乙肝兩對半定性測定課件

1、乙肝兩對半定性測定乙肝兩對半定性測定乙肝兩對半定性測定HBV是乙型病毒性肝炎的病原體。HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)感染的流行程度差異很大。據(jù)WHO報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌。我國屬高流行地區(qū)一般地區(qū)HBsAg陽性率為7.18%。2021/4/272乙肝兩對半定性測定乙肝兩對半定性測定乙肝兩對半定性測定HBVHBV是乙型病毒性肝炎的病原體。HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)感染的流行程度差異很大。據(jù)WHO報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人

2、死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌。我國屬高流行地區(qū)一般地區(qū)HBsAg陽性率為7.18%。2021/4/272HBV是乙型病毒性肝炎的病原體。HBV感染呈世界性流行，但不乙肝病毒血清標志物HBsAg第一個出現(xiàn)，感染后1-2周即可陽性陽性表示存在HBV感染HBsAb出現(xiàn)在HBsAg消失后保護性抗體疫苗免疫成功的標志 2021/4/273乙肝病毒血清標志物HBsAg2021/4/273乙肝病毒血清標志物HBeAg病毒復制標志傳染性強HBeAb 傳染性降低長期存在是DNA與肝細胞整合的結(jié)果2021/4/274乙肝病毒血清標志物HBeAg2021/4/274乙肝病毒血清標志物HBcAg

3、 HBV復制的標志血清中難以檢測出來IgM-HBcAb 急性HBV感染IgG-HBcAb急性感染恢復期和慢性持續(xù)感染2021/4/275乙肝病毒血清標志物HBcAg 2021/4/275檢測HBV病毒血清標志物是臨床最常用的病原學診斷方法。HBV具有三個抗原抗體系統(tǒng)，即乙肝表面抗原（HBSAg）和乙肝表面抗體（HBsAb）、e抗原（HBeAg）和e抗體（HBeAb）、核心抗原（HBcAg）核心抗體（HBcAb），由于HBcAg在血液中難于檢出，故臨床免疫學檢測不包括HBcAg，目前常采用酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光法檢測。2021/4/276檢測HBV病毒血清標志物是臨床最常用的病原學診斷方法。HBV

4、酶聯(lián)免疫吸附實驗原理用于檢測包被于固相板孔中的待測抗原（或抗體）。即用酶標記抗體，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相載體表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結(jié)果。顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。2021/4/277酶聯(lián)免疫吸附實驗原理用于檢測包被于固相板孔中的待測抗原（或抗乙肝病毒血清標志物檢測原理血清學標志原理包被試劑標記或結(jié)合物結(jié)果判斷HBsAg夾心法HBsAbHBsAb顯色(+)HBsAb夾心法HBsAgHBsAg顯色(+)HBeAg夾心法HBeAbHBeAb顯色(+)HBeAb競爭法HBeAbHBeAb及中

5、和抗原不顯色(+)HBcAb競爭法HBcAgHBcAb不顯色(+)2021/4/278乙肝病毒血清標志物檢測原理血清學標志原理包被試劑標記或結(jié)合物標本本要求采集： 血漿：使用抗凝血漿管（枸櫞酸鹽、EDTA鹽、肝素之一為抗凝劑）采集樣品。樣品離心分離后，提取血漿用于檢測。 血清：采用正確醫(yī)用技術采集標本。離心分離后，提取血清樣品用于檢測。2021/4/279標本本要求采集：2021/4/279標本要求儲存：樣品可存放于28冰箱，24小時內(nèi)測定。若需長時間保存，則應凍存于-20以下，避免反復凍融。上述樣品使用前應恢復到室溫，輕輕搖動混勻。若標本有沉淀物形成，應離心除去，并確定未變質(zhì)方可使用。嚴重融

6、血或脂血標本不可使用。2021/4/2710標本要求儲存：樣品可存放于28冰箱，24小時內(nèi)測定。若需試劑（安圖生物）編號組分名稱96人份1包被板69孔X1塊2樣品稀釋液2.3ml X1瓶3酶結(jié)合物5.5ml X1瓶4底物液6.2ml X1瓶5顯色劑6.2ml X1瓶6洗滌液30ml X1瓶7終止液5.5ml X1瓶8陰性對照1.0ml X1瓶9陽性對照1.0ml X1瓶10子母袋1個11說明書1份12板貼3張主要組成成分2021/4/2711試劑（安圖生物）編號組分名稱96人份1包被板69孔X1塊2實驗前準備1.取出試劑盒及待測樣品，將所有試劑及樣品恢復至室溫（1825）。2.將恒溫箱或水浴鍋

7、調(diào)至反應溫度。3.洗液用蒸餾水作20倍稀釋后備用。2021/4/2712實驗前準備1.取出試劑盒及待測樣品，將所有試劑及樣品恢復至室檢驗步驟排板2021/4/2713檢驗步驟排板2021/4/2713檢驗步驟表面抗原（兩步法）1.留一孔作空白對照，加入樣本稀釋液20ul/孔（含空白孔），其他加入陰性對照三孔和陽性對照二孔100ul/孔及待測標本100ul/孔于相應的反應孔內(nèi)。2.在微型真當器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。3.貼上板貼，置37下溫育60分鐘。2021/4/2714檢驗步驟表面抗原（兩步法）2021/4/2714檢驗步驟4.撕下板貼，除空白孔外，各孔加入酶結(jié)合物

8、50ul。5.在微型振蕩器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。6.貼上板貼，置37下溫育30分鐘。7.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。8.每孔加入底物液、顯色劑各50ul，37避光溫育30分鐘。2021/4/2715檢驗步驟4.撕下板貼，除空白孔外，各孔加入酶結(jié)合物50ul。檢驗步驟9.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即測試結(jié)果。10.使用酶標儀450nm單波長測量各孔的OD值。2021/4/2716檢驗步驟9.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即測試結(jié)檢驗步驟表面抗體、e抗原、e抗體、核心抗體（一步法）1.留一孔空白，三孔加入陰性對照、二孔加入陽性對照各5

9、0ul/孔，其他各孔分別加入樣本50ul (HBcAb測定時待測血清用生理鹽水1:30稀釋50ul血清+1.5ml生理鹽水) 。2.除空白孔外，各孔加入酶結(jié)合物50ul。3.在微型真當器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。4.貼上板貼，置37下溫育30分鐘。2021/4/2717檢驗步驟表面抗體、e抗原、e抗體、核心抗體（一步法）2021檢驗步驟5.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。6.每孔加入底物液、顯色劑各50ul，37避光反應10分鐘。7.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即測試結(jié)果。8.使用酶標儀450nm單波長測量各孔的OD值。2021/4/2718檢驗步驟

10、5.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。20212021/4/27192021/4/27192021/4/27202021/4/27202021/4/27212021/4/2721結(jié)果判定血清學標志原理包被試劑標記或結(jié)合物結(jié)果判斷HBsAg夾心法HBsAbHBsAb顯色(+)HBsAb夾心法HBsAgHBsAg顯色(+)HBeAg夾心法HBeAbHBeAb顯色(+)HBeAb競爭法HBeAbHBeAb及中和抗原不顯色(+)HBcAb競爭法HBcAgHBcAb不顯色(+)1.肉眼判定2021/4/2722結(jié)果判定血清學標志原理包被試劑標記或結(jié)合物結(jié)果判斷HBsAg結(jié)果判定2.酶標儀判定：用酶

11、標儀單波長450nm或雙波長450nm/630nm測定各孔OD值，根據(jù)OD值判定結(jié)果2021/4/2723結(jié)果判定2.酶標儀判定：用酶標儀單波長450nm或雙波長45注意事項濃縮洗滌液配制前充分搖勻。加樣本時要加到孔底。加試劑前應將試劑瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。如果滴加，滴加前應棄去1-2滴。2021/4/2724注意事項濃縮洗滌液配制前充分搖勻。2021/4/2724注意事項滴加時瓶身應保持垂直，以使滴量準確。勿將試劑滴在孔壁上。洗滌時各孔須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶殘留。洗滌時注意孔與孔之間的交叉污染。脂血，溶血可影響結(jié)果。2021/4/2725注意事項滴加時瓶身應保持垂直，以使滴量準確。勿將

12、試劑滴在孔壁注意事項所有樣本都應按傳染源處理。樣品顯色深淺與樣品中抗體的含量沒有一定正相關。任何一種測試都不能絕對保證樣品中沒有低濃度的抗體存在。不同品名、不同批號的試劑不可混用，以免產(chǎn)生錯誤結(jié)果。2021/4/2726注意事項所有樣本都應按傳染源處理。2021/4/2726影響檢測結(jié)果的因素1.樣本采集與處理的影響 1.1 標本嚴重溶血。 1.2 標本凝固不全：血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋原。2、試劑的影響 2.1 不同批號。 2.2 不同廠家。2021/4/2727影響檢測結(jié)果的因素1.樣本采集與處理的影響2021/4/27影響檢測結(jié)果的因素3.操作技術的

13、影響 3.1 加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性，直接影響檢測結(jié)果。 3.2 溫浴影響。 3.3 手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，半自動與全自動洗板機使用不當也會影響結(jié)果。2021/4/2728影響檢測結(jié)果的因素3.操作技術的影響2021/4/2728常見模式及臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb臨 床 意 義+急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV復制，傳染性強大三陽+急性HBV感染趨向恢復；慢性HBsAg攜帶者；傳染性弱小三陽+急性HBV感染；慢性HBsAg攜帶者；傳染性弱+慢性HBsAg攜帶者易轉(zhuǎn)陰；急性HBV感染趨向恢復+急性HBV感染早期或慢性攜帶者，傳染性強+急性HBV感染早期；急性HBV感染潛伏期；慢性HBV攜帶者，傳染性弱2021/4/2729常見模式及臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbH常見模式及臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb臨 床 意 義+非典型性或亞臨床型HBV感染+注射過乙肝疫苗有免疫力；既往感染；假陽性+急性HBV感染后康復+HBV感染后已恢復+既往感染，仍有免疫力；HBV感染恢復期+既往感染未能測出HBsAb；恢復期HBsAg已消，HBsAb尚未出現(xiàn)；無癥狀HBsAg攜帶者過去和現(xiàn)在未感染過HBV2021/4/2730常見模式及臨床意義HBsAgHBsAbHB