免疫細(xì)胞化學(xué)步驟及說明

1、1. 細(xì)胞爬片制備蓋玻片在75%酒精浸泡24h以上，超凈臺(tái)內(nèi)酒精燈上烤干。六孔板內(nèi)分別滴入一滴培養(yǎng)液，蓋上蓋玻片。分別加入等量細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞70%左右融合。關(guān)于蓋玻片的準(zhǔn)備，有很多種說法，但我的做法比較簡單，這樣做不會(huì)脫片，也不影響觀察。2. 細(xì)胞固定6孔板置冰上冷卻，吸盡培養(yǎng)液。4PBS，洗5min3次。吸去殘留PBS，空氣干燥，細(xì)胞面微潮濕時(shí)，加入預(yù)冷95%酒精固定液，浸沒細(xì)胞面，更換預(yù)冷95%酒精2次，第三次在-20靜置20min。這一步用4%多聚甲醛可能更省時(shí)省事。3. SP法免疫組化染色步驟(1)細(xì)胞爬片蒸餾水洗5min1次，PBS浸泡5min。固定之后的細(xì)胞一般不會(huì)脫落，可以

2、放在搖床上洗。(2)滴加3%H2O2去離子水，室溫孵育30min。PBS洗5min3次。(3)滴加0.3%Triton X-100（全液用蒸餾水稀釋）通透30min。PBS洗5min3次。細(xì)胞通透很重要，因?yàn)榈鞍自诎麅?nèi)，我第一次做時(shí)沒有通透，結(jié)果什么都沒有。(4)BSA封閉，室溫10min。傾去，勿洗。(5)滴加一抗(a-actin l:300)，4過夜。PBS洗5min3次?？贵w的濃度是自己摸索出來的，還有聽說4過夜是比較合適的做法。(6)滴加二抗(聚合HRP標(biāo)記抗小鼠IgG)，室溫30min。PBS洗5min3次。(7)按1mL蒸餾水+A、B、C（DAB試劑盒，要按順序滴加）各一滴，混勻，

3、鏡下顯色觀察，注意避光。蒸餾水充分沖洗。(8)蘇木素染2min。自來水充分沖洗。(9)依次在75%85%95%100%濃度酒精中浸泡2min脫水。封片之前常規(guī)有二甲苯透明的，但我滴加了二甲苯之后，片子變得很臟，不知什么原因。后來就不加了，直接脫水后封片，現(xiàn)在看來片子還不錯(cuò)啊。而且二甲苯太嗆人了。(10)中性樹膠封片。免疫細(xì)胞化學(xué)步驟：固定液配方（細(xì)胞免疫組化，用的是4%多聚甲醛固定的）：我們用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的，然后再用0.1m PB稀釋的。0.1m PB配方（PH值7.4）1000ml磷酸氫二鈉 48.693g磷酸二氫鈉 5.023g三蒸水 1000ml12.5%多聚甲醛（

4、PH值7.4）1000ml多聚甲醛 125g三蒸水 1000ml 磁力攪拌器加熱攪拌，溫度控制在60以下，如仍不溶，加NaOH（三蒸水先放800ml，10小時(shí)左右，再補(bǔ)加200ml）4%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml12.5%多聚甲醛 320ml0.1m PB 680ml步驟：1 將已消毒的20mm蓋玻片置于90mm培養(yǎng)皿中，按2*104/ml的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，5天后進(jìn)行免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色鑒定。2 PBS清洗標(biāo)本 3次 各 1 min。3 冰丙酮固定 15 min。4 空氣干燥 5min。5 PBS清洗標(biāo)本 3次 各 2 min。6 0.5%Triton X-

5、100( DPBS配 ) 孵育 1次 20 min。7 PBS清洗標(biāo)本 3次 各 2 min。8 3%H2O2孵育 15 min。9 DPBS清洗標(biāo)本 3次 各 2 min。10 封閉血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液） 20min。11 一抗孵育（PBS配，滴度1：200，濕盒）4OC 過夜或37OC 60 min。陰性對(duì)照最好用一抗來源血清，否則用PBS液12 PBS清洗標(biāo)本 3次 各 5 min。13 二抗工作液孵育（濕盒） 37OC 30 min。14 PBS清洗標(biāo)本 3次 各 5 min。15 C液（濕盒） 37OC 30 min。16、PBS清洗標(biāo)本 3次 各 5 min。17、

6、DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色 ） 約310min。18、蒸餾水洗 2次 1 min。19、蘇木素復(fù)染 0.51min。20、自來水洗 30min。21、樹膠封片。1、良好的細(xì)胞爬片是進(jìn)行免疫組織細(xì)胞的基礎(chǔ)，要獲得良好細(xì)胞爬片須注意以下：（1） 對(duì)于粘附分子較少的細(xì)胞爬片時(shí)間要達(dá)5天以上，這樣細(xì)胞爬片才較牢固，沖洗時(shí)不易脫片；（2） 接種的細(xì)胞密度適中，以2*104/ml為宜，若細(xì)胞密度太高，5天后細(xì)胞連接成片沖洗時(shí)易脫片；2、冰丙酮固定后玻片可密閉保存于4OC冰箱，冰丙酮固定時(shí)會(huì)使細(xì)胞收縮，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。3、沖洗時(shí)只須輕輕振蕩培養(yǎng)皿，（不可用吸管太用力吹，易脫片）4、加一抗、二抗后沖洗時(shí)第一次