木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表達載體的構建

1、木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表達載體的構建【摘要】目的克隆木薯醇腈酶HNLDNA構建表達載體，以實現(xiàn)木薯醇腈酶基因的高效表達。方法運用RT-PR從木薯幼葉組織中擴增出HNL全長DNA序列，將其克隆至質粒pBluesriptSK中進展序列分析，再利用PR將其再克隆到酵母表達質粒pPI3.5K上。結果經測序分析說明，克隆的DNA片段和文獻報道的4個木薯HNLDNA相比，核苷酸同源性最高為99.1%，氨基酸同源性最高為98.8%。結論經雙酶切鑒定的結果說明重組表達載體的表達載體構建成功?！娟P鍵詞】木薯；醇腈酶；甲醇酵母；表達載體Abstrat：bjetiveTstudythelningftheDNA

2、f-HNLandtheexpressinvetrnstrutintrealizehighlyeffiientexpressininNLgene.ethdsThelng-lengthsequenefDNAf-HNLasaplifiedbyRT-PR,thenitaslnedintpBluesriptSKandanalylizdinitssequene.Finall,theDNAaslnedintanexpressinvetrpPI3.5KbyPR.ResultsThesequeningresultftheDNAshedthatthesequeneendedfrtheHNLasntfullynsi

3、stentiththsepublished.ThefullsequenesanalysisdenstratedthatthehighesthlgyfDNAsequeneisabut99.1%andthehighesthlgyfainaidsequeneisabut98.8%tthsefurreprtedHNLgenesfrassava.nulsinDegestindetetinfpPI3.5K-HNLshedthatnstrutinfrebinatinexpressinvetrassuessful.Keyrds:avassa；Hydrxynitrilelyase；Pihiapastris；ex

4、pressinvetr手性化合物中不同立體異構體具有不同的生理活性，許多醫(yī)用藥品要求必須是單一性化合物，不僅藥效可進步，更為重要的是副作用校因此，研究和開發(fā)手性藥物具有廣泛的市場需求。醇腈酶-Hydrxynitrilelyase,E.4.1.2.10，HNL作為一種生物催化劑，能可逆的催化由HN和醛或酮生成手性氰醇1，2，從而克制了由于光學拆分而造成的本錢較高的缺點。以工業(yè)消費扁桃腈為例，傳統(tǒng)方法是以苯甲醛為原料，與無水HN反響后得到dl-扁桃腈，再進展光學拆分成為單一化學物，而采用HNL作為該反響的催化劑，直接催化HN添加到醛或酮上，形成相應的具有光學活性的氰醇，從而實現(xiàn)扁桃腈的不對稱合成，

5、大大降低了消費本錢，反響生成的光學活性氰醇還可轉化成羥基化合物、胺化合物、羧基化合物等多種重要的手性中間體3，后者可進一步轉化成多種手性藥物。現(xiàn)已證實3000多種植物體內含有HNL。相關研究主要集中在木薯、三葉膠以及薔薇科的幾種植物中4，來自薔薇科植物的HNL可催化R-型氰醇化合物的合成；木薯、三葉膠中的HNL那么立體專一性催化脂肪族、芳香族和雜環(huán)族型羥腈化合物的合成5。從自然界中直接獲取型醇腈酶不僅得率低，且純化較難。因此，采用基因工程技術獲得大量HNL以滿足工業(yè)消費的需求，具有非常重要的經濟意義，并有助于HNL的根底研究。通過RT-PR方法從木薯幼葉組織的總RNA中擴增出一種HNL基因的D

6、NA序列。序列分析說明，與DNA數(shù)據(jù)庫公布的已有木薯HNL編碼序列不完全一致。將其克隆至表達質粒pPI3.5K中，構建重組表達載體，為下一步在甲醇酵母中實現(xiàn)高效表達，深化研究其作用機理以及開展工業(yè)消費奠定了基矗1材料和方法1.1材料1.1.1植物材料木薯采自中國海南瓊海，取當天采集的新穎木薯的幼嫩葉子提取RNA。1.1.2菌種和質粒表達質粒pPI3.5K購自Invitrgen公司；大腸桿菌(E.liJ109),質粒BluesriptSK(pBS)由本實驗室保存。1.1.3酶和試劑RT-PR試劑盒、RNA提取試劑盒、DNA連接試劑盒購自上海華舜生物工程；抗生素G418購自Sigia公司；限制酶、

7、TaqDNA聚合酶，其它抗生素等分別購自華美生物工程公司、Prega等公司；其他化學試劑均為國產分析純或進口分析純。1.1.4培養(yǎng)基LB，LA，SB，S培養(yǎng)基均按Invitrgen公司操作手冊推薦方法配制。1.2方法1.2.1基因操作質粒DNA的制備、限制酶切、連接反響、細菌轉化、凝膠電泳、DNA片段的回收等，參照文獻6或按供給商提供的相關說明操作。1.2.2木薯幼葉組織總RNA的提取取木薯新穎幼葉，用液氮研磨34次，用RNA提取試劑盒提取總RNA。1.2.3RT-PR擴增HNLDNA根據(jù)Haughes7等報道的木薯醇腈酶DNA序列設計RT-PR引物，由上?；瞪锖铣?。其中上游引物設計ER酶

8、切位點，下游引物引入BaH酶切位點，詳細序列如下:aattttg-3gatag-3RT-PR那么參照試劑盒說明書按以下方法進展：5030in合成DNA第一鏈后，直接參加試劑盒提供的專一性TaqDNAplyerase進展PR反響，PR參數(shù)為：94預變性3in后，按94變性1in，57復性1in，72延伸1in,進展30個循環(huán)，然后于72再延伸10in。1.2.4DNA序列的測定用ABI377全自動測序儀測序。1.2.5表達載體的構建用質粒提取試劑盒分別提取約20g重組質粒和表達質粒pPI3.5K，分別經ER、BaH雙酶切，并用連接酶連接，轉化大腸桿菌J109感受態(tài)細胞，涂布在含有氨芐青霉素的LB

9、平板，培養(yǎng)過夜。2結果2.1木薯HNLDNA的克隆及序列測定從木薯幼葉組織提取總RNA為模板(圖1)，按材料和方法中所述條件進展反轉錄，再進展PR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PR擴增產物，檢測到一條約0.8kb的DNA片段，正好與預期的擴增片段相符圖2。Lane3:18SRNAand28SRNARNAfassavaleave圖1木薯幼葉組織總RNA的電泳Fig.1EletrphresisanalysisfRNAfassavaleaveRT-PR產物經BaH和ER酶切，和經同樣酶切處理的pBS連接，轉入E.liJ109，挑選重組質粒，通過酶切鑒定(圖2)，獲得陽性克隆，命名為pBS-HNL。對插入

10、的片段進展DNA序列測定(圖3)。該DNA序列實際長度為777個堿基，編碼258個氨基酸，與來自木薯的醇腈酶e-HNL10基因的DNA序列相比7，123，252，373，435，628，660，683位的堿基T，G，A，分別被，G，T，A，A，T，T所代替，導致125，210位的氨基酸leu,val變?yōu)閜he，Ile；與程樹華等報道的醇腈酶lnhnlDNA序列8比擬：337，373，435，476，628，634，636，660，683位的堿基A，T，G，T，A，A，分別被G，T，A，A，A，T，T，T所代替，導致113，125，158，210位的氨基酸：Ser，leu，phe，val變?yōu)镚l

11、y，phe，Tyr,Ile。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.Lane1:DNA/HindIIIarker;Lane2:RT-PRprdutLane3:pBS/ERI;Lane4:pBS-HNL/ERIBaHI圖2電泳分析RT-PR產物及限制酶切分析陽性克隆Fig.1EletrphresisanalysisfprdutbyRT-PRandanalysisfpsitivelningbyrestritiveenzyetehnique2.2表達載體的構建為了在甲醇酵母中表達木薯HNL，根據(jù)質粒pPI3.5K限制酶分布位點的特點，設計如下引物：a-3at-3其中上游引物引入BaH酶切位點，下游引物加上ER位點，以

12、質粒pBS-HNL為模板進展PR擴增，得到兩端分別含有BaH、ER酶切位點的HNL片段，將其雙酶切后與經同樣處理的pPI3.5K連接，轉化大腸桿菌J109感受態(tài)細胞，涂布含有氨芐的LB平板，培養(yǎng)過夜，待長出單菌落后，挑取單菌落于液體LA中，培養(yǎng)16h，提取質粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳，選取增大的質粒DNA，為可能的重組子。用限制性酶BaH和ER進展酶切鑒定，酶切產生了0.8Kb的片斷，與預期相符圖4。證明為所需的重組子，命名1道:經Hind酶切的DNA標準;2道:無;3道:pPI3.5K-HNL/BaH+ER;4道:pPI3.5K-HNL/BaH圖4酶切鑒定重組子pPI3.5K-HNLFig.4

13、RegestindetetinfpPI3.5K-HNL為pPI3.5K-HNL，其構建流程見圖5。圖5重組質粒pPI3.5K-HNL的構建流程Fig.5TheursefnstrutinfrebinantplasidpPI3.5K-HNL3討論已有的研究結果說明，木薯基因組中含有多個HNL基因成員，已確定序列的有至少3個成員，包括ehnl10,ehnl14,ehnl24以及l(fā)nhnl可能為新成員。將本研究獲得的醇腈酶DNA與已報道的，同源性較高的序列進展了序列比擬，結果顯示與e-HNL10DNA序列的同源性為99.1%，氨基酸序列同源性為98.8%，與lnhnlDNA序列的同源性為98.8%，氨

14、基酸序列同源性為98.1%。但根據(jù)同源性比擬結果，我們還不能確定本研究中克隆的HNL屬于其中的哪一類成員。甲醇酵母pihiapastris表達系統(tǒng)是一種較好的外源基因表達系統(tǒng)，它的蛋白質加工方式和高圖3克隆的木薯HNLDNA序列及推測的氨基酸序列Fig.3Nuletideanddeduedainaidsequenesf-hydrxynitrilelyaseDNAfrassava陰影局部表示:克隆到的木薯HNLDNA序列與e-HNL10DNA相比,堿基對不同的局部;黑體局部表示：與lnhnlDNA相比,堿基對不同的局部.方框局部表示:根據(jù)克隆的木薯HNLDNA序列所推測的其氨基酸序列與e-HNL

15、10相比不同的局部;下劃線表示:與lnhnl相比不同的局部。Shad:thedifferentpartfbasepairsparedte-HNL10DNA;Blak:thedifferentpartfbasepairsparedtlnhnlDNA;Pane:thedifferentpartfdeduedainaidsequenesparedte-HNL10;Underline:thedifferentpartfdeduedainaidsequenesparedtlnhnl.等真核生物相似，為理想的高等真核蛋白表達系統(tǒng)9。目前國外從多種植物中克隆了HNL基因,其中Hasslaher等將來自三葉膠

16、的HNLDNA分別在大腸桿菌、釀酒酵母和甲醇酵母中實現(xiàn)了表達，研究結果說明三葉膠HNLDNA在甲醇酵母中表達量最高，目的產物可達可溶性總蛋白的30%10；而Haughes等在大腸桿菌中表達了來自木薯的hnl基因11。國內也有研究報道在大腸桿菌中表達木薯HNL基因，酶活力為2100U/L發(fā)酵液8，但無在甲醇酵母中表達的報道。為了進一步進步木薯HNL的表達量，本項研究將木薯HNL插入到甲醇酵母pPI3.5K中，成功構建甲醇酵母表達載體，下一步將構建工程菌，完善發(fā)酵條件，以實現(xiàn)木薯HNL的高效表達?！緟⒖嘉墨I】1Beke，.SterespeifiSynthesisf-hydrxyNitrilesan

17、dptiallyAtiveEthanlainesJ.Ange，he，Int，Ed.Engl，1965，4：1079-1086.2Beker，.andPfEil，E.ntinuusSynthesisfptiallyAtiveHydrxy-nitrilesJ.A.he.S，1966，88：4299-4300.3EfferbergerF.SynthesisandReatinfptiallyAtiveyanhydrinsJ.Ange.heIntEdEngl，1994，33：1555-1564.4JhnsnDV,Zabelinskaja-akvaAA,GrienglH.xynitrilasesfrAsy

18、etri-BndFratinJ.urrpinhe，Bil，2000，4：103-109.5EInhardHasslaher，ihaelShall，arianneHayn.High-levelIntraellularExpressinfHydrxynitrileLyasefrtheTrpialRubberTreeHeveaBrasiliensisinirbialHstsJ.PrteinExpressinandPurifiatin，1997，11：61-71.6美J、薩姆布魯克，D.拉塞爾.分子克隆實驗指南黃培堂，等.譯，第三版，北京：科學出版社，2022，2-400.7Hughes.J，arvalh，F(xiàn).J.P.de.Hughes.A.Purifiatin,harateri-zatin，a