝組學和磷脂輪廓分析，研 究了糖代謝異常中的兩個階段一空腹血糖受損 和初診糖尿病的代謝差異情況，找到了相應(yīng)的代 謝差異性化合物。【16】張潔等以糖尿病患者、糖尿病腎病患者和正 常人的血清為研究對象，采用超高效液相色譜一 飛行時間質(zhì)譜建立其代謝指紋圖譜，并結(jié)合主成 分分析進行模式識別，實現(xiàn)患者和正常人

17、的區(qū)分， 并試圖發(fā)現(xiàn)潛在的標志物。經(jīng)代謝物數(shù)據(jù)庫中檢 索和結(jié)合二級質(zhì)譜和標準品對照，鑒定出4 一羥 雙氫鞘氨醇(Phytosphingosine)和二氫鞘氨醇 (Dihydmsphingosine)。實驗結(jié)果表明，實驗結(jié) 果表明，DM和DN患者血清中4-羥雙氫鞘氨醇和二 氫鞘氨醇含量明顯降低。【17】而馬文峰等通過超高效液相色譜四級桿飛 行時間質(zhì)譜(UPLC Q TOF-MS)技術(shù)分析高尿酸血 癥患者(高尿酸血癥組)和健康者(對照組)血漿 代謝物圖譜，采用MarkerLynx XS軟件對原始數(shù) 據(jù)進行校正和歸一化處理，應(yīng)用SIMCA P+12. 0. 1軟件對樣品進行分組并采用正交信號 校正和

18、偏最小二乘法判別分析，根據(jù)檢驗結(jié)果篩 選出差異性代謝物。確認了6種化合物為區(qū)分高 尿酸血癥與健康人的潛在的血漿差異性代謝標 志物?！?8】2.2.2癌癥臨床診斷標記物生命的代謝是一個永不停息的過程，腫瘤的 發(fā)生和發(fā)展都會影響機體的代謝，從而導致體液 中的代謝物質(zhì)發(fā)生變化，以對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程 中的所有代謝物進行定性和定量分析，并能識別 未知代謝產(chǎn)物，【19】建立對整個代謝途徑的描 述，闡明代謝途徑的調(diào)控機制和關(guān)鍵調(diào)控點，對 臨床腫瘤的診斷有重要意義，也有助于對腫瘤發(fā) 病機制的揭示。余欣慰等使用高效液相色譜-四極桿飛行時 間質(zhì)譜采用HPLC-MS技術(shù)對7種人肺癌細胞 H358、 A549、 HC

19、C827、 H1299、 Calu-3、 Calu-1、 PC-9及人正常胚肺成纖維細胞MRC-5進行分析， 獲得了8種細胞的代謝物圖譜?！?0】對肺癌細 胞與正常細胞的極性與非極性代謝物進行指紋 圖譜分析的結(jié)果顯示，與正常細胞相比，腫瘤細 胞存在異常的蛋白質(zhì)、脂肪酸、磷脂代謝，并發(fā) 現(xiàn)了10種極性代謝差異物與21種非極性代謝 差異物。和紅兵等利用LCMS和GCMS對健康人、良 性口腔腫瘤患者以及惡性口腔腫瘤患者的血漿、 尿液和唾液進行代謝輪廓分析，并應(yīng)用多元統(tǒng)計 分析方法對3組人群進行區(qū)分，結(jié)果認為，與健 康人相比，良性和惡性口腔腫瘤患者都存在能量 代謝紊亂，脂類代謝失衡，但惡性口腔腫瘤患者

20、 還表現(xiàn)出三羧酸循環(huán)和肌醇代謝異常?！?1】找 到并鑒定出19個差異代謝物。2.3.其他方面2.3.1確定細胞種屬分類細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物可以反映細胞的生理狀 態(tài)，組織學可以根據(jù)鏡下細胞大小，所含顆粒以 及染色特征等對細胞進行分類。而將代謝組學方 法用于細胞分類鑒別，與傳統(tǒng)方法是一種潛在的 具有應(yīng)用前景的技術(shù)方法。栗暉等利用液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)開展 了人肝癌HepG一2細胞、宮頸癌Hela細胞、胚腎 293T細胞、鼠脂肪3T3細胞和鼠前脂肪3T3 L1細 胞的代謝組學研究，獲得了5種細胞胞內(nèi)代謝物 的指紋圖譜【22】結(jié)果顯示5種細胞在主成分分 析的模式識別結(jié)果中可以完全區(qū)分，提出了一種 鑒定細胞

21、分類的新思路。方向由于“更快、更好的得到分析檢驗結(jié)果”要 求的提出，超高效液相色譜技術(shù)應(yīng)運而生， Waters公司在傳統(tǒng)HPL C系統(tǒng)基礎(chǔ)上開發(fā)的超高 效液相色譜，相比傳統(tǒng)的高效液相色譜HPLC， UPLC具有高分離度高速度和更高的靈敏度。UPLC能提高柱效N，從而使峰寬w變的更窄， 而峰高卻增加了，同時，由于UPLC運用了更短的 柱子(柱長L更小)，進一步增加了峰高于是在 柱效下相同情況下，能分別提供更高的靈敏度。 因此，超高效液相色譜技術(shù)更為高效、便捷。結(jié)語液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將色譜的高分離性 能和質(zhì)譜的高鑒別特點能力相結(jié)合，實現(xiàn)了兩者 優(yōu)點的融合。相信隨著技術(shù)的不斷改進與發(fā)展， 高效液

22、相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)必將在代謝組學的 研究領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。參考文獻李文慧，陶飛，許平HPLC在醫(yī)學代謝組學中 的應(yīng)用，廣州化工，2012.7 ,第40卷第3期： 14-16.盧紅梅，梁逸曾，代謝組學分析技術(shù)及數(shù)據(jù) 處理技術(shù)，分析測試學報，2008.3,第27卷第3 期：325-332.齊小城，章弘揚，梁瓊麟，王義，羅國安，液質(zhì) 聯(lián)用技術(shù)及其在代謝組學研究中的應(yīng)用，中成 藥，2010.01，第31 卷第 1 期：106-112.黃強,尹沛源，路鑫，孔宏偉,許國旺，色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在代謝組學中的應(yīng)用，色譜， 2010.9，第27卷第5期：566-572.蘇翠紅，液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及

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