免疫學試驗的技術

1、關于免疫學試驗技術第1頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四 概 論 第2頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四免疫學技術 利用免疫學反應的特異性原理建立的各種檢測與分析技術以及建立這些技術的各種制備方法。 包括 ：免疫血清學技術 用于抗原或抗體檢測的體外免疫反應技術；細胞免疫技術 用于研究機體細胞免疫功能與狀態(tài)的技術；免疫制備技術 指制備與免疫檢測有關制劑的各種技術。 第3頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四 一、細胞免疫技術 淋巴細胞計數與分類淋巴細胞功能測定細胞因子測定 E玫瑰花環(huán)試驗T細胞亞群檢測試驗淋巴細胞轉化試驗細胞毒性T細胞

2、試驗巨噬細胞移動抑制試驗白介素測定干擾素測定 用 途免疫機理 診斷 治療 藥物選擇類 型 + + - + + - - + + + - + + + - + + + - + + - + + + - + +體內細胞免疫試驗皮膚試驗+ + - +試驗名稱第4頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四 （一）淋巴細胞計數與分類 1. 淋巴細胞數量檢測技術1.1 T細胞E玫瑰花環(huán)試驗 檢測T細胞 T淋巴細胞表面CD2分子是綿羊紅細胞（SRBC）受體，也稱E受體，在一定條件下，SRBC環(huán)繞T細胞與之結合，形成花環(huán)狀，稱E花環(huán)（E-rosette），形成此種花環(huán)的細胞稱E花環(huán)形成細胞。 1.2

3、EA玫瑰花環(huán)試驗 檢測B細胞 B淋巴細胞有表面Fc受體，以雞紅細胞作為指示細胞與相應的抗紅細胞抗體形成EA，B淋巴細胞可以通過Fc受體與EA形成花環(huán)，以此計算B淋巴細胞的數目。 1.3 EAC玫瑰花環(huán)試驗 檢測B細胞 B淋巴細胞表面具有補體C3受體，紅細胞可與相應的抗體結合形成抗原抗體復合物（EA），進而與補體結合( EAC)，然后與B淋巴細胞表面的補體C3受體結合而形成花環(huán)，以供計數B淋巴細胞。 第5頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四第6頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四第7頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四1.4 酯酶染色法

4、 ANAE+ 檢測T細胞 T淋巴細胞的胞漿內存在著酸性a 醋酸萘酯酶(ANAE+ )，在酸性條件下，能使底物醋酸萘酯水解產生a 萘酚， 而a 萘酚與六偶氮副品紅作用形成不溶性的紅色沉淀物而沉積在T淋巴細胞胞漿內酯酶所在的部位。第8頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四2.T細胞亞群檢測技術 T細胞總數：CD3；TH:CD4；Tc:CD8 應用針對CD抗原的單抗來鑒別各T細胞亞群。 2.1 間接免疫熒光法 分離淋巴細胞 CD單抗 熒光二抗 鏡檢計數 2.2 流式細胞術 分離淋巴細胞 CD單抗 熒光二抗 FACS測試管 計數 第9頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，

5、星期四（二）淋巴細胞功能測定 淋巴細胞轉化試驗 淋巴細胞在體外培養(yǎng)時，受到非特異性有絲分裂原（如PHA、ConA）或特異性抗原刺激后，可出現代謝旺盛、蛋白質和核酸合成增加、細胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞，此稱為淋巴細胞轉化現象。淋巴細胞轉化率的高低，可以反映機體的細胞免疫水平，因此，可作為測定機體免疫功能的指標之一。 淋巴胞轉化試驗的方法有形態(tài)學方法、MTT法、3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法。第10頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四A、形態(tài)學方法1、原理 淋巴細胞在體外培養(yǎng)過程中受有絲分裂原如植物血凝素（PHA）等刺激后，可轉化為體積較大的母細胞，胞漿增多

6、而深染，核增大并可見核仁部分細胞可出現有絲分裂，計數轉化細胞的百分率可反映機體的細胞免疫功能。第11頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四2、方法 （1）取無菌肝素抗凝血0.1ml，加入1.8ml細胞培養(yǎng)液中，同時加入PHA（1000g/ml）0.1ml，對照管不加PHA，將細胞置37、5%CO2培養(yǎng)3天，每天搖動1次。 （2）培養(yǎng)結束時吸棄大部分上清液，加入4mlNH4Cl（8.5g/L）混勻，置37水浴10min。 （3）2500r/min離心10min后棄去上清液，沉淀加5ml固定液，室溫作用10min。 （4）離心（2500r/min，10min）后棄上清液，留0.2

7、ml沉淀細胞制片，迅速吹干。 （5）吉姆薩染色1020min，水洗，干燥。 （6）油鏡計數200個淋巴細胞中轉化的細胞數，計算轉化率。第12頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四3、結果 （1）淋巴母細胞的形態(tài)學標準是細胞核的大小，核與胞漿的比例、胞漿染色性及核的構造與核仁的有無。 成熟的小淋巴細胞：與未經培養(yǎng)的小淋巴細胞一樣為68m，核染色質致密，無核仁，核與胞漿比例大，胞漿染色為輕度嗜堿性。過渡型淋巴細胞：比小淋巴細胞大，約1020m，核染色質致密，但出現核仁，此為與成熟小淋巴細胞鑒別要點。淋巴母細胞：細胞體積增大，約2030m，形態(tài)不整齊，常有小突出，核變大，核染色質疏

8、松，有核仁12個，胞漿變多，常出現胞漿空泡。其它細胞：如中性粒細胞在培養(yǎng)72h后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。第13頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四（2）淋巴細胞轉化率的計算按上述分類檢查推片頭體尾三部分，計數200個淋巴細胞，算出百分率。轉化的淋巴細胞包括淋巴母細胞和過渡型淋巴細胞，未轉化的淋巴細胞指的是成熟的小淋巴細胞。在正常情況下，PHA誘導的淋巴細胞轉化率為60%-80%，如為50%-60%則偏低，50%以下則為降低。圖 淋巴細胞轉化示意圖第14頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四B、MTT法1、原理 MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量反應比色法。M

9、TT是一種噻唑鹽，化學名3-（4，5二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯溴化四唑，水溶液為黃橙色。淋巴細胞受到ConA作用紅發(fā)生增殖活化，其胞內線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應升高，MTT作為其底物參與反應，形成藍色的甲臢顆粒沉積于細胞內或細胞周圍，經SDS/鹽酸-異丙醇溶解為藍色溶液，可用酶標測定儀測定細胞培養(yǎng)物的OD值，測定波長570nm。根據OD值的大小計算反應體系中細胞增殖程度。第15頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四2、方法（1）淋巴細胞的分離與培養(yǎng) 常用來分離淋巴細胞的分層液（聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(FH)分層液，比重是 1.0770.

10、001 ）。 Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400,000，當密度為1.2gml時仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到淋巴細胞。第16頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四 取抗凝血1ml，加入37預溫的PH7.4 0.01M PBS溶液1ml，混勻后加在1ml淋巴細胞分離液上，2500rlmin離心10分鐘，用毛細滴管尖伸入單核細胞層，經輕吸出全部細胞懸液。用37預溫

11、的PH7.4 0.01M PBS溶液洗2次，第一次2500r/min15分鐘。第二次10分鐘。棄上清，將沉積細胞用pH7.4含10%小牛血清的RPMI-1640營養(yǎng)液液配成12106個/ml的單細胞懸液，100l/孔，接種于96孔平板，并加入適量的ConA液。置37、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。第17頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四第18頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四（2）加入5mg/ml的MTT溶液(10l/孔)，于振蕩器上混勻后約1min，置37、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時。（3）取出培養(yǎng)板，每孔加入10%SDS-0.01

12、mol/LHCL100ul, 置37、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時后，取出，室溫下將平板置于微孔板振蕩器上振蕩10分鐘，使結晶物溶解。（4）使用酶聯(lián)檢測儀檢測波長570nm下的吸光度值。第19頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四【注意事項】1.操作應輕柔，細胞懸液應充分混勻，避免損傷細胞活性及細胞丟失。2.細胞分層液在室溫下應為(l.0770.001) g/L；應避光4 下保存，取出后逐漸升至室溫后混勻，方可使用。使用中應避免細菌污染。3.稀釋血液可降低紅細胞的凝集，提高淋巴細胞收獲量，但如果要保留血漿成分作其他實驗用時，則不能稀釋血液，以免影響血漿成分。第20頁，共22頁，2022年，5月20日，9點47分，星期四C、3H-TdR摻入法： 正常情況下，細胞通常處于細胞周期的G0期，受特異性抗原或絲裂原激活后，從G0期進入G1期，并合成蛋白質、RNA和DNA前體物質等，為DNA復制準備物質基礎，然后進入S期，細胞合成D