人巨噬細胞炎性蛋白2MIP

1、人巨噬細胞炎性蛋白2 （MIP-2） ELISA分析檢測試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的:本試劑盒用于測定小鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中轉(zhuǎn)化生長因子（MIP-2） 的含量。實驗原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人巨噬細胞炎性蛋白2（MIP-2）水平。用純化的轉(zhuǎn)化生長因子（MIP-2）抗體包被微孔板，制成固相抗 體，往包被單抗的微孔中依次加入轉(zhuǎn)化生長因子（MIP-2），再與HRP標記的羊 抗鼠抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。 顏色的深淺和樣品中的轉(zhuǎn)化生長因子（MIP-2）呈

2、正相關(guān)。用酶標儀在450nm波 長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人巨噬細胞炎性蛋白2（MIP-2）濃度。試劑盒內(nèi)容及其配制：試劑盒成份96孔配置48孔配置96/48人份酶 標板1塊板（96T）半塊板（48T）塑料膜板蓋1塊半塊標準品： 100ng/ml1瓶(1.0ml)1瓶(0.5ml)空白對照1瓶(1.0ml)1瓶(0.5ml)標準品稀釋緩 沖液1瓶(8.0ml)1瓶(4.0ml)生物素標記的 抗OT抗體1瓶(8.0ml)1瓶(4.0ml)親和鏈酶素-HRP1瓶(12ml)1 瓶(5ml)洗滌緩沖液1瓶(20ml)1 瓶(10ml)底物A1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)底

3、物B1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)終止液1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)試劑盒組成:試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份封板膜2 片(48)2 片(96)密封袋1個1個酶標包被板1X481X962-8 C保存標準品：45“ mol/L0.5ml X 1 瓶0.5ml X 1 瓶2-8 C保存標準品稀釋液1.5ml X 1 瓶1.5ml X 1 瓶2-8 C保存酶標試劑3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存樣品稀釋液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑A液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑B液3 ml X 1

4、 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存終止液3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存濃縮洗滌液(20ml X 20 倍)X1 瓶(20ml X 30 倍)X1瓶2-8 C保存自備材料：蒸餾水。加樣器：5ul、10ul 、 50ul 、 lOOul 、200ul 、500ul、lOOOul。振蕩器及磁力攪拌器等。樣品收集、處理及保存方法：1、血清操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收 集血液后，1000 Xg離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。2、血漿EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000 Xg離心30分鐘 去除顆粒。3、細胞上清液1000 Xg離心

5、10分鐘去除顆粒和聚合物。4、組織勻漿將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000 Xg離心10分鐘，取 上清液。5、保存如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70C保存，避免反復(fù) 冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心 或過濾。不要在37C或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻 地充分解凍。人巨噬細胞炎性蛋白2ELISA試劑盒操作注意事項：試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟 棄，不可保存。實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使 用。使用一次性的吸頭以

6、免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使 用帶金屬部分的加樣器。使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份 及樣品。底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴 露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。安全性：避免直接接觸終止液和底物A、B，旦接觸到這些液體，請盡快用水沖 洗。實難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。試劑的準備：標準品：標準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。

7、稀釋比例按下表中進行：100 ng/ml（6號標 準品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul50 ng/ml（5號標 準品）100ul的原倍標準品 加入100ul的標準品 稀釋液25 ng/ml（4號標 準品）100ul的5號標準品加 入100ul的標準品稀 釋液12.5 ng/ml（3號標 準品）100ul的4號標準品加 入100ul的標準品稀 釋液6.25 ng/ml（2號標 準品）100ul的3號標準品加 入100ul的標準品稀 釋液3.12 ng/ml（1號標 準品）100ul的2號標準品加 入100ul的標準品稀 釋液0 ng/ml（空白對 照）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul洗滌緩沖液

8、（50X ）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。試劑盒性能：靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回 歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。特異性：不與其它細胞因子反應(yīng)。人巨噬細胞炎性蛋白2ELISA檢測試劑盒操作步驟：使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣 時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和 空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50 ul于反 應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50 ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻

9、， 37C溫育45分鐘。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍 干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37C溫育30分鐘。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍 干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37C溫育5分鐘。避免光 照。取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。在450nm波長處測定各孔的OD值。結(jié)果判斷與分析：1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值2、以吸光度OD值為縱坐標(Y )，相應(yīng)的OT標準品濃度為橫坐標(X )，做得