免疫組化的技術

1、關于免疫組化技術第1頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第一節(jié) 免疫組織化學理論基礎 一、免疫反應 免疫組織化學技術以免疫學的抗原抗體反應為理論基礎。 （一）抗原 抗原是一種化學物質，能刺激機體免疫系統(tǒng)產生相應的抗體，并能在體內和體外特異性結合形成抗原-抗體復合物。抗原具有免疫原性和反應原性，免疫原性指抗原分子具有誘導機體產生免疫應答的特性，反應原性指抗原分子與抗體或效應T細胞等免疫應答物質發(fā)生特異性反應的特性?？乖梢允强扇苄晕镔|（如毒素或蛋白質）或微粒（細菌或組織細胞）。第2頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四T細胞B細胞AgTBT漿細胞致敏T細胞抗

2、體第3頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 1抗原的性質 （1）異物性：機體能對進入體內的異種、異體的大分子物質產生免疫應答，該物質與機體的種系關系越遠，其免疫原性越強，機體的免疫反應也越強。同種異體物質也可作為抗原，如人紅細胞ABO血型抗原，人類白細胞組織相容性抗原（HLA）。第4頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 1.免疫原性 指抗原分子能夠刺激機體產生免疫應答(產生特異性抗體及免疫效應細胞)的性質。 AgTBT漿細胞致敏T細胞抗體第5頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 2.反應原性(又稱免疫反應性) 指抗原分子與免疫應答產物

3、(抗體或免疫效應細胞)發(fā)生特異性結合的性質。AgTBT漿細胞致敏T細胞抗體第6頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第7頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第8頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 （2）大分子膠體：抗原分子量越大，其表面積越大，接觸免疫細胞的機會越多，在體內停留時間長而不易排除，因而對機體的刺激作用也越強。一般具有免疫原性的物質，分子量常在10000以上。小于500010000的蛋白質分子，免疫原性很弱或完全沒有。 （3）特異性：一種抗體只能與相應的抗原反應而不能與其他抗原反應，這種抗原稱為特異性抗原（specific

4、 antigen）。不同的抗原物質常含有共同的抗原成分，即一種抗體可以與二種或二種以上不同抗原反應，這些抗原稱為共同抗原（common antigen）。第9頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 3抗原的種類 分類方法很多。根據(jù)抗原的性質分為完全抗原和不完全抗原： （1）完全抗原：同時具有免疫原性和反應原性的物質，能在體內誘導免疫應答，產生效應物質，并可與產生的效應物質特異性結合，如細菌、蛋白質等。 （2）不完全抗原 或半抗原，指在體內單獨存在時時免疫原性、但能與相應抗體特異性結合的低分子化合物或化學基團。能與半抗原結合使其具有免疫原性的蛋白質部分稱為載體（carrier）

5、，載體使結合物具有免疫原性，半抗原決定結合物的特異性。 第10頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 3、完全抗原與半抗原 1）完全抗原（complete antigen) 具有免疫原性和反應原性的物質。 2）半抗原（hapten，又稱不完全抗原incomplete antigen），無反應原性，只有抗原性的物質。 半抗原 + 蛋白質 完全抗原第11頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四半抗原 +載體抗體BT完全抗原BBBT第12頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四2抗原決定簇（AD）概念：抗原分子中決定抗原特異性的特殊化 學基團，又稱為

6、表位AD的數(shù)目、性質和空間構象決定抗原特異性抗原以AD與相應抗原受體及抗體特異性結合第13頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 （二）抗體 機體的免疫活性淋巴細胞在抗原的刺激下成為致敏淋巴細胞，進而分化、增殖為記憶細胞和淋巴母細胞，后者再分化為漿細胞，產生和分泌相應的抗體。根據(jù)抗體發(fā)揮功能的不同可以稱為凝集素、調理素和沉淀素等。 1抗體的性質 1972年，國際免疫學聯(lián)合會正式將化學機構與抗體相同或相似的一類球蛋白分子統(tǒng)一命名為免疫球蛋白（Ig）。人類Ig有Ig G、IgA、 IgM、 IgD、 IgE，五種Ig都具有IgG的基本結構。IgG分子有4條對稱的多肽鏈，兩條輕鏈（

7、L鏈）和重鏈（H鏈），以共價和非共價二硫鍵連接組成，通常用L2H2表示。多肽鏈的氨基(N) 第14頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四末端的氨基酸組成及序列隨結合抗原的特異性而異，稱可變區(qū)（V），是與抗原結合的部位，也稱Fab段；羧基（C）末端的氨基酸組成及序列比較穩(wěn)定，稱為穩(wěn)定區(qū)（C），是與Fc受體結合的部位，也稱Fc段。 2抗體的產生 抗原初次進入機體后，首先被抗原呈遞細胞（APC）如巨噬細胞吞噬，經消化降解保留其有效的抗原決定簇（特異性抗原成分），并呈遞給T淋巴細胞。 T淋巴細胞受到抗原信息刺激后，活化、增殖、分化為效應T細胞，同時分泌大量細胞因子，輔助B細胞活化、增

8、殖、分化為漿細胞，合成和分泌抗體。第15頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 3抗體的種類 根據(jù)獲得抗體的途徑或來源不同，分為免疫抗體、天然抗體和自身抗體。根據(jù)抗原與抗體在試管內是否出現(xiàn)肉眼可見的免疫反應，分為完全抗體和不完全抗體。 （三）抗原抗體反應 抗原與抗體在體內進行的反應稱為免疫反應，在體外進行的反應稱為血清學反應，二者統(tǒng)稱為免疫學反應，具有高度的特異性。主要有凝集反應、沉淀反應和補體參加的各種血清學反應。抗原與抗體所形成的抗原抗體復合物不是靠化學共價鍵結合，而是抗原決定簇與抗體分子的抗原結合位點的相互吸引，同時還有靜電引力、范德華力、氫鍵、疏水鍵等參與。第16頁，

9、共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四所以，抗原抗體復合物的結合不僅具有特異性，而且結合得十分穩(wěn)定，二者在復合物中仍可保留各自原有的結構和化學特性，只有在特殊條件下才能解離，如低pH高濃度鹽（3mol/L硫氫化鉀，7mol/L尿素）。在免疫組化操作過程中，已形成復合物的抗體不可能被緩沖液從組織中洗脫，所洗去的只是未結合的或結合后多余的抗體。 一個抗體分子有兩個抗原結合位點（二價），但一個抗原分子可有多個結合位點（多價），抗原與抗體的反應不受數(shù)量比例的限制，但要出現(xiàn)肉眼可見的反應，抗原抗體需保持一定的比例。第17頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 二、免疫組織

10、化學基本技術方法 不同的免疫組織化學技術各有獨特的試劑和方法，但基本技術方法是一致的，一般包括抗體制備、標本處理、免疫染色、對照實驗和顯微鏡觀察等。 1抗體的制備 高敏感特異性抗體是免疫組織化學技術的首要條件?？贵w有單克隆抗體和多克隆抗體兩大類，目前已商品化。 新購買的抗體應根據(jù)生產廠家提供的效價分裝保存，在-20 -70冰箱中可保存12年。小量抗體最好一次用完，避免反復凍溶，以免降低效價。第18頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 2標本的處理 標本的采集和處理是免疫組織化學技術成功的前提，要保證待檢組織新鮮，選用合適的固定液及時固定、切片等。 3免疫染色 由于在組織和細

11、胞進行的抗原抗體反應一般是不可見的，需要用標記方法將某種標記物或熒光素結合到抗體上，再用組織化學方法顯示此標記物或在熒光顯微鏡下觀察熒光素發(fā)出的熒光。用這些標記的抗體可以在組織切片上鑒別是否發(fā)生了特異的抗原抗體反應，并可對與抗體結合的抗原進行定位。第19頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 三、結果判斷 對免疫組織化學結果的判斷應持科學慎重的態(tài)度。要準確判斷陰性和陽性，排除假陽性和假陰性結果以及非特異性染色，必須嚴格對照實驗。 1陽性細胞的染色特征 有胞漿、胞核和胞膜表面著色三種類型，大部分抗原位于胞漿，可見于整個或部分胞漿；陽性細胞可呈灶性和彌漫性分布；因抗原含量不同，染

12、色強度不一，如細胞之間染色相同，常提示為非特異性染色；陽性細胞定位于單個細胞，且與陰性細胞混雜分布，而非特異性染色常波及一片細胞；切片邊緣、刀痕、皺摺，壞死重疊細胞區(qū)，膠原結締組織等，常表現(xiàn)為相同的染色強度，不能用于判斷陽性。第20頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 2染色失敗的常見原因 通常有以下幾種： （1）均一陰性：可能是操作步驟，抗體質量，相關試劑質量，pH等出現(xiàn)了問題。 （2）均一弱陽性：可能是抗體濃度過高或溫育時間過長，H2O2濃度過高或顯色反應時間過長，緩沖液未加NaCl或pH有誤，粘片劑太厚等因素。 （3）背景過深：可能是未用酶處理切片，切片過厚，漂洗時間

13、不足，顯色反應過長，封閉血清不足或血清溶血，全血清抗體稀釋不夠等因素。 （4）陽性對照良好，待檢切片陰性：標本固定和處理不當是最常見的原因。第21頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第二節(jié) 免疫熒光組織化學技術 一、免疫熒光的基本原理 免疫熒光組織化學技術系將抗體或抗原以熒光素標記，然后與相應抗原或抗體結合，在熒光顯微鏡或紫外線照射下，呈現(xiàn)熒光的一種特異性免疫熒光檢測方法。該技術結合了免疫反應的特異性和在黑色背景中發(fā)光物質易被發(fā)現(xiàn)的敏感性優(yōu)點，因而能準確檢測少量的抗原或抗體成分在組織細胞內的定位分布。第22頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 二、免疫熒

14、光技術的條件 （一） 熒光素 當某些物質經光線的照射，特別是經短波長的光線(能量強)照射后，該物質原子的電子層中的電子吸收光能，由低能級的電子層躍遷到高能級的電子層，或躍遷到同一電子層的高能帶，稱為能級躍遷。處于高能級狀態(tài)的電子極不穩(wěn)定（激發(fā)態(tài)），經過約10-8秒后，以輻射光量子的形式釋放所吸收的能量，而回到原來的能級狀態(tài)（基態(tài)）。這種輻射出的能量即熒光。引起熒光最有效的光是激光、紫外光和藍紫光。根據(jù)不同熒光素的標本，可產生紅、橙、黃、綠、青、藍、紫色的熒光。第23頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 熒光素是一種染料，可以吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。一定的熒光素可以與組織

15、或細胞的某些成分（如染色體）中的分子或功能基團進行特異性結合，呈現(xiàn)一定顏色的熒光。熒光顯微鏡就是利用組織和細胞與熒光素特異性結合的特性，通過激發(fā)濾光片產生一定波長的激發(fā)光源，照射結合在組織和細胞中的熒光素產生激光，再通過阻斷濾光片觀察所產生的熒光。即可觀察組織細胞的結構、細胞內某些成分含量的變化，并探討細胞的功能狀態(tài)?；蛴媚承晒馑貥擞浢庖咔虻鞍?，進行免疫熒光細胞學研究。第24頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 用于標記蛋白質的熒光素必須具備有化學上的活潑基團，易與蛋白質穩(wěn)定結合；能發(fā)射可見的、對視覺敏感的熒光顏色；熒光效應強，性質比較穩(wěn)定，不影響標記物的活性。常用于免疫

16、標記的熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）、四乙基羅丹明（RB200）、二甲基氨基萘-5-磺酸（DANS）、4-乙酰胺-4-異硫氰基-二苯乙烯-2,2二磺酸（SITS）呈蘭色熒光、 得克薩斯紅、藻紅素R、花青，DANS因熒光迅速猝滅，已很少用。第25頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 （二）熒光標記抗體 用于熒光素標記的蛋白質，多用特異性抗體或抗原成分，因不同抗原的理化特性差別甚大，不易高效標記，遠較標記抗體少。用于標記的抗體要求效價高，特異性強，標記后活性損失小。雖然單抗的效價高，特異性強，親和力強，但經熒光素標記后，理論活性僅是標記前

17、的50%，故常用標記抗鼠免疫球蛋白的方法以彌補單抗標記的缺點。 1FITC標記抗體 FITC為黃橙色或黃褐色粉末或結晶，分子量389.4，性質穩(wěn)定，室溫可保存2年以上，低溫可保存多年，易溶于水和乙醇。最大吸收光譜490495nm，最大發(fā)射光譜520530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光。第26頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與IgG的自由氨基經碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，結合成為標記熒光素的IgG熒光抗體。一個IgG分子最多可以標記1520個FITC分子。 2TRITC標記抗體 TRITC為紫紅色粉末，分子量580，較穩(wěn)定。最大吸收光譜為5

18、50nm，最大發(fā)射光譜為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對比清晰。與蛋白質結合方式同F(xiàn)ITC相似。TRITC亦分無定型和結晶型兩種，前者與蛋白質以2040g/mg為宜，后者則為12.5g/mg。第27頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 3RB200標記抗體 RB200為褐紅色粉末，分子量580，不溶于水，易溶于乙醇或丙酮，性質穩(wěn)定，室溫下可長期保存。最大吸收光譜為570nm，最大發(fā)射光譜為595600nm，呈現(xiàn)明亮橙紅色熒光。RB200在PCl5作用下轉變成磺酰氯（SO2Cl），在堿性條件下易與蛋白質的賴氨酸-氨基反應而標記在蛋白分子上。 （三）熒光抗體

19、的貯存 合格的熒光抗體，加0.1%硫柳汞防腐。小劑量分裝于安瓶內熔封后，4保存1年，-20保存2年，冷凍真空干燥成干粉后熔封，4保存5年效果尚好。 第28頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 三、免疫熒光技術的分類： 據(jù)標記的抗體和抗原不同分為熒光抗體法和熒光抗原法，以熒光抗體法較為常用。 據(jù)標記的抗體不同又分為直接法和間接法 1直接法 用熒光素直接標記已知的特異性第一抗體（或抗原），檢測相應的待測抗原（或抗體），本法簡便、快速、特異性強，但敏感性差。第29頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第30頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四

20、 2間接法 間接法不需直接標記特異抗體(一抗），而是標記第二或第三抗體。 （1）夾心法：先用特異性抗原與組織內的抗體反應，再用此抗原的特異性熒光抗體與結合在組織內抗體上的抗原結合，抗原夾在組織抗體與熒光抗體之間，故稱為夾心法。 （2）檢測抗體法：用已知抗原的組織切片，加上 待測血清，其中的特異性抗體與切片中的已知抗原結 合，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性IgG熒光抗體） 與結合在抗原上的抗體反應（如檢測人血清中的抗體 必須用抗人IgG熒光抗體）。在熒光顯微鏡下就可以第31頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四見到抗原抗體反應部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法是常規(guī)檢測血清中自身抗體和多

21、種病原體抗體的重要手段。 （3）檢測抗原法：先用特異性抗體與標本中的待測抗原反應，隨后用緩沖液洗去未與抗原結合的抗體，再用間接熒光抗體（二抗）與結合在抗原上的一抗結合，形成抗原-抗體-熒光抗體復合物。本法只需要制備一種種屬間熒光抗體，不但簡便快速，而且特異性強、敏感性高。第32頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第33頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 3補體法 （1）直接檢測組織內免疫復合物：用抗補體C3等熒光抗體直接作用于組織切片，與其中結合在抗原抗體復合物上的補體反應，形成抗原-抗體-補體-抗補體熒光抗體復合物，在抗原-抗體-補體復合物存在的部位

22、呈現(xiàn)特異性熒光。 （2）間接檢測組織內抗原：將新鮮補體與一抗混合，同時加在抗原標本上，37孵育后如發(fā)生抗原抗體反應，補體就結合在此復合物上，再用抗補體熒光抗體與結合的補體反應，形成抗原-抗體-補體-熒光抗體復合物。第34頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四利用補體反應，通過形成抗原-抗體-補體復合物發(fā)射熒光第35頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 四、常用熒光染色方法 1直接法 (1）向切片滴加最佳效價的熒光標記一抗，室溫或37避光作用30min； （2）傾去殘留的熒光一抗，浸入PBS(pH7.27.4)，電磁振動，洗滌5min2次； （3）蒸餾水洗滌

23、1min除去鹽結晶； （4）用50%緩沖甘油封固（0.5mol/L碳酸緩沖液， pH9.09.5），熒光顯微鏡觀察。 （5）對照實驗： 1）抗體對照：用正常血清代替熒光抗體血清，如上述方法處理，結果應為陰性； 2）抗原對照：類屬抗原染色，結果應為陽性；第36頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 2間接法 （1）向切片滴加最佳效價的一抗，室溫或37避光作用30min； （2）傾去殘留的一抗，用0.1mol/L PBS（pH7.2）洗滌10min2次，吸去殘留液體； （3）滴加間接熒光抗體，室溫或37避光作用30min，PBS振動洗滌10min2次； （4）50%緩沖甘油封固（

24、0.5mol/L碳酸緩沖液， pH9.09.5），熒光顯微鏡觀察。 （5）對照實驗： 1）抗體對照：用正常血清代替一抗血清，如上述方法處理，結果應為陰性； 2）陽性對照：用陽性對照切片染色，如上述方法處理，結果應為陽性。第37頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 3補體法 （1）將固定切片（涂片）0.1mol/L PBS（pH7.2）洗滌3min，吹干至表面無水分； （2）滴加最佳效價免疫血清和補體的等量混合液，室溫或37避光作用30min； （3）用0.1mol/L PBS（pH7.2）洗5min2次，攪拌或振動，吸干標本周圍液體； （4）滴加最佳效價的抗補體熒光抗體，3

25、7避光作用30min，水洗同（3）； （5）蒸餾水洗滌1 min，50%緩沖甘油封固，熒光顯微鏡觀察。 （6）對照實驗：按間接法對照進行。第38頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 五、免疫熒光染色的注意事項 1載（蓋）玻片 載玻片必須光滑均勻，無自發(fā)熒光，厚度以0.81.2mm為宜，蓋玻片以0.17mm為宜。 2組織切片 不宜太厚，以免激發(fā)光消耗過多和細胞重疊影響觀察，通常510m。 3封片劑 必須無自發(fā)熒光，無色透明。通常用甘油。 4熒光觀察 暗室中觀察，每次12h為宜。 熒光強度分四級，“-”無或微弱自發(fā)熒光，“+”明確可見的熒光，“+”明亮的熒光，“+”耀眼的熒光。

26、采用高速感光膠片（ASA200）攝影，或采用分光光度計、流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡和圖象分析儀觀察、記錄、分析。第39頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 六、非特異性染色的消除方法 1非特異性染色的主要因素 （1）部分熒光素未與蛋白結合而形成聚合物或衍化物，不能被透析除去而著色。 （2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，與組織成分非特異結合。 （3）除待檢抗原外，組織中可能存在類屬抗原（如Forssman抗原），可能與組織中特異性抗原以外的相應抗體結合。 （4）所制備的免疫血清混雜一些抗其他組織成分的抗體，混淆不清。 （5）熒光素分子太多，過量標記的抗體分

27、子帶有過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色，熒光素不純、標本固定不當也可出現(xiàn)非特異性染色。第40頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 2非特異性染色的消除方法 根據(jù)非特異性染色的原因，通常采用下列方法： （1）動物臟器粉末吸收法：常用豬或鼠肝粉或 骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加肝粉50100mg，混允，室溫振動2h，4過夜，再攪拌10min，300015000rpm高速離心30min，12次，即可使用其上清液。一般在臨用前進行，吸收后熒光抗體低溫保存不要超過2周。 （2）透析法：熒光素（如FITC）可以透過半透膜，而蛋白質大分子不能透過，因此，透

28、析法可以將未與抗體蛋白質分子結合的熒光素除去。 第41頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 （3）伊文藍（Evan blue）襯染法：用含0.01%伊文藍的0.01mol/L（pH7.2）PBS溶液稀釋熒光抗體，可將背景組織染成紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明對比，減少非特異性熒光，宜常規(guī)使用。伊文藍配成1%溶液，4保存，用前稀釋至0.01%以稀釋抗體。 （4）其他：葡聚糖凝膠G-25或G-50層析法和DEAE纖維素柱層析法、熒光抗體稀釋法、純化抗原和純化抗體法 、胰蛋白酶消化組織切片法、牛血清蛋白封閉法等。第42頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四

29、第三節(jié) 免疫酶標組織化學技術 免疫酶標記技術是在免疫熒光技術的基礎上發(fā)展起來的。 通過共價鍵將酶連接在抗體上，制成酶標抗體，當抗原與抗體在組織或細胞內特異性結合后，借助酶對相應底物的特異催化作用，生成有色不溶性產物（或高電子密度顆粒），在光鏡（或電鏡）下進行細胞表面或細胞內各種抗原成分的定位、定性和定量檢測。 第43頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 一、標本制備 基本原則是保持組織內抗原物質的不動性和免疫活性。 1AMEX（acetone meth enzoate xylene）即改良冷凍置換法（freeze substitution）的簡稱，主要用于石蠟包埋的標本，具

30、有同新鮮未固定組織冷凍切片同樣的抗原保持性和石蠟切片的良好組織結構保存性。其機制為：組織在丙酮中固定（脫水），細胞內水分逐漸被丙酮取代，繼而用苯甲酸酯取代丙酮，經二甲苯置換后，石蠟包埋。組織在-20丙酮內過夜亦形成冰晶，所以將組織先置4丙酮2030min，再移入-20丙酮過夜，也可以在4丙酮內過夜，效果基本相同。第44頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 2微波固定 能保持良好的組織結構和抗原性，適用于各種切片固定。其機理可能與微波的頻率具有被水分吸收的性質（通常所用微波頻率2450MHz）有關。生物材料含有大量水分，照射后分子運動加快，溫度升高，促進固定液向組織內滲透，加

31、速與組織成分的反應，短時間內可達到固定的效果。經微波照射固定的組織，需置于相同固定液中，室溫下后固定26h。通常為固定液510ml，照射1030s，照射后固定液的溫度50。具體方法：將標本置于微波爐轉臺中央，周圍放一燒杯盛300500ml純水，以吸收照射時微波爐產生的熱量，選擇強檔照射1030s。 3切片 冷凍切片和石蠟切片，各有優(yōu)缺點，根據(jù)具體情況選擇 第45頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 二、染色方法 （一）酶標抗體染色方法 1標記酶 理論上講，用于組織化學方法顯示的酶均可用于標記抗體，但實際上能用于標記抗體的酶只有少數(shù)幾種：辣根過氧化物酶（horseradish

32、 peroxidase，HRP），分子量40kD；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），分子量80kD；葡萄糖氧化酶（glucose oxdase，GOD），分子量180kD。理想的酶首先必須具有催化底物的特異性和反應產物的穩(wěn)定性，同時應具有分子量小、可溶性好、光密度高、偶聯(lián)方法簡便，與抗體偶聯(lián)后仍保持酶的活性，與底物作用后容易顯色，而且不易退色等特性。第46頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 HRP廣泛分布于植物界，以植物辣根內含量最多而得名，系無色的酶蛋白與深棕色的鐵卟啉結合組成的糖蛋白，糖占1618%（8條糖鏈分布在HRP分子表面），最適pH

33、=55.5，最適溫度4045。pH411、50以下較穩(wěn)定，易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。酶的活性中心含有鐵卟啉輔基，最大吸收光譜403nm。目前認為，HRP是一種比較理想的標記酶，但生物體內某些組織和細胞（如退化變性壞死組織，紅細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、嗜中性粒細胞等）內也有內源性HRP，因此，標記切片中可出現(xiàn)非特異性著色，影響對結果的判斷分析。然而，正常哺乳動物的組織中（或心臟經灌注后）不含HRP，不出現(xiàn)非特異性染色，故標記切片背景清晰。第47頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 2酶標抗體 酶標抗體與熒光素標記抗體不同，需要借助偶聯(lián)劑將酶連接在抗體分子上。偶

34、聯(lián)劑是一種雙功能試劑，必須具備3個基本特征：與抗體和酶之間必須是不可逆共價鍵結合；不能影響酶和抗體的活性；不能因偶聯(lián)劑的加入，使酶標抗體與組織成分發(fā)生特異性結合。HRP標記抗體的常用偶聯(lián)劑有戊二醛、對萘醌、過碘酸鈉和Maleimide等。第48頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 3基本原理 根據(jù)酶標抗體的不同，分為直接免疫酶標法和間接免疫酶標法。 （1）直接免疫酶標法（direct immunoperoxidase method）：是通過HRP直接標記的第一抗體與抗原結合，形成酶標免疫復合物而顯色。本法簡便，但每種抗體均需與HRP偶聯(lián)，而偶聯(lián)過程會降低抗體的效價，故不及直

35、接免疫熒光法簡便，已很少應用 第49頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四組織抗原第一抗體過氧化物酶直接法（一）直接法原理：HRP標記在特異性抗體（第一抗體）上，抗原-抗體 HRP復合物第50頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四步驟：一步完成優(yōu)點：簡便、省時 特異性強，非特異染色輕缺點：敏感性差 一種標記抗體只能檢測一種抗原第51頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 （2）間接免疫酶標法：是用HRP標記二抗，有抗原放大作用，較直接標記法敏感。當特異性一抗（多數(shù)抗血清由兔制得，單克隆抗體由小鼠制備）與抗原形成復合物后，再加HRP標記的二抗

36、，形成抗原-一抗-HRP標記二抗復合物而顯色。由于二抗體實際就是一抗體的抗體，所以，只要不同的一抗來源于同一種屬，與標記的二抗結合就能顯示其不同特異性抗原的存在，避免了直接法標記每種一抗的麻煩，而且提高了敏感性。 第52頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四組織抗原第一抗原第二抗體過氧化物酶間接法（二）間接法原理：HRP標記在第二抗體上， 抗原-特異性抗體-第 二抗體 HRP復合物第53頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四組織抗原第一抗原第二抗體過氧化物酶間接法（二）間接法原理：HRP標記在第二抗體上， 抗原-特異性抗體-第 二抗體 HRP復合物第54頁，

37、共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四優(yōu)點：較直接法敏感性高 一種標記抗體能用于相應動物制備的多種特異性抗體，檢測多種抗原缺點： 較直接法費時 非特異性染色稍重 步驟：二步法第55頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四優(yōu)點：較直接法敏感性高 一種標記抗體能用于相應動物制備的多種特異性抗體，檢測多種抗原缺點： 較直接法費時 非特異性染色稍重 步驟：二步法第56頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 4顯色原理 （1）HRP標記顯色：HRP是最常用的標記酶，其顯色原理如下： HRP + H2O2 HRP H2O2 + 供氫體（電子供體） HRP +

38、 H2O + 供氫體（氧化型） HRP的特異性底物為H2O2 ，在分解H2O2過程中，與H2O2形成復合物，無電子供體存在時，反應再進行，有電子供體存在時則迅速生成水，酶被還原，電子供體被氧化、聚合，再經氧化環(huán)化后形成吲哚胺多聚體。紅外光分析表明，這一多聚體進一步氧化環(huán)化形成苯乙阱聚合體，在酶反應部位形成不溶性棕褐色沉淀，與組織對比清晰。第57頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第58頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 HRP催化的酶促反應第一步是特異性的（催化底物H2O2），其余反應無特異性，可以用不同的電子供體，因此最終產物的顏色也不同，如4-氯-

39、1-萘酚（CN）呈藍黑色、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）呈深藍色、3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）呈紅色、3,3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）呈棕色。AEC室溫下穩(wěn)定，但不能進行脫水等處理，時間長易褪色。DAB是目前廣泛應用的電子供體之一，較為敏感，切片可以脫水透明處理，而且終產物具有嗜鋨性，經四氧化鋨處理后電子密度增加，適用于電鏡下確定抗原的存在。但是，DAB可能具有致癌性，應盡量減少吸入和接觸，最好將DAB制成10倍儲存液，分裝于-20保存，臨用時稀釋、過濾。CN較DAB敏感性略差，但其終產物較為局限，很少彌散，適于光鏡觀察 第59頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第60頁，共8

40、7頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 （2）ALP標記顯色：ALP標記抗體主要用于內源性過氧化物酶較高的紅細胞、淋巴細胞等免疫組化顯色。ALP以AS-Mx為底物，F(xiàn)B/FR為顯色劑，生成藍色/紅色不溶性沉淀。顯色液內加入終濃度為24mmol/L的左旋咪唑（levamisole），大多數(shù)內源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑以每毫升60120mmol/L濃度的儲存液-20保存，應用時稀釋30倍。為避免反復稱取和試劑吸水，萘酚AS-Mx、FR和FB均應小量分裝后-20保存。 第61頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第62頁，共87頁，2022年，5月20日，9點5

41、0分，星期四 （二）非酶標記抗體染色法 由于酶標抗體法中酶與抗體之間的共價鍵結合能損害部分抗體和酶的活性，抗血清中的非特異性抗體被酶標記后，與組織結合可導致背景染色等。1969年Masson建立了非酶標橋抗體法（bridge antibody method），1970年Sternberger創(chuàng)建了辣根過氧化物酶-抗辣根過氧化物酶法（peroxidase anti-peroxidase method，PAP）。 第63頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 1橋抗體法 首先制備高效價的特異性抗酶（HRP）抗體（三抗），然后利用二抗作為“橋梁”，將抗酶抗體連接在與組織待測抗原結合

42、的一抗上，再將酶結合在抗酶抗體上，經顯色后顯示抗原的存在。具有二次放大作用，比間接法更為敏感，但操作步驟復雜。制備三抗和二抗的動物必須與一抗為同一種動物，以保證其相互結合。二抗的一個Fab片斷與一抗的Fc段結合，另一個Fab片斷與三抗的Fc段結合，二抗作為連接一抗和三抗的“橋梁”，故稱為橋抗體。當三抗與二抗結合后，再加HRP，此時HRP即可與三抗自然結合，從而形成一個復雜的抗原-一抗-二抗-三抗-HRP復合物而顯色第64頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四酶橋法組織抗原第一抗體第二抗體第三抗體（抗酶抗體）HRP二、酶橋法原理：HRP標記在抗酶抗體（三抗）上， 抗原-特異性抗

43、體-第 二抗體-第三抗體 HRP復合物一抗、三抗有何關系？第65頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四優(yōu)點：與酶標記抗體法相比，敏感性高 （酶與三抗通過抗原-抗體反應 結合，避免直接標記引起兩者活性降低）缺點： 較費時 步驟：四步法第66頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 2PAP法 用PAP復合物作為酶標顯色手段。PAP是一種可溶性酶-抗酶血清復合物，可作為特異性顯色基團。PAP法簡化了操作步驟，提高了靈敏度，是目前免疫組織化學染色常用的方法（圖）。PAP法比間接熒光法靈敏，所用第一抗體的濃度可低于間接熒光法10倍，也可用其它酶代替HRP與相應的抗體組

44、成復合物，如ALP-抗ALP等。原理：抗原-特異性抗體-第二抗體(橋抗體)-PAP復合物第67頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四組織抗原第一抗原第二抗體PAP復合物HRPPAP法（過氧化物酶抗過氧化物酶復合物法）原理：與酶橋法相似，不同之處是將酶與三抗制備成PAP復合物?？乖?特異性抗體-第二抗體（橋抗）-PAP復合物第68頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四優(yōu)點：敏感性較高 背景染色較輕局限：特異性抗體與PAP必須為同一種屬動物 步驟：三步法第69頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 PAP復合物是HRP的抗體和HRP結合而生成的

45、一種復合物。每個PAP復合物由2個抗HRP的IgG分子及3個HRP分子組成。PAP法也需用三抗。首先用特異的第一抗體（多為兔或小鼠IgG）孵育組織切片，其次用抗第一抗體（IgG）的抗體即二抗（如羊抗兔IgG或驢抗小鼠IgG）作為“橋梁”，然后用PAP復合物與二抗結合。二抗（橋抗）IgG分子有兩個Fab段，一個與一抗結合，另一個與PAP復合物結合。最后，用HRP的底物來顯示PAP復合物。有若干種底物可供選擇，不同底物可以產生不同的顏色反應。第70頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 三、結果判斷 在科研工作中，免疫組織化學染色結果可進行定性及定量分析。應熟悉所用的實驗方法、抗

46、體的優(yōu)點和局限性，嚴格操作步驟，控制控制條件，避免主觀意識，進行客觀判斷，認真地分析。需要強調的是，最好將對照組及實驗組的切片貼在同一張載片上或將切片在相同的條件下同時孵育，盡可能保證處理條件一致，使結果具有可比性。第71頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 （一）對照實驗 進行免疫組織化學染色時，必須證實組織內顯示的有色產物確實是抗原與相應的特異性抗體結合所產生的。如前所述，影響免疫組織化學染色過程的因素很多，必須要有嚴格的對照才能對染色結果作出正確的評價。常用的實驗對照有： 1陽性對照 用已知含靶抗原的組織切片（最好是冷凍切片）與待檢標本同樣處理，染色結果應為陽性，稱陽

47、性對照。通過陽性對照可證明靶抗原有活性，抗體特異性高，染色過程中各個步驟以及所使用的試劑合乎標準，染色方法可靠。第72頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四尤其當待檢標本為陰性時，陽性對照切片呈陽性反應可排除待檢標本假陰性的可能。所以，若預期染色結果為陰性時，必須設陽性對照。若陽性對照亦不顯色，說明抗原保存、染色方法和抗體效價等某一方面存在問題。目前，各試劑公司對不同的試劑盒都有陽性對照。 2陰性對照 用已知不存在相應靶抗原的組織標本染色，結果應為陰性。陰性對照可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應等因素造成的假陽性結果。當待測標本為陽性結果時，陰性對照更為重要。陰性對

48、照包括以下幾種：第73頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 （1）空白對照：用緩沖液替代一抗是最常用的空白對照，染色結果應為陰性，說明染色方法可靠、一抗特異性強。實驗中應常規(guī)設立空白對照。 （2）替代對照：用制備第一抗體相同動物的免疫前血清或相同種屬動物的正常血清替代第一抗體，染色結果應為陰性。這可證明待檢組織切片的陽性結果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是該抗體與組織內靶抗原特異性反應的結果。第74頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 （3）自身對照：用同一組織切片上與靶抗原無關的其它抗體的染色作對照，應為陰性。陽性與陰性結構同在一個視野中，相互印證

49、，這本身就是對陽性反應的特異性對照。如無關抗體在相同部位出現(xiàn)類似的陽性結果，多為非特異性著色。 （4）吸收試驗：先將過量的已知抗原與對應的抗體混合孵育，兩者形成特異性結合，再用結合后的混合物孵育切片，染色結果應為陰性。若染色結果仍為陽性，則為非特異性染色。此法可證明待檢組織切片的陽性結果是該抗體與組織內靶抗原特異性反應的結果。但此法操作步驟繁瑣，抗原和抗體的用量較大，價格昂貴。 第75頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 （二）非特異性染色 非特異性染色的來源主要有以下幾個方面： 1組織細胞內色素 與DAB沉淀物顏色類似的色素，如黑質內的神經黑色素容易混淆，可用其他電子供體

50、或免疫熒光技術鑒別，也可用ALP代替HRP進行染色。 2類過氧化物酶 紅細胞內的血紅素輔基有類過氧化物酶活性，如組織內存在紅細胞，即使不加過氧化物酶也可出現(xiàn)陽性著色。用甲醇-0.3% H2O2混合液孵育30min，或直接用3% H2O2溶液孵育30 min，可以抑制這種假陽性著色。甲醇能使血紅素中的亞鐵血紅素游離，后者被H2O2破壞，從而抑制類過氧化物酶的活性。 第76頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 3內源性過氧化物酶 主要存在于粒細胞、巨噬細胞和固定效果較差的膠質細胞，能與DAB-H2O2反應出現(xiàn)假陽性。所以，富含此類細胞的脾、肝、骨髓等組織染色時最好先阻斷內源性過

51、氧化物酶，可用甲醇-H2O2封閉 4游離醛基 醛類固定的組織切片可能存在游離醛基，后者能與蛋白質（IgG）非特異性結合導致假陽性。用白蛋白或封閉性阻斷血清預先孵育切片，可將其抑制。 5疏水鍵和離子鍵 免疫球蛋白可通過疏水鍵和離子鍵與組織中的堿性蛋白或Fc受體非特異性結合，用正常血清封閉非特異結合位點即可消除非特異性著色.第77頁，共87頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 6天然抗體和不純抗體 天然抗體指因動物自然感染等因素血清中存在的部分抗體，不純抗體是在制備抗體血清時所用的抗原不純而獲得的抗體含有雜質抗體，與組織成分結合可出現(xiàn)非特異性著色。除去的方法是盡可能高地稀釋抗體，以減低非特異抗體的濃度。 7載體蛋白 制備分子量小于4kD的小分子多肽抗體時，需要借助載體蛋白使小分子多肽獲得免疫原性。但載體本身也具有抗原性，因此動物可同時產生抗載體蛋白的抗體