免疫細(xì)胞分離技術(shù)

1、關(guān)于免疫細(xì)胞的分離技術(shù)第1頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四 免疫系統(tǒng)的組成免疫系統(tǒng)免疫器官中樞: 胸腺、骨髓周?chē)毫馨徒Y(jié)、脾臟、粘膜 相關(guān)淋巴組織等免疫細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞 、 粒細(xì)胞、DC、肥大細(xì)胞、 NK細(xì)胞免疫分子：抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、MHC、 TCR、粘附分子等第2頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四 Innate immunity 固有免疫 定義：人類在種系進(jìn)化過(guò)程中形成的、經(jīng)遺傳獲得 的免疫，遇病原體后首先并迅速起防衛(wèi)作 用的免疫應(yīng)答組成：皮膚、粘膜及其產(chǎn)物、細(xì)胞（NK細(xì)胞、單 核-吞噬細(xì)胞、DC、NKT、中性粒細(xì)胞、T 細(xì)胞

2、、B1細(xì)胞）等特點(diǎn)：先天具有、無(wú)潛伏期、無(wú)特異性、無(wú)記憶性 作用時(shí)間：0-96小時(shí)第3頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四 Adaptive immunity 獲得性(適應(yīng)性)免疫 定義：機(jī)體在生活過(guò)程中，因接觸抗原性物質(zhì)而獲 得的免疫。T、B細(xì)胞識(shí)別病原體成分后產(chǎn) 生的免疫應(yīng)答 特點(diǎn)：后天獲得、有潛伏期、特異性，記憶性 參與細(xì)胞：T細(xì)胞和 B細(xì)胞 起作用時(shí)間：晚，一般在感染后4-5天發(fā)揮作用第4頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四一、免疫細(xì)胞的種類與特征第5頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四 免疫細(xì)胞的分類根據(jù)免疫細(xì)胞在免疫應(yīng)答中

3、的作用可分為三類免疫活性細(xì)胞(immunocompetent cells)抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells, APC)其他細(xì)胞凡參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞，通稱為免疫細(xì)胞（immunocyte），其中包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞DC、肥大細(xì)胞、粒細(xì)胞等第6頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四第7頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四 免疫細(xì)胞的起源與分化第8頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四免疫活性細(xì)胞具有特異性抗原受體、在接受抗原刺激下發(fā)生克隆性活化、增值和分化，產(chǎn)生適

4、應(yīng)性免疫應(yīng)答（adaptive immune response)的細(xì)胞。這類細(xì)胞是機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞第9頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell, APC）加工處理抗原，將抗原肽提呈給抗原特異性淋巴細(xì)胞的一組免疫細(xì)胞。血液中主要的APC細(xì)胞主要包括單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞第10頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四其他細(xì)胞自然殺傷(NK)細(xì)胞，肥大細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，血小板等NK細(xì)胞肥大細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞血小板第11頁(yè)

5、，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四免疫細(xì)胞的特征1、免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征 理化性狀 生物學(xué)特性第12頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四免疫細(xì)胞的特征2、免疫細(xì)胞的表面分子特征：白細(xì)胞分化抗原指血細(xì)胞分化成熟為不同譜系、分化的不同階段以及細(xì)胞活化過(guò)程中,出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記分子聚類分化群(分化抗原，cluster of differentiation，CD)：應(yīng)用單克隆抗體鑒定為主的方法，將來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體所識(shí)別的同一分化抗原稱為CD抗原CD抗原常用于鑒定和檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志第13頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四人

6、CD分組分 組 CD（舉例）T細(xì)胞 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD152(CTLA4)、 CD154(CD40L)、CD272(BTLA)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2)B細(xì)胞 CD19、CD20、CD21、 CD40、CD79a(Ig)、CD79b (Ig)、 CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、 CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)髓樣細(xì)胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、 CD257(BAFF)、CD312(EMR2) 血小

7、板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、 CD61 (整合蛋白3) 、CD62P(P選凝素)NK細(xì)胞 CD16 (FcRIII) 、CD56(NCAM-1)、CD94、CD158(KIR)、 CD161(NKR-P1A)、CD314(NKG2D)、CD335(NKp46)、 CD336(NKp44)、CD337(NKp30) 非譜系 CD30、CD32(FcRII)、CD45RA、CD45RO、CD46(MCP)、 CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、 CD281CD284(TLR1-TLR4)、CD

8、289(TLR9)、 CD305(LAIR-1)、 CD306(LAIR-2)、CD319(CRACC) 第14頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四人CD分組分 組 CD（舉例）黏附分子 CD11a-CD11c、CD15、CD15s(sLx)、CD18 (整合蛋白2) 、 CD29 (整合蛋白1)、CD49aCD49f、CD54(ICAM-1)、 CD62E(E整合蛋白)、CD62L (L整合蛋白)、CD324(E-cadherin)、 CD325(N-cadherin)、CD326(EpCAM)細(xì)胞因子/ CD25(IL-2R)、CD95(Fas)、CD116-CDw13

9、7、CD178(FasL)、 趨化因子受體 CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD195(CCR5)、 CD261CD264(TRAIL-R1TRAIL-R4)內(nèi)皮細(xì)胞 CD105(TGF-RIII)、CD106(VCAM-1)、CD140(PDGFR)、 CD144(VE鈣黏蛋白)、CD299(DCSIGN-related)、 CD309(VEGFR2)、JAM1(CD321)、JAM2(CD322) 碳水化合物結(jié)構(gòu) CD15u、CD60aCD60c、CD75、CDw327CDw329(siglec6、7、9)樹(shù)突狀細(xì)胞 CD85(ILT/LIR)、CD273(B7DC)、

10、CD274CD276(B7H1-B7H3) 、 CD302(DCL1)、CD303(BDCA2)、CD304(BDCA4)干細(xì)胞/祖細(xì)胞 CD133、CD243 基質(zhì)細(xì)胞 CD292(BMPR1A)、CD293(BMPR1B)、 CD331CD334(FGFR1FGFR4)、CD339(Jagged-1)紅細(xì)胞 CD233CD242 第15頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四二、免疫細(xì)胞的分離技術(shù) （一）外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 （二）T淋巴細(xì)胞及其亞群的分離 （三）B淋巴細(xì)胞及其亞群的分離 （四）Mo/M分離技術(shù) （五） NK細(xì)胞的分離技術(shù) 第16頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5

11、月20日，9點(diǎn)50分，星期四免疫細(xì)胞分離基本原理 不同細(xì)胞密度不同 不同細(xì)胞表面生物學(xué)特性不同 不同細(xì)胞表面分化抗原不同第17頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢圆扇∠铝胁煌姆蛛x方法免疫細(xì)胞的分離技術(shù)1、密度梯度離心法2、黏附分離法（尼龍毛法、貼壁法、親和板法）3、磁性分離法4、熒光激活分離法5、其他分離法（花環(huán)沉降法）第18頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四（一）外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì) 胞 Ficoll分離液

12、法主要用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì) 胞，是根據(jù)不同細(xì)胞密度不同的分離法第19頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四不同細(xì)胞密度不同 單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的密度 為1.077左右 人的紅細(xì)胞密度為1.093，1.077 粒細(xì)胞密度為1.092， 1.077 血小板密度 1.077 第20頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四肝素抗凝靜脈血與等量Hanks液或PBS混勻沿管壁緩慢疊加于Ficoll分層液面上水平離心2000 rpm 20 min離心后管內(nèi)分三層，用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞洗滌細(xì)胞兩次RPMI1640重懸細(xì)胞臺(tái)盼蘭染液混合計(jì)數(shù)細(xì)

13、胞活力檢測(cè)：死的細(xì)胞可被染成蘭色，活細(xì)胞不著色活細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞百分率100總細(xì)胞數(shù) 方法用本法分離PBMC，一般純度在90以上，收獲率可達(dá)8090，活細(xì)胞百分率在95以上第21頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四（二）T淋巴細(xì)胞及其亞群的分離第22頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四T淋巴細(xì)胞亞群T細(xì)胞的發(fā)育階段分類 表達(dá)TCR的類型分類 是否表達(dá)CD4或CD8 T細(xì)胞功能分類 第23頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四T淋巴細(xì)胞亞群T細(xì)胞的發(fā)育階段分類 初始T細(xì)胞 naive T cells 未經(jīng)抗原刺激的成熟T細(xì)胞，表達(dá)CD45RA

14、效應(yīng)T細(xì)胞 effector T cells 表達(dá)高親和力IL-2R，介導(dǎo)免疫效應(yīng)記憶T細(xì)胞 memory T cells 表達(dá)CD45RO，介導(dǎo)再次免疫應(yīng)答第24頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)TCR的類型分類 TCR+ T細(xì)胞 TCR+ T細(xì)胞 第25頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四T淋巴細(xì)胞亞群是否表達(dá)CD4或CD8 CD4+ T細(xì)胞 CD8+ T細(xì)胞 第26頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四T淋巴細(xì)胞亞群T細(xì)胞功能分類 輔助性T細(xì)胞 Helper T cells , Th 效應(yīng)T細(xì)胞 Effecto

15、r T cells , TE細(xì)胞毒T細(xì)胞 Cytotoxic T lymphocytes, CTL遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)T細(xì)胞Delayed T cells，Td初始T細(xì)胞Naive T cells 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Regulatory T cells，Tr記憶T細(xì)胞Memory T cells，Tm抑制性T細(xì)胞Suppressor T cells，Ts 第27頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四輔助性T細(xì)胞 Helper T cells , Th Th1: 細(xì)胞免疫 Th2：體液免疫Th17：炎癥反應(yīng)第28頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四輔助性T細(xì)胞 Help

16、er T cells , ThTGF-+IL-6第29頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四輔助性T細(xì)胞 Helper T cells , Th濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfollicularhelper，Tfh）通過(guò)細(xì)胞因子IL-10和IL-21來(lái)調(diào)節(jié)B細(xì)胞的功能 第30頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的分化Foxp+T調(diào)節(jié)細(xì)胞可以從胸腺直接分化，也可在TGF-作用下從Foxp3-T細(xì)胞分化。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Regulatory T cells，Tr第31頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四玫瑰花結(jié)

17、法（E花環(huán)沉降法） 尼龍毛柱分離法 淘洗法免疫磁珠法流式細(xì)胞術(shù)分選法（二）T淋巴細(xì)胞及其亞群的分離第32頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四人T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)CD2分子，即綿羊紅細(xì)胞受體， B細(xì)胞則無(wú)。在適當(dāng)?shù)臈l件下，可與綿羊紅細(xì)胞（SRBC）結(jié)合，形成玫瑰花結(jié)（rosette）,因?yàn)榧t細(xì)胞環(huán)繞T細(xì)胞，形似花環(huán)，所以又稱E-花環(huán)（E-rosette）該實(shí)驗(yàn)常用于臨床檢測(cè)人外周血T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例，由此可間接反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀況 玫瑰花結(jié)法第33頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四淋巴細(xì)胞 + SRBC懸液 37C水浴 10 min 低溫低速離

18、心 T細(xì)胞形成E花環(huán)而沉于管底 懸液中為B細(xì)胞。 方法 第34頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過(guò)尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而T細(xì)胞不與尼龍毛粘附的特性，這是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法尼龍毛柱分離法第35頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四簡(jiǎn)單，快速，經(jīng)濟(jì)，尼龍毛可反復(fù)利用可分離大量細(xì)胞細(xì)胞不會(huì)被激活，可用于功能測(cè)定純度不高耗時(shí)優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 第36頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四也叫親合板結(jié)合分離法 (immune panning isolation）。利用親合

19、層析和抗體固相包被原理，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，由于各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同抗原性的特點(diǎn)和表面標(biāo)志，加細(xì)胞懸液后，凡抗原陽(yáng)性的細(xì)胞則與相應(yīng)的固相抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲取同理若用特異性抗原交聯(lián)于塑料板上，則可分離得到具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。但淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體連接后有可能引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時(shí)，本法更合適 淘洗法第37頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四親和板分離淋巴細(xì)胞示意圖第38頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四利用T淋巴細(xì)胞表面某種標(biāo)志性抗原與包被在固相載體上的特異性單抗結(jié)合

20、，將T細(xì)胞與其他細(xì)胞分離的方法T淋巴細(xì)胞淘洗分離原理第39頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四羊抗兔Ig包被平皿CD4 一抗培育T細(xì)胞，倒入平皿，4孵育1小時(shí)；收集未粘附的CD4-T細(xì)胞PBS漂洗非特異吸附的CD4-T細(xì)胞收集粘附的CD4+T細(xì)胞，可以用刮板刮取并在顯微鏡下觀察 方法 （以CD4+T細(xì)胞為例）第40頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒(méi)有磁性，不在磁場(chǎng)中

21、停留，從而使細(xì)胞得以分離 免疫磁珠法（Magnetic activated cell sorting, MACS）第41頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四第42頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四NS陽(yáng)性選擇法（正選）第43頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四NS陰性選擇法（負(fù)選） 第44頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四第45頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四免疫磁珠細(xì)胞分選裝置第46頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四第47頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)

22、50分，星期四將特異性抗T細(xì)胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合T細(xì)胞在磁場(chǎng)中，結(jié)合T細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細(xì)胞被洗脫下來(lái)撤離磁場(chǎng)，再?gòu)拿庖叽胖樯舷疵?T細(xì)胞 免疫磁珠法 陽(yáng)性選擇T細(xì)胞 第48頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四將多種特異性抗非T細(xì)胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非T細(xì)胞在磁場(chǎng)中，結(jié)合其它細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的T細(xì)胞被洗脫下來(lái)免疫磁珠法 陰性選擇T細(xì)胞 第49頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四CD4+ T Cell Isolatio

23、n Kit II Non-CD4+ T cells in PBMC, i.e., CD8+ T cells, / T cells, B cells, NK cells, dendritic cells, monocytes, granulocytes, and erythroid cells, are indirectly magnetically labeled by using a cocktail of biotin-conjugated antibodies against CD8, TCR /, CD19, CD56, CD14, CD16, CD36, CD123, and CD2

24、35a (glycophorin A). These cells are subsequently magnetically labeled with Anti-Biotin MicroBeads for depletion. Thereby, highly pure CD4+ T cells are obtained. 免疫磁珠法 陰性選擇CD4+ T細(xì)胞實(shí)例 PBMC before separation Untouched CD4+ T cells第50頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四熒光激活細(xì)胞分離法(fluorescence activated cell sor

25、ter, FACS)第51頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四FACS用途：用流式細(xì)胞儀對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門(mén)技術(shù)原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%第52頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四第53頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四 方法 （以CD4+ T細(xì)胞為例）PBMC用PBS洗滌，低溫離心棄上清；加入含AB血清的PBS封

26、閉，4孵育10分鐘；加入適量的PerCP-CD3，APC-CD4抗體，4孵育30分鐘；PBS洗滌，低溫離心棄上清并用RPMI 1640重懸；流式細(xì)胞術(shù)分選；第54頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四（三）B淋巴細(xì)胞及其亞群的分離如果僅考慮PBMC中T細(xì)胞和B細(xì)胞，那么所有從PBMC中分離T淋巴細(xì)胞的方法實(shí)際上也可用于分離B淋巴細(xì)胞。第55頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四B細(xì)胞表面標(biāo)志 SmIg、Fc受體、補(bǔ)體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志，其中以SmIg為B細(xì)胞所特有，是鑒定B細(xì)胞可靠的指標(biāo) CD19/CD5分子：可將B細(xì)胞區(qū)

27、分為B1細(xì)胞和B2細(xì)胞，B1細(xì)胞為CD19和CD5雙陽(yáng)性，而B(niǎo)2細(xì)胞僅為CD19陽(yáng)性，B2細(xì)胞為通常所指的B細(xì)胞 第56頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四終濃度5 mM L-leucine methyl ester (L-LME)重懸PMBC，混勻，室溫35s離心，400 g，10 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞重懸于25 ml RPMI 1640培養(yǎng)基，過(guò)尼龍毛柱，去除細(xì)胞團(tuán)塊玫瑰花結(jié)法去除T細(xì)胞抗CD19或CD20單抗標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)B細(xì)胞純度去除Mo/M法第57頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四將特異性抗B細(xì)胞表面分子CD19的單克隆抗體免

28、疫磁珠與PBMC混合，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合B細(xì)胞在磁場(chǎng)中，結(jié)合B細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細(xì)胞被洗脫下來(lái)撤離磁場(chǎng)，再?gòu)拿庖叽胖樯舷疵?CD19+B細(xì)胞 免疫磁珠法 陽(yáng)性選擇B細(xì)胞 第58頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四將多種特異性抗非B細(xì)胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非B細(xì)胞在磁場(chǎng)中，結(jié)合其它細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的B細(xì)胞被洗脫下來(lái)免疫磁珠法 陰性選擇B細(xì)胞 第59頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四B Cell Isolation Kit II Non-B cells, i.e.

29、, T cells, NK cells, monocytes, dendritic cells, granulocytes, platelets, and erythroid cells, are indirectly magnetically labeled using a cocktail of biotinylated CD2, CD16, CD14, CD36, CD43, and CD235a (glycophorin A) antibodies. These cells are subsequently magnetically labeled with Anti-Biotin M

30、icroBeads for depletion. Highly pure B cells are obtained by depletion of magnetically labeled non-B cells.PBMC before separation Untouched B cells免疫磁珠法 陰性選擇B細(xì)胞實(shí)例 第60頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四（四） Mo/M分離技術(shù) 單核-巨噬細(xì)胞包括骨髓中的前單核細(xì)胞、外周血中的單核細(xì)胞、以及組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞(M)。M來(lái)源于血液中的單核細(xì)胞，而單核細(xì)胞又來(lái)源于骨髓中的前體細(xì)胞。第61頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月2

31、0日，9點(diǎn)50分，星期四Mo/M細(xì)胞表面標(biāo)志 表面標(biāo)志抗原：CD14，但CD14也表達(dá)在粒細(xì)胞。 CD14主要強(qiáng)表達(dá)在單核-巨噬細(xì)胞，弱表達(dá)在粒細(xì)胞上第62頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四 無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液將PBMC 2106 cell/ml重懸；75 ml培養(yǎng)瓶中加入10 ml細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)箱內(nèi)37孵育1小時(shí)；吸盡培養(yǎng)液，RPMI 1640培養(yǎng)液漂洗2遍，去除非黏附細(xì)胞；細(xì)胞刮片輕輕刮取黏附的單核細(xì)胞。黏附法第63頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四快速，方便純度和得率均較低易引起Mo/M激活，引起基因表達(dá)和分泌蛋白優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 第6

32、4頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四將特異性抗單核細(xì)胞表面分子CD14的單克隆抗體免疫磁珠與PBMC混合，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合單核細(xì)胞在磁場(chǎng)中，結(jié)合單核細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細(xì)胞被洗脫下來(lái)撤離磁場(chǎng)，再?gòu)拿庖叽胖樯舷疵?CD14+單核細(xì)胞 免疫磁珠法 陽(yáng)性選擇單核細(xì)胞 第65頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四將多種特異性抗非單核細(xì)胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非單核細(xì)胞在磁場(chǎng)中，結(jié)合其它細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的單核細(xì)胞被洗脫下來(lái)免疫磁珠法 陰性選擇單核細(xì)胞 第66頁(yè)，共76頁(yè)，2

33、022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四Monocyte Isolation Kit II Non-monocytes, such as T cells, NK cells, B cells, dendritic cells, and basophils, are indirectly magnetically labeled using a cocktail of biotin-conjugated antibodies against CD3, CD7, CD56, CD19, CD16, CD123, and CD235a (Glycophorin A), as well as Anti-Biotin MicroBeads. Highly pure unlabeled monocytes are obtained by depletion of the magnetically labeled cells.PBMC before separation Untouched Monocytes免疫磁珠法 陰性選擇單核細(xì)胞第67頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期四PBMC用PBS洗滌，低溫離心棄上清加入含AB血清的PBS封閉，4孵育10分鐘加入適量的FITC-CD14抗體，4孵育30分鐘PBS洗滌，低溫離心棄上