免疫學(xué)試驗(yàn)的技術(shù)

1、關(guān)于免疫學(xué)試驗(yàn)技術(shù)第1頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四 概 論 第2頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四免疫學(xué)技術(shù) 利用免疫學(xué)反應(yīng)的特異性原理建立的各種檢測(cè)與分析技術(shù)以及建立這些技術(shù)的各種制備方法。 包括 ：免疫血清學(xué)技術(shù) 用于抗原或抗體檢測(cè)的體外免疫反應(yīng)技術(shù)；細(xì)胞免疫技術(shù) 用于研究機(jī)體細(xì)胞免疫功能與狀態(tài)的技術(shù)；免疫制備技術(shù) 指制備與免疫檢測(cè)有關(guān)制劑的各種技術(shù)。 第3頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四 一、細(xì)胞免疫技術(shù) 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類淋巴細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞因子測(cè)定 E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)T細(xì)胞亞群檢測(cè)試驗(yàn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞

2、試驗(yàn)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制試驗(yàn)白介素測(cè)定干擾素測(cè)定 用 途免疫機(jī)理 診斷 治療 藥物選擇類 型 + + - + + - - + + + - + + + - + + + - + + - + + + - + +體內(nèi)細(xì)胞免疫試驗(yàn)皮膚試驗(yàn)+ + - +試驗(yàn)名稱第4頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四 （一）淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類 1. 淋巴細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)技術(shù)1.1 T細(xì)胞E玫瑰花環(huán)試驗(yàn) 檢測(cè)T細(xì)胞 T淋巴細(xì)胞表面CD2分子是綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體，也稱E受體，在一定條件下，SRBC環(huán)繞T細(xì)胞與之結(jié)合，形成花環(huán)狀，稱E花環(huán)（E-rosette），形成此種花環(huán)的細(xì)胞稱E花環(huán)形成細(xì)胞。 1.2

3、EA玫瑰花環(huán)試驗(yàn) 檢測(cè)B細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞有表面Fc受體，以雞紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞與相應(yīng)的抗紅細(xì)胞抗體形成EA，B淋巴細(xì)胞可以通過Fc受體與EA形成花環(huán)，以此計(jì)算B淋巴細(xì)胞的數(shù)目。 1.3 EAC玫瑰花環(huán)試驗(yàn) 檢測(cè)B細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞表面具有補(bǔ)體C3受體，紅細(xì)胞可與相應(yīng)的抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物（EA），進(jìn)而與補(bǔ)體結(jié)合( EAC)，然后與B淋巴細(xì)胞表面的補(bǔ)體C3受體結(jié)合而形成花環(huán)，以供計(jì)數(shù)B淋巴細(xì)胞。 第5頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四第6頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四第7頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四1.4 酯酶染色法

4、 ANAE+ 檢測(cè)T細(xì)胞 T淋巴細(xì)胞的胞漿內(nèi)存在著酸性a 醋酸萘酯酶(ANAE+ )，在酸性條件下，能使底物醋酸萘酯水解產(chǎn)生a 萘酚， 而a 萘酚與六偶氮副品紅作用形成不溶性的紅色沉淀物而沉積在T淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)酯酶所在的部位。第8頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四2.T細(xì)胞亞群檢測(cè)技術(shù) T細(xì)胞總數(shù)：CD3；TH:CD4；Tc:CD8 應(yīng)用針對(duì)CD抗原的單抗來(lái)鑒別各T細(xì)胞亞群。 2.1 間接免疫熒光法 分離淋巴細(xì)胞 CD單抗 熒光二抗 鏡檢計(jì)數(shù) 2.2 流式細(xì)胞術(shù) 分離淋巴細(xì)胞 CD單抗 熒光二抗 FACS測(cè)試管 計(jì)數(shù) 第9頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，

5、星期四（二）淋巴細(xì)胞功能測(cè)定 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，受到非特異性有絲分裂原（如PHA、ConA）或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細(xì)胞體積增大并能進(jìn)行分裂的淋巴母細(xì)胞，此稱為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低，可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，因此，可作為測(cè)定機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一。 淋巴胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的方法有形態(tài)學(xué)方法、MTT法、3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法。第10頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四A、形態(tài)學(xué)方法1、原理 淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中受有絲分裂原如植物血凝素（PHA）等刺激后，可轉(zhuǎn)化為體積較大的母細(xì)胞，胞漿增多

6、而深染，核增大并可見核仁部分細(xì)胞可出現(xiàn)有絲分裂，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的百分率可反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。第11頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四2、方法 （1）取無(wú)菌肝素抗凝血0.1ml，加入1.8ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，同時(shí)加入PHA（1000g/ml）0.1ml，對(duì)照管不加PHA，將細(xì)胞置37、5%CO2培養(yǎng)3天，每天搖動(dòng)1次。 （2）培養(yǎng)結(jié)束時(shí)吸棄大部分上清液，加入4mlNH4Cl（8.5g/L）混勻，置37水浴10min。 （3）2500r/min離心10min后棄去上清液，沉淀加5ml固定液，室溫作用10min。 （4）離心（2500r/min，10min）后棄上清液，留0.2

7、ml沉淀細(xì)胞制片，迅速吹干。 （5）吉姆薩染色1020min，水洗，干燥。 （6）油鏡計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞中轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。第12頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四3、結(jié)果 （1）淋巴母細(xì)胞的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞核的大小，核與胞漿的比例、胞漿染色性及核的構(gòu)造與核仁的有無(wú)。 成熟的小淋巴細(xì)胞：與未經(jīng)培養(yǎng)的小淋巴細(xì)胞一樣為68m，核染色質(zhì)致密，無(wú)核仁，核與胞漿比例大，胞漿染色為輕度嗜堿性。過渡型淋巴細(xì)胞：比小淋巴細(xì)胞大，約1020m，核染色質(zhì)致密，但出現(xiàn)核仁，此為與成熟小淋巴細(xì)胞鑒別要點(diǎn)。淋巴母細(xì)胞：細(xì)胞體積增大，約2030m，形態(tài)不整齊，常有小突出，核變大，核染色質(zhì)疏

8、松，有核仁12個(gè)，胞漿變多，常出現(xiàn)胞漿空泡。其它細(xì)胞：如中性粒細(xì)胞在培養(yǎng)72h后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。第13頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四（2）淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的計(jì)算按上述分類檢查推片頭體尾三部分，計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，算出百分率。轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞包括淋巴母細(xì)胞和過渡型淋巴細(xì)胞，未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞指的是成熟的小淋巴細(xì)胞。在正常情況下，PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為60%-80%，如為50%-60%則偏低，50%以下則為降低。圖 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化示意圖第14頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四B、MTT法1、原理 MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量反應(yīng)比色法。M

9、TT是一種噻唑鹽，化學(xué)名3-（4，5二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯溴化四唑，水溶液為黃橙色。淋巴細(xì)胞受到ConA作用紅發(fā)生增殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高，MTT作為其底物參與反應(yīng)，形成藍(lán)色的甲臢顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，經(jīng)SDS/鹽酸-異丙醇溶解為藍(lán)色溶液，可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的OD值，測(cè)定波長(zhǎng)570nm。根據(jù)OD值的大小計(jì)算反應(yīng)體系中細(xì)胞增殖程度。第15頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四2、方法（1）淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 常用來(lái)分離淋巴細(xì)胞的分層液（聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(FH)分層液，比重是 1.0770.

10、001 ）。 Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400,000，當(dāng)密度為1.2gml時(shí)仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到淋巴細(xì)胞。第16頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四 取抗凝血1ml，加入37預(yù)溫的PH7.4 0.01M PBS溶液1ml，混勻后加在1ml淋巴細(xì)胞分離液上，2500rlmin離心10分鐘，用毛細(xì)滴管尖伸入單核細(xì)胞層，經(jīng)輕吸出全部細(xì)胞懸液。用37預(yù)溫

11、的PH7.4 0.01M PBS溶液洗2次，第一次2500r/min15分鐘。第二次10分鐘。棄上清，將沉積細(xì)胞用pH7.4含10%小牛血清的RPMI-1640營(yíng)養(yǎng)液液配成12106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，100l/孔，接種于96孔平板，并加入適量的ConA液。置37、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。第17頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四第18頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四（2）加入5mg/ml的MTT溶液(10l/孔)，于振蕩器上混勻后約1min，置37、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)。（3）取出培養(yǎng)板，每孔加入10%SDS-0.01

12、mol/LHCL100ul, 置37、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)后，取出，室溫下將平板置于微孔板振蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。（4）使用酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570nm下的吸光度值。第19頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四【注意事項(xiàng)】1.操作應(yīng)輕柔，細(xì)胞懸液應(yīng)充分混勻，避免損傷細(xì)胞活性及細(xì)胞丟失。2.細(xì)胞分層液在室溫下應(yīng)為(l.0770.001) g/L；應(yīng)避光4 下保存，取出后逐漸升至室溫后混勻，方可使用。使用中應(yīng)避免細(xì)菌污染。3.稀釋血液可降低紅細(xì)胞的凝集，提高淋巴細(xì)胞收獲量，但如果要保留血漿成分作其他實(shí)驗(yàn)用時(shí)，則不能稀釋血液，以免影響血漿成分。第20頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)47分，星期四C、3H-TdR摻入法： 正常情況下，細(xì)胞通常處于細(xì)胞周期的G0期，受特異性抗原或絲裂原激活后，從G0期進(jìn)入G1期，并合成蛋白質(zhì)、RNA和DNA前體物質(zhì)等，為DNA復(fù)制準(zhǔn)備物質(zhì)基礎(chǔ)，然后進(jìn)入S期，細(xì)胞合成D