新基因功能研究的策略與方法課件

1、新基因功能研究的策略與方法隨著生命科學(xué)的發(fā)展及研究領(lǐng)域的不斷開拓和生物醫(yī)學(xué)研究在分子水平上的不斷深入和推進(jìn)，越來越多的未知新基因和基因的新功能被發(fā)現(xiàn),越來越多的新基因被得以成功克隆，因此對(duì)新基因功能的研究顯得日益重要，這也是后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容和首要任務(wù)。一.新基因的生物信息學(xué)及體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析;二.新基因的體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析三.功能獲得與功能失活策略研究;四.功能失活策略五.基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究基因功能的研究策略主要包括： 目前，生物信息學(xué)分析已成為新基因功能研究首選和必用方法，其具有方便快捷和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。研究者往往可以從中得到與新基因功能有關(guān)的重要信息，初步推測(cè)基

2、因的可能功能，進(jìn)而制定出進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室研究方案。（1）編碼產(chǎn)物預(yù)測(cè)分析（2）序列同源性分析（3）蛋白質(zhì)功能域分析一.新基因的生物信息學(xué)及體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析（1）mRNA水平的表達(dá)譜分析；（2）蛋白質(zhì)水平的表達(dá)分析。二.新基因的體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析 要開展新基因功能的研究工作，首要的研究任務(wù)摸清新基因在體內(nèi)的表達(dá)規(guī)律。包括從mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上來對(duì)其基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，即看其在各種不同的正?；虿B(tài)組織細(xì)胞中是否表達(dá)以及表達(dá)的水平高低等.新基因在某一特定的正常組織細(xì)胞中的表達(dá)水平高往往提示其在其中發(fā)揮著重要作用，而新基因在相應(yīng)的病態(tài)組織中的表達(dá)異常則提示與該病理過程相關(guān)的生物學(xué)意義。四.功能失活策

3、略 通過觀察某一細(xì)胞或個(gè)體在新基因的功能部分或全部失活后的細(xì)胞生物學(xué)行為或個(gè)體表型遺傳性狀變化來鑒定基因的功能。常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技術(shù)和基因敲除等（1）基因沉默技術(shù)（2）基因敲除五.基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究 細(xì)胞各種基本功能的完成離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此，確定能夠與新基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)終產(chǎn)物相互作用的上下游蛋白質(zhì)分子，也是研究新基因功能的一個(gè)十分重要的方面。目前常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)包括傳統(tǒng)的基親和分析而建立的免疫共沉淀技術(shù)和酵母雙雜交系統(tǒng).（1）免疫共沉淀技術(shù)（2）酵母雙雜交系統(tǒng)規(guī)律分析Cs3亞基蛋白的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析

4、序列同源性分析 包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析，這也是目前生物信息學(xué)技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的基本技術(shù)之一。主要采用BLAST和FASTA程序進(jìn)行，即從已知的各種核酸和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與新基因?qū)?yīng)的功能已知的高度同源基因和蛋白質(zhì)，從這些已知基因和蛋白質(zhì)的功能信息中來初步推測(cè)和判斷新基因的功能。 同時(shí)，因?yàn)槿祟惾蚪M測(cè)序已經(jīng)完成，所以以新基因的cDNA序列來對(duì)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，則可很方便地獲得與其完全同源基因組DNA 序列及其染色體定位信息，而無需進(jìn)行熒光原位雜交等基因染色體定位技術(shù)，進(jìn)而還可通過分析其內(nèi)含子、外顯子序列及其調(diào)節(jié)位點(diǎn)，推測(cè)其可能的基因表達(dá)調(diào)控方式。即通過

5、此法確定了富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白新基因的基因組DNA序列及其染色體定位。用expay軟件分析氨基酸序列同源性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域分析mRNA水平的表達(dá)譜分析 對(duì)新基因在mRNA 水平上的表達(dá)分析涉及到的技術(shù)有半定量RT-PCR 、實(shí)時(shí)定量RT-PCR 和Northern Blot 等。半定量RT-PCR方法具有簡(jiǎn)便、快捷和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，但其存在著精確度不高和不能進(jìn)行絕對(duì)定量等缺點(diǎn)，多用于基因表達(dá)水平的快速初步分析。實(shí)時(shí)定量RT-PCR是近年來新發(fā)展起來的一種mRNA定量分析技術(shù)，因具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染和自動(dòng)化程度高等的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，但其成本相對(duì)較高。Northern Blot歷來

6、是在mRNA水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析的經(jīng)典技術(shù)，被各實(shí)驗(yàn)室廣泛采用其不僅可以進(jìn)行定量分析，而且還能夠檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄本的大小及種類，這也是RT-PCR技術(shù)所不具備的優(yōu)勢(shì)但Northern Blot操作較為繁瑣，采用放射性標(biāo)記時(shí)也存在放射性污染的問題。在實(shí)際工作中，需結(jié)合這兩類方法同時(shí)進(jìn)行，互為補(bǔ)充。另外，必要時(shí)也應(yīng)考慮使用原位雜交技術(shù)來對(duì)新基因的mRNA在特定組織細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行定位觀察。 另外，對(duì)于病態(tài)組織細(xì)胞而言，在mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上的新基因的表達(dá)分析，還可以提供其基因表達(dá)調(diào)控的大致規(guī)律，譬如是主要在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平上被調(diào)控的。不少研究表明，細(xì)胞內(nèi)特定基因的mRNA水平變化和蛋白

7、質(zhì)水平變化的一致性很差?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù) 通過基因轉(zhuǎn)染，即將目的基因轉(zhuǎn)入某一細(xì)胞中通過觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化來認(rèn)識(shí)基因的功能，是目前應(yīng)用最多、技術(shù)最成熟的基因功能研究方法。 如經(jīng)典的RAS癌基因的功能即通過轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞而得以鑒定目前常用的基轉(zhuǎn)染系統(tǒng)分為非病毒性表達(dá)系統(tǒng)和病毒性表達(dá)兩種，非病毒性表達(dá)載體目前主要采用質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)、電穿孔等方法使目的基因被宿主細(xì)胞攝取，然而，盡管這類表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，其也有不少局限性，主要問題是，不同細(xì)胞類型對(duì)外源DNA的攝取能力有所不同，尤其在初級(jí)未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中幾乎是無效的，而初級(jí)細(xì)胞對(duì)于觀察基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性等行為恰恰非常有用。然

8、而，病毒性載體，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用卻能夠很好的解決此問題，這類以病毒為載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移因其具有轉(zhuǎn)染效率高、目的基因可穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因技術(shù) 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，則可將外源基因引入動(dòng)物體內(nèi)，建立攜帶并且能夠遺傳給子代的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表型分析研究外源基因的功能，目前已經(jīng)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立了數(shù)千種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并且還可以通過在攜帶外源基因的載體上加上組織特異性啟動(dòng)子等手段，從而控制外源基因在特定的時(shí)間或特定的組織器官表達(dá)。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來研究基因功能的優(yōu)勢(shì)在于它是一個(gè)在活體水平上的多維的研究體系，可以從分子到個(gè)體水平進(jìn)行多層次、多方位的研究?；虺聊夹g(shù) 這類技術(shù)中最常用的主要為反義寡核苷酸（ASON）、核酶和RNA干擾（RNAi）技術(shù)。 然而，包括這3種技術(shù)在內(nèi)的該類技術(shù)均具有誘導(dǎo)干擾素和其它細(xì)胞因子表達(dá)等非特異性效應(yīng)，另外，它們也會(huì)因?yàn)樽饔门c和靶分子序列相近的分子而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，其中，ASON因使用劑量大，其非特異性效應(yīng)最大；而RNAi的這兩種副效應(yīng)最小。基因敲除小鼠技術(shù)免疫共沉淀技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng) 是一種基于轉(zhuǎn)錄重建而建立的研究生物大分子相互作用的簡(jiǎn)便而有效的研究方法。其最大優(yōu)勢(shì)在于它可以用已經(jīng)克隆的基因從特定細(xì)胞的2HIE表達(dá)文庫(kù)中“釣取”與其編碼產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)及相應(yīng)基因序列。它檢測(cè)的相互作用在體內(nèi)發(fā)生，無需額外的純化