實(shí)驗(yàn)室啤酒發(fā)酵教案

1、71/71實(shí)驗(yàn)室啤酒發(fā)酵講義實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏煜れo止培養(yǎng)操作，觀看啤酒發(fā)酵過(guò)程，掌握發(fā)酵過(guò)程中一些指標(biāo)的分析操作技能。實(shí)驗(yàn)原理：啤酒酵母將麥芽汁發(fā)酵，產(chǎn)生酒精等發(fā)酵產(chǎn)物（啤酒）。三、實(shí)驗(yàn)器材：. 100升發(fā)酵罐。 . 010O BX糖度表。 (3).10-30可調(diào)生化培養(yǎng)箱。培養(yǎng)基：麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基10 Plato, 50升，糖化制取。麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：麥芽汁加2瓊脂，自然pH。麥芽汁液體培養(yǎng)基：酵母擴(kuò)大培養(yǎng)用。 菌種：啤酒生產(chǎn)用酵母菌株。四、實(shí)驗(yàn)步驟：（1）麥汁制備 （2）酵母菌種分離純化與質(zhì)量鑒定 （3）菌種擴(kuò)大培養(yǎng)（4）啤酒主發(fā)酵：麥汁50升，10OBX ，11接種量1.5107個(gè)細(xì)胞/mL

2、主發(fā)酵，11，57天至4.0OBX時(shí)結(jié)束（嫩啤酒）。在主發(fā)酵過(guò)程中，每天測(cè)定下列項(xiàng)目：糖度、細(xì)胞濃度、出芽率、染色率、酸度、-氨基氮、還原糖、酒精度 、pH、雙乙酰。然后以時(shí)刻為橫坐標(biāo)，這些指標(biāo)為縱坐標(biāo)，疊畫(huà)于方格紙上。（5）后發(fā)酵五、作業(yè)要求（1）. 畫(huà)動(dòng)身酵周期中上述上述指標(biāo)的曲線圖，并解釋它們的變化。（2）. 記下操作體會(huì)與注意點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)一 協(xié)定法糖化試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簠f(xié)定法糖化試驗(yàn)是歐洲啤酒釀造協(xié)會(huì)（EBC）推舉的評(píng)價(jià)麥芽質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)方法，我們用該法進(jìn)行小量麥芽汁制備，并借此評(píng)價(jià)所用麥芽的質(zhì)量。二、實(shí)驗(yàn)原理：利用麥芽所含的各種酶類將麥芽中的淀粉分解為可發(fā)酵性糖類，蛋白質(zhì)分解為氨基酸（具體參

3、見(jiàn)理論部分第二節(jié)）。三、實(shí)驗(yàn)器材和試劑：1 實(shí)驗(yàn)室糖化器：由水浴和500600 mL的燒杯組成糖化儀器，杯內(nèi)用玻棒攪拌或用100溫度計(jì)作攪拌器（現(xiàn)在攪拌應(yīng)十分小心，以免敲碎水銀頭）。實(shí)驗(yàn)時(shí)杯內(nèi)液面應(yīng)始終低于水浴液面。最好采納專用糖化器：該儀器有一水浴，水浴本身有電熱器加熱和機(jī)械攪拌裝置。水浴上有48個(gè)孔，每個(gè)孔內(nèi)可放一糖化杯，糖化杯由紫銅或不銹鋼制成，每一杯內(nèi)都帶有攪拌器，轉(zhuǎn)速為80100轉(zhuǎn)/分，攪拌器的螺旋槳直徑幾乎與糖化杯同，但又不碰杯壁，它離杯底距離只有12 mm。2 白色滴板或瓷板，玻棒或溫度計(jì)。濾紙，漏斗，電爐。碘溶液，0.02N： 2.5克碘和5克碘化鉀溶于水中，稀釋到1000毫升

4、。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 協(xié)定法糖化麥汁的制備（1）取50g麥芽，用植物粉碎機(jī)將其粉碎。（2）在已知重量的糖化杯（500600 mL燒杯或?qū)Ｓ媒饘俦┲?，放?0g麥芽粉，加200mL 4647的水，于不斷攪拌下在45水浴中保溫30分鐘。（3）使醪液以每分鐘升溫1的速度，升溫加熱水浴，在25分鐘內(nèi)升至70?，F(xiàn)在于杯內(nèi)加入100 mL 70的水。（4）70保溫1小時(shí)后，在1015分鐘內(nèi)急速冷卻到室溫。（5）沖洗攪拌器。擦干糖化杯外壁，加水使其內(nèi)容物準(zhǔn)確稱量為450g。（6）用玻棒攪動(dòng)糖化醪 ，并注于干漏斗中進(jìn)行過(guò)濾，漏斗內(nèi)裝有直徑20厘米的折疊濾紙，濾紙的邊沿不得超出漏斗的上沿。（7）收集約100mL

5、濾液后，將濾液返回重濾。過(guò)30分鐘后，為加速過(guò)濾可用一玻棒稍稍攪碎麥槽層。將整個(gè)濾液收集于一干燒杯中。在進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)前，需將濾液攪勻。糖化時(shí)刻的測(cè)定 在協(xié)定法糖化過(guò)程中，糖化醪溫度達(dá)70時(shí)記錄時(shí)刻，5分鐘后用玻棒或溫度計(jì)取麥芽汁1滴，置于白滴板（或瓷板）上，再加碘液1滴，混合，觀看顏色變化。 每隔5分鐘重復(fù)上述操作，直至碘液呈黃色（不變色）為止，記錄現(xiàn)在間。由糖化醪溫度達(dá)到70開(kāi)始至糖化完全無(wú)淀粉反應(yīng)時(shí)止，所需時(shí)刻為糖化時(shí)刻。報(bào)告以每5分鐘計(jì)算：如 10分鐘 1015分鐘 1520分鐘等 正常范圍值淺色麥芽：15分鐘內(nèi)深色麥芽：35分鐘內(nèi)過(guò)濾速度的測(cè)定以從麥汁返回重濾開(kāi)始至全部麥芽汁濾完為止所

6、需的時(shí)刻來(lái)計(jì)算，以快、正常和慢等來(lái)表示，1小時(shí)內(nèi)完成過(guò)濾的規(guī)定為“正?！?，過(guò)濾時(shí)刻超過(guò)1小時(shí)的報(bào)告為“慢”。氣味的檢查糖化過(guò)程中注意糖化醪的氣味。具有相應(yīng)麥芽類型的氣味規(guī)定為“正常,因此對(duì)深色麥芽若有芳香味，應(yīng)報(bào)以“正常”；若樣品缺乏此味，則以“不正常”表示，其它異味亦應(yīng)注明。透明度的檢查 麥汁的透明度用透明、微霧、霧狀和混濁表示。蛋白質(zhì)凝固情況檢查強(qiáng)烈煮沸麥芽汁5分鐘，觀看蛋白質(zhì)凝固情況。在透亮麥芽汁中凝聚有大塊絮狀蛋白質(zhì)沉淀，記錄為“好”；若蛋白質(zhì)凝聚細(xì)粒狀，但麥汁仍透明清亮，則記錄為“細(xì)小”；若雖有沉淀形成，但麥芽汁不清，可表示為“不完全”；若沒(méi)有蛋白質(zhì)凝固，則記錄為“無(wú)”。五、注意事項(xiàng)

7、：粉碎最好用EBC粉碎機(jī)，若用1號(hào)篩粉碎，細(xì)粉約占90%，用2號(hào)篩粉碎細(xì)粉約占25%。對(duì)溶解度好的麥芽，建議用2號(hào)篩。因?yàn)榧?xì)粉太多阻礙過(guò)濾速度。一般要求粗粒與細(xì)粒(包括細(xì)粉)的比例達(dá)1：2.5以上。麥皮在麥汁過(guò)濾時(shí)形成自然過(guò)濾層，因而要求破而不碎。假如麥皮粉碎過(guò)細(xì)，不但會(huì)造成麥汁過(guò)濾困難，而且麥皮中的多酚、色素等溶出量增加，會(huì)阻礙啤酒的色澤和口味。但麥皮粉碎過(guò)粗，難以形成致密的過(guò)濾層，會(huì)阻礙麥汁濁度和得率。麥芽胚乳是浸出物的要緊部分，應(yīng)粉碎得細(xì)些。為了使麥皮破而不碎，最好稍加回潮后進(jìn)行粉碎。六、考慮題：糖化過(guò)程中麥芽中各種酶的作用。實(shí)驗(yàn)二 啤酒酵母純種分離實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)酵母菌種的純種分離技術(shù)二

8、、實(shí)驗(yàn)原理：關(guān)于純種分離，在基礎(chǔ)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中已學(xué)過(guò)稀釋分離法和劃線分離法，那個(gè)地點(diǎn)不再重復(fù)。這兩種方法盡管簡(jiǎn)單，但并不能保證分離所得種的純度。而單細(xì)胞分離法因可用顯微鏡直接檢查，其純度能得到充分保證。 林德奈單細(xì)胞分離法，即小滴培養(yǎng)法，是將酵母菌液充分稀釋至每一小滴差不多含一個(gè)酵母細(xì)胞，然后在顯微鏡下確證只含一個(gè)細(xì)胞的小滴，經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，擴(kuò)大保存。 蓋玻片上小滴點(diǎn)樣示意圖 凹載片上濕室小滴培養(yǎng)適宜圖三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑：顯微鏡，凹載玻片，計(jì)數(shù)板，蓋玻片等。四、實(shí)驗(yàn)步驟：取2塊蓋玻片，用分析天平稱重（精確至0.1mg）后，在一塊蓋玻片（最好用血球計(jì)數(shù)板的蓋玻片）上用毛細(xì)滴管滴上9滴酵母培養(yǎng)基，合

9、上另一玻片，再稱重，計(jì)算每滴培養(yǎng)基的體積。用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌，用培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行高倍稀釋，稀釋至每滴培養(yǎng)基中大致含一個(gè)酵母菌。在已滅菌的蓋玻片上滴上酵母稀釋液（每張玻片可滴9滴），放于已滅菌的凹載玻片上，顯微鏡下觀看，找到只含一個(gè)酵母菌的小滴，做上記號(hào)。30培養(yǎng)一定時(shí)刻后（應(yīng)放于濕室中），用無(wú)菌濾紙片吸走標(biāo)記的酵母菌，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和菌種保藏。五、注意事項(xiàng)：因小滴易干，操作時(shí)動(dòng)作要快，培養(yǎng)時(shí)要用濕室。六、考慮題：稱重時(shí)什么緣故要用兩塊蓋玻片？是否能夠用微量移液器（如1微升）來(lái)代替稱重？實(shí)驗(yàn)三 啤酒酵母的計(jì)數(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母數(shù)量的方法，實(shí)驗(yàn)原理：啤酒發(fā)酵時(shí)，必須接入一定數(shù)量的酵

10、母細(xì)胞；在發(fā)酵過(guò)程中，為了跟蹤發(fā)酵的進(jìn)程，推斷發(fā)酵是否正常，也有必要測(cè)定懸浮酵母細(xì)胞的濃度。酵母菌的計(jì)數(shù)常用血球計(jì)數(shù)板方法。血球計(jì)數(shù)板是一塊長(zhǎng)方形的玻璃板，被四條凹槽分隔成三個(gè)部分，中間部分又被一橫槽隔成上下兩半，每一半上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，方格網(wǎng)的邊長(zhǎng)為3mm,分為9個(gè)正方形大格，每一大格為1mm2,其中中間那個(gè)大格被橫向和縱向的雙線分成25（或16）個(gè)中格，每個(gè)中格又被單線分成16（或25）個(gè)小格，因此一個(gè)大格中共有2516=400個(gè)小格。如此的一個(gè)大格確實(shí)是一個(gè)計(jì)數(shù)室。由于計(jì)數(shù)室比板表面要低0.1mm,因此蓋上蓋玻片后，整個(gè)計(jì)數(shù)室的容積確實(shí)是0.1 mm3,相當(dāng)于0.0001mL。 計(jì)數(shù)時(shí)

11、，先讓計(jì)數(shù)室中充滿待檢溶液，然后計(jì)數(shù)400個(gè)小格中的細(xì)胞總數(shù)，就可換算出1mL發(fā)酵液中的總菌數(shù)。三、實(shí)驗(yàn)器材：顯微鏡，血球計(jì)數(shù)板，蓋玻片等。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1. 取清潔的血球計(jì)數(shù)板一塊，平放于桌面上，在計(jì)數(shù)室上方加蓋專用蓋玻片；2. 取酵母菌液（發(fā)酵液）一小滴，滴至蓋玻片的邊緣，讓菌液滲入計(jì)數(shù)室內(nèi)，注意計(jì)數(shù)室內(nèi)不能留有氣泡。3. 靜置5分鐘，讓酵母細(xì)胞穩(wěn)定附著于計(jì)數(shù)室內(nèi)；4. 將計(jì)數(shù)板置于顯微鏡的載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)板的方格網(wǎng)，并移至視野中間（查找時(shí)可通過(guò)縮小光圈，降低聚光鏡，開(kāi)低電源電壓等方式減少進(jìn)光量，使視野稍偏暗）；5. 找到計(jì)數(shù)室位置（中間一個(gè)大方格），并看清由雙線包圍的中方格（

12、16或25格）及由單線包圍的小方格（共400格）；6. 計(jì)數(shù)大格內(nèi)的酵母細(xì)胞總數(shù)，必要時(shí)可在高倍鏡下觀看。 若酵母細(xì)胞過(guò)多，可采取（1）：稀釋后再計(jì)數(shù)；（2）：有代表性地選擇左上，左下，右上，右下，中間五個(gè)中方格，計(jì)數(shù)其內(nèi)的菌數(shù)，求得每個(gè)中格的平均值，然后乘以中方格數(shù)（25或16），即得每個(gè)大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)；（3）：在上述5個(gè)中方格中選擇處于頂角的4個(gè)小方格，計(jì)數(shù)，計(jì)算20個(gè)小方格中的總菌數(shù)，再乘以20，即得大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。7. 計(jì)算： 酵母細(xì)胞數(shù)/mL=大格中的細(xì)胞總數(shù)10000稀釋倍數(shù)8. 血球計(jì)數(shù)板的清洗： 將血球計(jì)數(shù)板立即用流水沖洗潔凈，若菌液變干，酵母細(xì)胞被固定在計(jì)數(shù)板上，則專門難

13、用流水沖洗潔凈，必須用優(yōu)質(zhì)脫脂棉濕潤(rùn)后輕輕擦洗，再用流水沖洗潔凈，涼干五、注意事項(xiàng)：1. 血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi)刻度特不精細(xì)，清洗時(shí)切勿用試管刷或其它粗糙物品擦拭。2. 加樣前，應(yīng)先放好蓋玻片，讓菌液自然吸入。假如先加菌液，則由于蓋玻片較輕，可能會(huì)浮在菌液上，如此，計(jì)數(shù)室內(nèi)的容積就不再使0.0001mL了。因此，為了使結(jié)果更加準(zhǔn)確，最好不要用一般的蓋玻片來(lái)替代。 3. 計(jì)數(shù)時(shí)，為幸免重復(fù)或遺漏，對(duì)壓在方格線上的細(xì)胞，應(yīng)遵循數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則（即凡壓在上部或左面線上的細(xì)胞，都應(yīng)計(jì)數(shù)入內(nèi)，凡壓在下部或右面線上的菌體，都應(yīng)忽略不計(jì)）。對(duì)出芽細(xì)胞，假如子細(xì)胞大于母細(xì)胞的一半，則應(yīng)算作兩個(gè)細(xì)胞。

14、六、考慮題： 計(jì)數(shù)時(shí)，發(fā)覺(jué)計(jì)數(shù)板不潔凈，如何樣快速地清洗計(jì)數(shù)板？實(shí)驗(yàn)三 啤酒酵母的質(zhì)量檢查一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)酵母菌種的質(zhì)量鑒定方法，二、實(shí)驗(yàn)原理：酵母的質(zhì)量直接關(guān)系到啤酒的好壞。酵母活力強(qiáng)，發(fā)酵就旺盛；若酵母被污染或發(fā)生變異，釀制的啤酒就會(huì)變味。因此，不論在酵母擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，依舊在發(fā)酵過(guò)程中，必須對(duì)酵母質(zhì)量進(jìn)行跟蹤調(diào)查，以防產(chǎn)生不正常的發(fā)酵現(xiàn)象，必要時(shí)對(duì)酵母進(jìn)行純種分離，對(duì)分離到的單菌落進(jìn)行發(fā)酵性能的檢查。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑：顯微鏡，恒溫水浴，溫箱，高壓蒸汽滅菌鍋，帶刻度的錐形離心管等025%美蘭（又稱次甲基蘭，Methylene blue）水溶液：0.025g美蘭溶于100mL水中；pH4

15、.5的醋酸緩沖液：0.51g硫酸鈣，0.68g硫酸鈉，0.405g冰醋酸溶于100mL水中；醋酸鉀（鈉）培養(yǎng)基：葡萄糖 0.06%，蛋白胨 0.25%， 醋酸鉀（鈉） 0.5%，瓊脂 2%， pH 7.0。四、實(shí)驗(yàn)步驟：顯微形態(tài)檢查載玻片上放一小滴蒸餾水，挑酵母培養(yǎng)物少許，蓋上蓋玻片，在高倍鏡下觀看。優(yōu)良健壯的酵母菌，應(yīng)形態(tài)整齊均勻，表面平滑，細(xì)胞質(zhì)透明均一。年幼健壯的酵母細(xì)胞內(nèi)部充滿細(xì)胞質(zhì)；老熟的細(xì)胞出現(xiàn)液泡，呈灰色，折光性較強(qiáng)；衰老的細(xì)胞中液泡多，顆粒性貯藏物多，折光性強(qiáng)。2. 死亡率檢查方法同上，可用水浸片法，也可用血球計(jì)數(shù)板法。酵母細(xì)胞用0.025%美蘭水溶液染色后，由于活細(xì)胞具有脫氫

16、酶活力，可將蘭色的美蘭還原成無(wú)色的美白，因此染不上顏色，而死細(xì)胞則被染上蘭色。一般新培養(yǎng)酵母的死亡率應(yīng)在1%以下，生產(chǎn)上使用的酵母死亡率在3%以下。3. 出芽率檢查 指出芽的酵母細(xì)胞占總酵母細(xì)胞數(shù)的比例。隨機(jī)選擇5個(gè)視野，觀看出芽酵母細(xì)胞所占的比例，取平均值。一般生長(zhǎng)健壯的酵母在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期出芽率可達(dá)60%以上。4. 凝集性試驗(yàn)對(duì)下面發(fā)酵來(lái)講，凝集性的好壞牽涉到發(fā)酵的成敗。若凝集性太強(qiáng)，酵母沉降過(guò)快，發(fā)酵度就太低；若凝集性太弱，發(fā)酵液中懸浮有過(guò)多的酵母菌，對(duì)后期的過(guò)濾會(huì)造成專門大的困難，啤酒中也可能會(huì)有酵母味，凝集性可通過(guò)本斯試驗(yàn)來(lái)確證：將1g酵母濕菌體與10mL pH4.5的醋酸緩沖液混合，

17、20平衡20分鐘，加至帶刻度的錐形離心管內(nèi)，連續(xù)20分鐘，每隔1分鐘記錄沉淀酵母的容量。實(shí)驗(yàn)后，檢查pH是否保持穩(wěn)定。一般規(guī)定10分鐘時(shí)的沉淀酵母量在1.0mL以上者為強(qiáng)凝集性，0.5mL以下者為弱凝集性。5. 死滅溫度檢測(cè)死滅溫度能夠作為酵母菌種鑒不的一個(gè)重要指標(biāo)，一般講來(lái)，培養(yǎng)酵母的死滅溫度在5253之間，而野生酵母或變異酵母的死滅溫度往往較高。溫度試驗(yàn)范圍一般為4856，溫度間隔為1或2，在已滅菌的麥汁試管中（內(nèi)裝5mL 12%麥汁）接入培養(yǎng)24小時(shí)的發(fā)酵液0.1mL，放于恒溫水浴內(nèi)，每一樣品做3個(gè)平行試驗(yàn)，并在另一同樣的試管中放入溫度計(jì)，待溫度計(jì)達(dá)到所需溫度時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，保持10分鐘后，

18、置冷水中冷卻，25培養(yǎng)57天，不能發(fā)酵的溫度即為死滅溫度。6子囊孢子的產(chǎn)生試驗(yàn) 子囊孢子的產(chǎn)生試驗(yàn)也是酵母菌種鑒不的一個(gè)重要指標(biāo)。一般講來(lái)，培養(yǎng)酵母不能形成子囊孢子，而野生酵母較易形成子囊孢子。 將酵母菌體接種于醋酸鉀培養(yǎng)基上，25培養(yǎng)48小時(shí)后，用顯微鏡檢查子囊孢子產(chǎn)生情況。7. 發(fā)酵性能測(cè)定酵母的發(fā)酵度反映酵母對(duì)各種糖類的發(fā)酵情況，有些酵母不能發(fā)酵麥芽三糖，發(fā)酵度就低，有些酵母甚至能發(fā)酵麥芽四糖或異麥芽糖，發(fā)酵度就高。將150mL麥汁盛放于250mL三角燒瓶中，滅菌，冷卻后加入泥狀酵母1g，置25溫箱中發(fā)酵34天，每隔8小時(shí)搖動(dòng)一次。發(fā)酵結(jié)束后，濾去酵母，蒸出乙醇，添加蒸餾水至原體積，測(cè)比

19、重（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十）。（1）外觀發(fā)酵度（P - m）/P 100式中 P發(fā)酵前麥芽汁濃度m發(fā)酵液外觀濃度（不排除乙醇） （2）實(shí)際發(fā)酵度（P - n）/P 100， n發(fā)酵液的實(shí)際濃度（排除乙醇后） 一般外觀發(fā)酵度應(yīng)為6680%，真正發(fā)酵度為5570%講明：啤酒酵母要緊有兩類：(1)上面發(fā)酵啤酒酵母：進(jìn)行上面發(fā)酵，發(fā)酵溫度相對(duì)較高（1520），發(fā)酵結(jié)束后，大部分酵母浮在液面。例如英國(guó)聞名的淡色愛(ài)爾啤酒(A1e)，司陶特(Stout)黑啤酒等。 (2)下面發(fā)酵啤酒酵母：進(jìn)行下面發(fā)酵，發(fā)酵溫度在10左右，發(fā)酵結(jié)束后，大部分酵母沉于容器底部。例如捷克的比爾森(Pilsen)啤酒，德國(guó)的幕尼黑啤酒和多特蒙德

20、啤酒，丹麥的嘉士伯啤酒等，我國(guó)的啤酒多屬于此類型。實(shí)驗(yàn)四 啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)酵母菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，為實(shí)驗(yàn)室啤酒發(fā)酵預(yù)備菌種。二、實(shí)驗(yàn)原理：在進(jìn)行啤酒發(fā)酵之前，必須預(yù)備好足夠量的發(fā)酵菌種。在啤酒發(fā)酵中，接種量一般應(yīng)為麥芽汁量的10%（使發(fā)酵液中的酵母量達(dá)1107個(gè)酵母/mL），因此，要進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵，首先必須進(jìn)行酵母菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)。擴(kuò)大培養(yǎng)的目的一方面是獲得足量的酵母，另一方面是使酵母由最適生長(zhǎng)溫度（28）逐步適應(yīng)為發(fā)酵溫度（10）。三、實(shí)驗(yàn)器材：恒溫培養(yǎng)箱，生化培養(yǎng)箱，顯微鏡等。四、實(shí)驗(yàn)步驟：本次實(shí)驗(yàn)擬用60升麥芽汁，因此應(yīng)制備6000 mL含1108個(gè)酵母/mL的菌種，

21、以每班10個(gè)組計(jì)算，每個(gè)組應(yīng)制備約600 mL菌種。建議流程如下： 28，2天 菌種擴(kuò)大: 麥汁斜面菌種麥汁平板鏡檢，挑單菌落3個(gè)，接種 50mL麥汁試管（或三角瓶）20，2天550mL麥汁三角瓶15，2天計(jì)數(shù)備用。 每天搖動(dòng)3次 每天搖動(dòng)3次1 培養(yǎng)基的制備取協(xié)定法制備的麥芽汁濾液（約400 mL），加水定容至約600 mL，取50 mL裝入250 mL三角瓶中，另550 mL至1000 mL三角瓶中，包上瓶口布后，0.05 Mpa滅菌30分鐘。2 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)按上面流程進(jìn)行菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（斜面活化菌種由教師提供）。注意無(wú)菌操作。五、注意事項(xiàng)：滅菌后的培養(yǎng)基會(huì)有許多沉淀，這不阻礙酵母菌的生殖

22、。若要減少沉淀，可在滅菌前將培養(yǎng)基充分煮沸并過(guò)濾。六、考慮題：菌種擴(kuò)大過(guò)程中什么緣故要慢慢擴(kuò)大，培養(yǎng)溫度什么緣故要逐級(jí)下降。實(shí)驗(yàn)五 小型啤酒釀造設(shè)備介紹及發(fā)酵罐的空消一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?熟悉啤酒釀造工藝流程，對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行空消，為發(fā)酵作好預(yù)備。二、實(shí)驗(yàn)原理：啤酒釀造包括麥芽粉碎、麥汁糖化、麥醪過(guò)濾、麥汁煮沸、麥汁冷卻及啤酒發(fā)酵等幾個(gè)過(guò)程。啤酒發(fā)酵是純種發(fā)酵，必須先對(duì)空的發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌處理。三、實(shí)驗(yàn)器材：粉碎機(jī)、糖化煮沸鍋、過(guò)濾沉淀槽、發(fā)酵罐、制冷機(jī)、板式換熱器等四、工藝流程簡(jiǎn)介：啤酒發(fā)酵的工藝流程見(jiàn)圖3-2-7糖化煮沸鍋，過(guò)濾槽、發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)3-2-8五、實(shí)驗(yàn)步驟：1. 熟悉各項(xiàng)設(shè)備；清洗各項(xiàng)設(shè)

23、備；在回旋沉淀槽、板式換熱器、發(fā)酵罐中通入蒸汽，消毒30分鐘。待各項(xiàng)設(shè)備使用結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行清洗滅菌。實(shí)驗(yàn)六 麥芽汁的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?熟悉麥芽汁的制備流程，為啤酒發(fā)酵預(yù)備原料。二、實(shí)驗(yàn)原理：麥汁制備包括原料糖化、麥醪過(guò)濾和麥汁煮沸等幾個(gè)過(guò)程。由于麥芽的價(jià)格相對(duì)較高，再加上發(fā)酵過(guò)程中需要較多的糖，因此目前大多數(shù)工廠都用大米做輔料。三、實(shí)驗(yàn)器材：在糖化車間一般有四種設(shè)備：糊化鍋、糖化鍋、麥汁過(guò)濾槽和麥汁煮沸鍋，本實(shí)驗(yàn)由于受條件限制，只能采納單式設(shè)備，立即糊化鍋、糖化鍋和麥汁煮沸鍋合而為一。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1. 糖化用水量的計(jì)算糖化用水量一般按下式計(jì)算： W=A（100B）/B式中B為過(guò)濾開(kāi)始時(shí)

24、的麥汁濃度（第一麥汁濃度） A為100Kg原料中含有的可溶性物質(zhì)（浸出物重量百分比） W為100Kg原料（麥芽粉）所需的糖化用水量（升）。例：我們要制備60升10度的麥芽汁，假如麥芽的浸出物為75%，請(qǐng)問(wèn)需要加入多少麥芽粉？因?yàn)閃=75（10010）/10=675升即100Kg原料需675升水，則要制備60升麥芽汁，大約需要添加10Kg的麥芽和60升左右的水（不計(jì)麥芽溶出后增加的體積）。2. 糖化糖化是利用麥芽中所含的酶，將麥芽和輔助原料中的不溶性高分子物質(zhì)，逐步分解為可溶性低分子物質(zhì)的過(guò)程。制成的浸出物溶液確實(shí)是麥芽汁。傳統(tǒng)的糖化方法要緊有兩大類，（1）煮出糖化法：利用酶的生化作用及熱的物理

25、作用進(jìn)行糖化的一種方法。（2）浸出糖化法：純粹利用酶的生化作用進(jìn)行糖化的方法。本實(shí)驗(yàn)采納浸出糖化法。推舉使用如下流程： 3537，保溫30分鐘-5052 60分鐘-65 30分鐘（至碘液反應(yīng)差不多完全）-7678 送入過(guò)濾槽。3. 麥汁過(guò)濾將糖化醪中的浸出物與不溶性麥糟分開(kāi)，以得到澄清麥汁的過(guò)程。由于過(guò)濾槽底部是篩板，要借助麥糟形成的過(guò)濾層來(lái)達(dá)到過(guò)濾的目的，因此前30分鐘的濾出物應(yīng)返回重濾。頭號(hào)麥汁濾完后，應(yīng)用適量熱水洗糟，得到洗滌麥汁。4. 麥汁煮沸將過(guò)濾后的麥汁加熱煮沸以穩(wěn)定麥汁成分的過(guò)程。此過(guò)程中可加入酒花（一種含苦味和香味的蛇麻之花，每100升麥汁中添加約200克）。煮沸的具體目的要緊

26、有：破壞酶的活性；使蛋白質(zhì)沉淀；濃縮麥汁；浸出酒花成分；降低pH；蒸出惡味成分；殺死雜菌；形成一些還原物質(zhì)。添加酒花的目的要緊有：給予啤酒特有的香味和爽快的苦味；增加啤酒的防腐能力；提高啤酒的非生物穩(wěn)定性。將過(guò)濾的麥汁通蒸汽加熱至沸騰，煮沸時(shí)刻一般操縱在1.52小時(shí)，蒸發(fā)量達(dá)1520%（蒸發(fā)時(shí)盡量開(kāi)口，煮沸結(jié)束時(shí)，為了防止空氣中的雜菌進(jìn)入，最好密閉）?；匦恋砑胞溨A(yù)冷卻：將煮沸后的麥汁從切線方向泵入回旋沉淀槽，使麥汁沿槽壁回旋而下，借以增大蒸發(fā)表面積，使麥汁快速冷卻，同時(shí)由于離心力的作用，使麥汁中的絮凝物快速沉淀的過(guò)程。麥汁冷卻將回旋沉淀后的預(yù)冷卻麥汁通過(guò)薄板冷卻器與冰水進(jìn)行熱交換，從而使麥

27、汁冷卻到發(fā)酵溫度的過(guò)程。7.設(shè)備清洗由于麥芽汁營(yíng)養(yǎng)豐富，各項(xiàng)設(shè)備及管閥件（包括糖化煮沸鍋、過(guò)濾槽、回旋沉淀槽及板式換熱器）使用完畢后，應(yīng)及時(shí)用洗滌液和清水清洗，并蒸汽殺菌。五、注意事項(xiàng)：1. 若加熱、煮沸過(guò)程中將蒸汽直接通入麥汁中，則由于蒸汽的冷凝。麥汁量會(huì)增加，因此最好用夾套加熱的方法。2. 麥汁煮沸后的各步操作應(yīng)盡可能無(wú)菌，特不是各管道及薄板冷卻器應(yīng)先進(jìn)行殺菌處理。六、考慮題：麥芽粉碎程度會(huì)對(duì)過(guò)濾產(chǎn)生如何樣的阻礙？實(shí)驗(yàn)七 糖度的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?學(xué)習(xí)用糖錘度計(jì)測(cè)定糖度的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：麥汁的好壞，將直接關(guān)系到啤酒的質(zhì)量。工業(yè)上一般依照啤酒品種的不同來(lái)制造不同類型的麥芽汁，因此及時(shí)分析

28、麥芽汁的質(zhì)量，調(diào)整麥芽汁制造工藝顯得尤為重要。麥汁的要緊分析項(xiàng)目有：麥汁濃度、總還原糖含量、氨基氮含量、酸度、色度、苦味質(zhì)含量等。一般分析項(xiàng)目應(yīng)在麥汁冷卻30分鐘后取樣。樣品冷卻后，以濾紙過(guò)濾，濾液放于滅菌的三角瓶中，低溫保藏。全部分析應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)完成。為了調(diào)整啤酒釀制時(shí)的原麥汁濃度，操縱發(fā)酵的進(jìn)程，常常在麥汁過(guò)濾后、發(fā)酵過(guò)程中用簡(jiǎn)易的糖錘度計(jì)法測(cè)定麥汁的濃度。現(xiàn)對(duì)糖錘度計(jì)這一簡(jiǎn)單的玻璃儀器作一介紹。糖錘度計(jì)即糖度表，又稱勃力克斯比重計(jì)。這種比重計(jì)是用純蔗糖溶液的重量百分?jǐn)?shù)來(lái)表示比值，它的刻度稱為勃力克斯刻度（Brixsale,簡(jiǎn)寫B(tài)X）即糖度，規(guī)定在20使用，BX與比重的關(guān)系舉例如下（20

29、）：比 重 BX1.00250 0.6411.01745 4.4391.03985 9.956它們之間有公式可換算，同一溶液若測(cè)定溫度小于20，則因溶液收縮，比重比20時(shí)要高。若液溫高于20則情況相反。不在20液溫時(shí)測(cè)得的數(shù)值可從附表中查得20時(shí)的糖度。我們講某溶液是多少Brix值，或多少糖度，應(yīng)是指20的數(shù)值。若是在20以外用糖度表得數(shù)值，應(yīng)加溫度講明（顯然，如測(cè)純蔗糖溶液，只有在20液溫測(cè)得的數(shù)值是真正表示了含蔗糖的重量百分?jǐn)?shù)）。Plato是一種與BX相同的表示比重的刻度，也以在20時(shí)純蔗糖溶液的重量百分?jǐn)?shù)表示。專門明確，如3.9 plato確實(shí)是指20時(shí)的數(shù)值，沒(méi)有(例如)13時(shí)多少pl

30、ato的模糊叫法，因?yàn)橹挥胁怂贡戎赜?jì)，沒(méi)有plato比重計(jì)，因此不存在各種溫度用plato比重計(jì)去測(cè)定的情況，因此它純粹是一種刻度，一種標(biāo)準(zhǔn)而已。麥汁濃度常用BX表示，有時(shí)也用plato表示。換算舉例：在11液溫用糖表讀得啤酒主發(fā)酵液為4.2糖度，問(wèn)20的糖度為多BX？多少 plato？查表：觀測(cè)糖錘度溫度校正表，11時(shí)的4.2糖度應(yīng)減去0.34得3.86，即20時(shí)為3.86BX，亦即3.86plato。巴林比重計(jì)：含義與勃力克斯比重計(jì)相同，但規(guī)定在17.5使用，而不是在20使用。糖度表本身作為產(chǎn)品同意出廠誤差為0.2BX，放在啤酒發(fā)酵液中指示時(shí)，由于CO2上升的沖力使表上升，而讀數(shù)偏高，

31、故剛從發(fā)酵容器取出的樣品須過(guò)半分鐘待CO2逸走后再讀數(shù)，糖度表一直放在發(fā)酵液中作長(zhǎng)期觀測(cè)時(shí)，不讀數(shù)時(shí)應(yīng)設(shè)法使其全部沒(méi)入發(fā)酵液中，否則浮在液面的泡蓋物質(zhì)會(huì)干結(jié)在表上，造成明顯的讀數(shù)偏差。三、實(shí)驗(yàn)器材：糖錘度計(jì)四、實(shí)驗(yàn)步驟：取100mL麥汁或除氣啤酒，放于100mL量筒中，放入糖錘度計(jì)，待穩(wěn)定后，從糖錘度計(jì)與麥汁液面的交界處讀出糖度，同時(shí)測(cè)定麥汁溫度，依照校準(zhǔn)值，計(jì)算20時(shí)的麥汁糖度。若糖度較低，糖度計(jì)不能浮起來(lái)，可多加一些麥汁，直至糖度計(jì)浮在液體中。表3-2-6 糖錘度與溫度校正表（部分）溫度1 Bx2 Bx3 Bx4 Bx5 Bx6 Bx7 Bx8 Bx9 Bx10 Bx11 Bx12 Bx1

32、50.200.200.20.210.220.220.230.230.240.240.240.25160.170.170.180.180.180.180.190.190.200.200.200.21170.130.130.140.140.140.140.140.150.150.150.150.16180.090.090.100.100.100.100.100.100.100.100.100.10190.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05 - - - - - - - - - - - -20000000000000 +210.040.050.

33、050.050.050.050.050.060.060.060.060.06220.100.100.100.100.100.100.100.110.110.110.110.11230.160.160.160.160.160.160.160.170.170.170.170.17240.210.210.220.220.220.220.220.230.230.230.230.23250.270.270.280.280.280.280.290.290.300.300.300.30260.330.330.340.340.340.340.350.350.360.360.360.36270.400.400.

34、410.410.410.410.410.420.420.420.420.43280.460.460.470.470.470.470.480.480.490.490.490.50290.540.540.550.550.550.550.550.560.560.560.570.57300.610.610.620.620.620.620.620.630.630.630.640.64310.690.690.700.700.700.700.700.710.710.710.720.72320.760.770.770.780.780.780.780.790.790.790.800.80五、注意事項(xiàng)：糖錘度計(jì)易

35、碎，使用時(shí)要格外小心六、考慮題：試比較勃力克斯與plato的異同。實(shí)驗(yàn)八 啤酒主發(fā)酵一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)啤酒主發(fā)酵的過(guò)程，掌握酵母發(fā)酵規(guī)律。二、實(shí)驗(yàn)原理：啤酒主發(fā)酵是靜止培養(yǎng)的典型代表。是將酵母接種至盛有麥芽汁的容器中，在一定溫度下培養(yǎng)的過(guò)程。由于酵母菌是一種兼性厭氧微生物，先利用麥芽汁中的溶解氧進(jìn)行好氧生長(zhǎng)，然后利用EMP途徑進(jìn)行厭氧發(fā)酵生成酒精。顯然，同樣體積的液體培養(yǎng)基用粗而短的容器盛放比細(xì)而長(zhǎng)的容器氧更容易進(jìn)入液體，因而前者降糖較快（因此測(cè)試啤酒生產(chǎn)用酵母菌株的性能時(shí)，所用液體培養(yǎng)基至少要1.5米深，才接近生產(chǎn)實(shí)際）。定期搖動(dòng)容器，既能增加溶氧，也能改善液體各成份的流淌，最終加快菌體的生

36、長(zhǎng)過(guò)程。這種有酒精產(chǎn)生的靜止培養(yǎng)比較容易進(jìn)行，因?yàn)楫a(chǎn)生的酒精有抑制雜菌生長(zhǎng)的能力，容許一定程度的粗放操作。由于培養(yǎng)基中糖的消耗，CO2與酒精的產(chǎn)生，比重不斷下降，可用糖度表監(jiān)視。若需分析其他指標(biāo)，應(yīng)從取樣口取樣測(cè)定。三、實(shí)驗(yàn)器材：帶冷卻裝置的發(fā)酵罐（50L，100L），若無(wú)發(fā)酵裝置，可將玻璃缸放于生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行微型靜止發(fā)酵。四、實(shí)驗(yàn)步驟：將糖化后冷卻至10左右的麥芽汁送入發(fā)酵罐，接入酵母菌種（實(shí)驗(yàn)四，共約5升），然后充氧，以利酵母菌生長(zhǎng)，同時(shí)使酵母在麥汁中分散均勻（充氧，即通入無(wú)菌空氣，也可在麥汁冷卻后進(jìn)行，一般溫度越低，氧在麥汁中的溶解度越大），待麥汁中的溶解氧飽和后，讓酵母進(jìn)入生殖期，約

37、20小時(shí)后，溶解氧被消耗，逐漸進(jìn)入主發(fā)酵。由于發(fā)酵罐密閉，專門難看清發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程，建議一個(gè)組在1000 mL玻璃缸中進(jìn)行啤酒主發(fā)酵小型試驗(yàn)。具體方法如下：洗標(biāo)本缸，缸口用8層紗布包扎后，進(jìn)行高壓滅菌；將協(xié)定法糖化得到的麥汁，加水至600 mL，再加葡萄糖使糖度達(dá)到10 Bx，滅菌，冷卻后搖動(dòng)充氧，沉淀，將上清液以無(wú)菌操作方式到入已滅菌的標(biāo)本缸中。將50mL酵母菌種接入，在10生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每天觀看發(fā)酵情況。主發(fā)酵： 10，7天至4.0 plato時(shí)結(jié)束（嫩啤酒）。一般主發(fā)酵整個(gè)過(guò)程分為酵母生殖期，起泡期、高泡期、落泡期和泡蓋形成期等五個(gè)時(shí)期。認(rèn)真觀看各時(shí)期的區(qū)不。主發(fā)酵測(cè)定項(xiàng)目 接種后取

38、樣作第一次測(cè)定，以后每過(guò)12或24h測(cè)1次直至結(jié)束。全部數(shù)據(jù)疊畫(huà)在1張方格紙上，縱坐標(biāo)為7個(gè)指標(biāo)，橫坐標(biāo)為時(shí)刻。共測(cè)定下列幾個(gè)項(xiàng)目：a、糖度（用糖度表測(cè)，并換算成plato）；b、細(xì)胞濃度、出芽率、染色率；c、酸度d、-氨基氮e、還原糖f、酒精度 g、pHh、色度I、浸出物濃度J、雙乙酰含量6、作業(yè)要求 . 畫(huà)動(dòng)身酵周期中上述10個(gè)指標(biāo)的曲線圖，并解釋它們的變化。 . 記下操作體會(huì)與注意點(diǎn)附：發(fā)酵液的取樣方法 若在發(fā)酵罐中發(fā)酵，可從取樣開(kāi)關(guān)處直接取樣（先棄去少量發(fā)酵液）。若無(wú)取樣開(kāi)關(guān)，可用一滅過(guò)菌的乳膠管，深入發(fā)酵池面下20cm處，用虹吸法使發(fā)酵液流出，棄去少量先流出的發(fā)酵液，然后用一清潔干燥

39、的三角瓶接取發(fā)酵液作樣品。五、注意事項(xiàng)：除少數(shù)專門的測(cè)定項(xiàng)目外，應(yīng)將發(fā)酵液在兩潔凈的大燒杯中來(lái)回傾到50次以上，以除去CO2，再通過(guò)濾后，濾液用于分析。分析工作應(yīng)盡快完成。實(shí)驗(yàn)九 總還原糖含量的測(cè)定（斐林試劑法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)用斐林試劑測(cè)還原糖的方法，二、實(shí)驗(yàn)原理：斐林試劑由甲、乙液組成，甲液為硫酸銅溶液，乙液為氫氧化鈉與酒石酸鉀鈉溶液。平常甲、乙溶液分開(kāi)貯存，測(cè)定時(shí)才等體積混合，混合后，硫酸銅與氫氧化鈉反應(yīng)，生成氫氧化銅沉淀： 2Na0H十CuS04 Cu（OH）2十Na2SO4氫氧化銅因能與酒石酸鉀鈉反應(yīng)形成絡(luò)合物而使沉淀溶解。酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物中的二價(jià)銅是一個(gè)氧化劑，在氧化醛糖和酮糖

40、（合稱總還原糖）的同時(shí)，自身被還原成一價(jià)的紅色氧化亞銅沉淀：反應(yīng)終點(diǎn)用美藍(lán)（亞甲基藍(lán)）來(lái)指示。由于美藍(lán)的氧化能力較二價(jià)銅弱，故待二價(jià)銅全部被還原糖還原后，過(guò)量一滴還原糖立即使美藍(lán)還原成無(wú)色的美白。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑： 電爐，滴定管等(1)斐林溶液甲液：稱取3.4939g結(jié)晶硫酸銅(CuS045H20)，溶于50mL水中，如有不溶物須過(guò)濾。乙液：稱取13.7g酒石酸鉀鈉，5g NaOH，溶于50mL水中，若有沉淀過(guò)濾即可。 (2)0.2標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液： 精確稱取于105烘至恒重的分析純葡萄糖0.5000g，用水溶解后，加2.5mL濃鹽酸，定容成至250mL。(3) 1美藍(lán)指示劑： 0.5g美藍(lán)溶于

41、50mL蒸餾水中。 四、實(shí)驗(yàn)步驟1.斐林溶液的標(biāo)定由于試劑的純度不同，配制時(shí)稱量、定容等有誤差，各人所配的斐林試劑氧化能力會(huì)有差異，因此有必要對(duì)斐林溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。配制準(zhǔn)確時(shí)，斐林甲、乙液各5mL可氧化25mL 0.2標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。 預(yù)滴定：準(zhǔn)確吸取斐林甲、乙液各5mL，放入250mL錐形瓶中，加水約20mL，并從滴定管加入約24mL 0.2標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（假如斐林甲、乙液配制特不精確，從理論上講，應(yīng)消耗25mL 0.2標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，故先加24mL），將錐形瓶置電爐上加熱煮沸，維持沸騰2分鐘，加入1美藍(lán)指示劑2滴，在沸騰狀態(tài)下，以每?jī)擅?滴的速度滴入0.2標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，至溶液剛由藍(lán)色變?yōu)轷r

42、紅色為止。后滴定操作應(yīng)在1分鐘內(nèi)完成，整個(gè)煮沸時(shí)刻應(yīng)操縱在3分鐘之內(nèi)。記下總耗糖量V。正式滴定：與預(yù)滴定差不多相同，只是用（V-1）mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖代替24mL葡萄糖液，最后在1分鐘內(nèi)滴定完成。2.試樣的滴定 稀釋：將樣品除氣后，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以期用1550mL（最好2030mL）稀釋液使滴定完成。一般麥汁稀釋50倍左右，啤酒主酵液稀釋20倍左右。滴定：差不多同上，也分預(yù)滴定和正式滴定。只只是用樣品稀釋液代替標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，由于預(yù)滴定時(shí)不明白需要多少毫升稀釋液，因此誤差較大。正式滴定時(shí)先加入比預(yù)滴定少1mL的稀釋液。正式滴定至少進(jìn)行2次。計(jì)算總還原糖量，以100 mL樣品中含有的葡萄糖克數(shù)來(lái)表示五

43、、注意事項(xiàng)：指示劑美藍(lán)本身具有弱氧化性，要消耗還原糖因此每次用量應(yīng)保持一致。次甲基藍(lán)被還原為無(wú)色后，易被空氣氧化又顯藍(lán)色，因此滴定過(guò)程應(yīng)保持沸騰狀態(tài)，使瓶?jī)?nèi)不斷冒出水蒸汽，以防空氣進(jìn)入。反應(yīng)過(guò)程中不能搖動(dòng)錐形瓶，沸騰已可使溶液混勻。測(cè)定時(shí)須嚴(yán)格操縱反應(yīng)液體積，以保持一致的酸堿度。因此要操縱電爐火力及滴定速度。六、考慮題：什么緣故要進(jìn)行預(yù)滴定？實(shí)驗(yàn)十 氨基氮含量的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)氨基氮含量的測(cè)定方法，操縱麥汁或啤酒質(zhì)量。二、實(shí)驗(yàn)原理：氨基氮為氨基酸分子上的氨基氮。水合茚三酮是一種氧化劑，可使氨基酸脫羧氧化，而本身被還原成還原型水合茚三酮。還原型水合茚三酮再與末還原的水合茚三酮及氨反應(yīng)，生成

44、藍(lán)紫色縮合物，顏色深淺與游離氨基氮含量成正比，可在570nm下比色測(cè)定。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑：分光光度計(jì)，電爐等 (1)顯色劑 稱取10g Na2HPO412H2O ，6g KH2PO4 ，0.5g水合茚三酮，0.3g果糖，用水溶解并定容至100mL（pH 6.66.8），棕色瓶低溫保存，可用兩周。 (2)碘酸鉀稀釋液 溶0.2g碘酸鉀于60mL水中，加40mL 95乙醇。 (3)標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸貯備溶液 準(zhǔn)確稱取0.1072g甘氨酸，用水溶解并定容至100 mL，0保存。用時(shí)100倍稀釋。四、實(shí)驗(yàn)步驟 (1)樣品稀釋 適當(dāng)稀釋樣品至含13g氨基氮/mL（麥汁一般稀釋100倍，啤酒50倍，啤酒應(yīng)先除氣

45、）。(2)測(cè)定 取9支10mL比色管，其中3支吸入2mL甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，另3支各吸入2mL試樣稀釋液，剩下3支吸入2mL蒸餾水。然后各加顯色劑1 mL，蓋玻塞，搖勻，在沸水浴中加熱l 6分鐘。取出，在20冷水中冷卻20分鐘，分不加5mL碘酸鉀稀釋液，搖勻。在30分鐘內(nèi)，以水樣管為空白，在570nm波長(zhǎng)下測(cè)各管的光密度。計(jì)算：氨基氮含量（g/mL）=（樣品管平均O.D./標(biāo)準(zhǔn)管平均O.D.）2稀釋倍數(shù)講明：式中(樣品管平均O.D./標(biāo)準(zhǔn)管平均O.D.）：表示樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管之間的氨基氮之比；2：標(biāo)準(zhǔn)管的氨基氮濃度（g/mL），即（0.107214/75）100； 五、注意事項(xiàng)： (1)必須嚴(yán)防任何

46、外界痕量氨基酸的引入，所用比色管必須認(rèn)真洗滌，洗凈后的手只能接觸管壁外部，移液管不可用嘴吸。 (2)測(cè)定時(shí)加入果糖作為還原性發(fā)色劑，碘酸鉀稀釋液的作用是使茚三酮保持氧化態(tài)，以阻止進(jìn)一步發(fā)生不希望的生色反應(yīng)。(3)深色麥汁或深色啤酒應(yīng)對(duì)吸光度作校正：取2mL樣品稀釋液，加1mL蒸餾水和5mL碘酸鉀稀釋液在570n m波長(zhǎng)下以空白做對(duì)比測(cè)吸光度，將此值從測(cè)定樣品吸光度中減去。考慮題：啤酒色澤是否會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生阻礙？附：分光光度計(jì)的使用：現(xiàn)以SP-2000UV紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)為例介紹使用方法。接通電源，預(yù)熱20分鐘，使儀器進(jìn)入熱穩(wěn)定狀態(tài)，儀器開(kāi)始自檢；自檢結(jié)束后，儀器自動(dòng)停留在546nm處，并自動(dòng)調(diào)

47、100%T和0%T，當(dāng)儀器顯示“546”“100%T”，即進(jìn)入測(cè)試狀態(tài)；按方式鍵（MODE），將測(cè)試方式設(shè)定為吸光度方式，儀器顯示“XXXnm，X.XXXAbs”按波長(zhǎng)設(shè)置鍵至所需要波長(zhǎng)，如570nm；將參比溶液和被測(cè)溶液分不倒入比色杯中，插入比色槽中，蓋上樣品室蓋；將參比溶液推入光路中，按“100%T”鍵調(diào)整 “0Abs”；將被測(cè)溶液推入光路中，讀取顯示器上的吸光度值；搞好清潔衛(wèi)生工作。注意：比色杯貴重，應(yīng)格外小心。實(shí)驗(yàn)十一 酸度和pH的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆账岫群蚿H的測(cè)定方法，監(jiān)測(cè)啤酒發(fā)酵的進(jìn)程。二、實(shí)驗(yàn)原理：總酸是指樣品中能與強(qiáng)堿（NaOH）作用的所有物質(zhì)的總量，用中和每升樣品（滴定至

48、pH 9.0）所消耗的1N NaOH的毫升數(shù)來(lái)表示,但在啤酒發(fā)酵液的測(cè)定過(guò)程中常用中和100mL除氣發(fā)酵液所需的1N NaOH的毫升數(shù)來(lái)表示。啤酒中含有各種酸類約100種以上，生產(chǎn)原料、糖化方法、發(fā)酵條件、酵母菌種都會(huì)阻礙啤酒中的酸含量。其中包括揮發(fā)性的（甲酸、乙酸），低揮發(fā)性的（C3、C4 、異C4、異C5、C6、C8、C10 等脂肪酸）和不揮發(fā)性的（乳酸，檸檬酸，琥珀酸，蘋果酸以及氨基酸，核酸，酚酸等）各種酸類。適宜的pH和適量的可滴定總酸，能賦于啤酒以柔和清爽的口感；同時(shí)這些酸及其鹽類也是酒中重要的緩沖物質(zhì)，有利于各種酶的作用。由于樣品有多種弱酸和弱酸鹽，有較大的緩沖能力，滴定終點(diǎn)pH變

49、化不明顯，再加上樣品有色澤，用酚酞做指示劑效果不是太好，最好采納電位滴定法。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑：自動(dòng)電位滴定儀，或一般堿式滴定管，pH計(jì)。（1） 0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液（精確至0.0001 mol/L）（2）0.05酚酞指示劑：0.05g酚酞溶于50%的中性酒精（一般酒精常含有微量的酸，可用0.1mol/L NaOH溶液滴定至微紅色即為中性酒精）中，定容至100mL。四、實(shí)驗(yàn)步驟1酸度測(cè)定取50mL除氣發(fā)酵液，置于燒杯中，加入磁力攪拌棒，放于自動(dòng)電位滴定儀上，插入pH探頭，逐滴滴入0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至pH 9.0，記下耗去的NaOH毫升數(shù)。若無(wú)自動(dòng)電位滴

50、定儀，可用下述酸堿滴定方法。取5mL除氣發(fā)酵液，置于250mL三角瓶中，加50mL蒸餾水，再加1滴酚汰指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色(不可過(guò)量)經(jīng)搖動(dòng)后不消逝為止，記下消耗的氫氧化鈉溶液的體積VmL， 計(jì)算總酸(1 mol/L NaOH 毫升數(shù)100mL樣品)= 20MV式中 M為 NaOH的實(shí)際摩爾濃度，V為消耗的氫氧化鈉溶液的體積2pH測(cè)定現(xiàn)以PHS-3C型周密pH計(jì)為例來(lái)講明pH的測(cè)定方法。PHS-3C型pH計(jì)是一種周密數(shù)字顯示pH計(jì)，它采納3位半十進(jìn)制LED數(shù)字顯示。在使用前應(yīng)在蒸餾水中浸泡24小時(shí)。接通電源后，先預(yù)熱30分鐘，然后進(jìn)行標(biāo)定。一般講來(lái)，儀器在連續(xù)

51、使用時(shí)，每天要標(biāo)定一次。選擇開(kāi)關(guān)旋至pH檔；（2）調(diào)節(jié)溫度補(bǔ)償至室溫；（3）把斜率調(diào)節(jié)旋紐順時(shí)針旋到底（即調(diào)到100%位置）（4）將洗凈擦干的電極插入pH6.86的緩沖液中，調(diào)節(jié)定位旋紐至6.86；（5）用蒸餾水清洗電極，擦干，再插入pH4.00的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，調(diào)節(jié)斜率至pH4.00；（6）重復(fù)（4），（5），直至不用再調(diào)節(jié)定位和斜率兩旋紐為止。（7）清洗電極，擦干，將電極插入發(fā)酵液中，搖動(dòng)燒杯，使均勻接觸，在顯示屏中讀出被測(cè)溶液的pH值。（8）關(guān)閉電源，清洗電極，并將電極愛(ài)護(hù)套套上，套內(nèi)應(yīng)放少量補(bǔ)充液以保持電極球泡的濕潤(rùn)，切忌浸泡于蒸餾水中。五、注意事項(xiàng)發(fā)酵液中的二氧化碳必須完全去除。0.1

52、mol/L NaOH必須通過(guò)標(biāo)定，保留4位有效數(shù)。六、考慮題：酸堿滴定時(shí)什么緣故要用水稀釋？水的酸堿度對(duì)滴定結(jié)果有什么阻礙？實(shí)驗(yàn)十二 比重的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私獗戎氐臏y(cè)定方法，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中浸出物濃度的變化。二、實(shí)驗(yàn)原理：在一定溫度下，各種物質(zhì)都有一定的比重。當(dāng)物質(zhì)純度改變時(shí)，比重也隨著改變，故測(cè)定比重可檢驗(yàn)物質(zhì)的純度或溶液的濃度。如在啤酒發(fā)酵中，隨著糖分的消耗、酒精和CO2的產(chǎn)生，比重會(huì)逐漸下降，因此可通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液的比重來(lái)了解發(fā)酵過(guò)程。 溶解于水中的固體物質(zhì)稱為固形物，以重量百分濃度表示。在啤酒發(fā)酵液中，固形物的含量常以蔗糖的重量百分比來(lái)表示。然而發(fā)酵液固形物還包括許多非糖成分，這些非糖

53、成分對(duì)溶液比重的阻礙與蔗糖不一樣，但為了方便起見(jiàn)，可假定非糖物質(zhì)對(duì)溶液比重的阻礙程度和蔗糖相等。因此，依照比重查知的固形物含量實(shí)際上只是一個(gè)近似值。麥汁和啤酒發(fā)酵液樣品20的比重規(guī)定為：在空氣中，20樣品與同體積20水的重量之比值。三、實(shí)驗(yàn)儀器：測(cè)定比重常用的是比重瓶和比重計(jì)。比重計(jì)方便，但精確度低（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)四），比重瓶精確，但測(cè)定專門費(fèi)時(shí)。比重瓶有多種的形狀，常用的規(guī)格為25mL，比較好的一種是帶有特制溫度計(jì)并具有磨口帽小支管的比重瓶（見(jiàn)圖）。比重以相同溫度下，同體積的溶液和純水之間的重量比來(lái)表示。 比重瓶示意圖四、實(shí)驗(yàn)步驟： (1)空瓶稱重：將比重瓶洗潔凈后，吹干或低溫烘干（可用少量酒精或乙

54、醚洗滌），冷卻至室溫，精確稱重至0.1mg。 (2)稱水重：將煮沸30分鐘并冷卻至1518的蒸餾水裝滿比重瓶 (注意瓶?jī)?nèi)不要有氣飽)。裝上溫度計(jì)。立即浸入200.1的恒溫水浴中，讓瓶?jī)?nèi)溫度計(jì)在20下保持20分鐘，取出比重瓶用濾紙吸去溢出支管外的水，立即蓋上小帽，室溫下平衡溫度后，擦干瓶壁上的水，精確稱重。 （3）樣品稱重：倒出蒸餾水，用少量除氣樣品洗滌后，加入冷卻至1519的樣品，按（2）測(cè)得樣品重量。（4）比重計(jì)算： 比重瓶和樣品重 空瓶重 樣品比重 = 比重瓶和蒸餾水重 空瓶重 （5）查表：查閱比重-浸出物對(duì)比表。 啤酒外觀濃度和實(shí)際濃度的測(cè)定成品啤酒或發(fā)酵液中所含的浸出物的重量百分?jǐn)?shù)稱為

55、濃度。由于啤酒和發(fā)酵液中有部分酒精，酒精比水輕，故采納比重法測(cè)得的濃度，要稍低于實(shí)際濃度，適應(yīng)上稱為外觀濃度。將酒精分和CO2除去后測(cè)得的濃度稱為實(shí)際濃度。因此實(shí)際濃度較為準(zhǔn)確，并能夠此來(lái)計(jì)算原麥芽汁濃度。（1） 外觀濃度的測(cè)定：同上。（2） 實(shí)際濃度的測(cè)定：在一般天平上用干燥的燒懷稱取已除CO2的發(fā)酵液或啤酒樣品100.0g，置80水浴中蒸發(fā)酒精，蒸至原體積的13時(shí)，冷卻，加蒸餾水至內(nèi)容物100.0g，充分混勻，用比重瓶準(zhǔn)確測(cè)定20時(shí)的比重，查表求得實(shí)際濃度。加熱過(guò)程中可能有蛋白質(zhì)沉淀，測(cè)定比重時(shí)不必濾出。有時(shí)為簡(jiǎn)化操作，常將測(cè)定酒精分時(shí)蒸餾下的殘液加水至原重量，作測(cè)定實(shí)際濃度之用（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十

56、）。該法由于沸騰時(shí)刻較長(zhǎng)，對(duì)測(cè)定結(jié)果有一定阻礙。 我國(guó)部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：11度啤酒實(shí)際濃度不低于3.9，12度啤酒不低于4.0。 表3-2-7 比重-浸出物濃度對(duì)比表（部分）比重浸出物比重浸出物比重浸出物比重浸出物1.01203.0671.01303.3311.01403.5731.01503.8261.01604.0771.01704.3291.01804.5801.01904.8301.02005.081.02105.3301.02205.5801.02305.8281.02406.0771.02506.3251.02606.5721.02706.8191.02807.0661.02907.3

57、121.03007.5581.03107.8031.03208.0481.03308.2931.03408.5371.03508.7811.03609.0241.03709.2671.03809.5091.03909.7511.04009.9931.041010.2341.042010.4751.043010.7161.044010.9951.045011.1951.046011.4351.077011.673注：比重為20時(shí)測(cè)得，浸出物指100克樣品中的克數(shù)。五、注意事項(xiàng)：比重瓶易碎，請(qǐng)格外小心，特不是小帽。要檫干比重瓶外壁，特不是連接處的水分六、考慮題：若無(wú)20恒溫水浴，如何樣盡可能測(cè)準(zhǔn)比

58、重？實(shí)驗(yàn)十三 酒精度的測(cè)定及原麥汁濃度的計(jì)算一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆站凭康臏y(cè)定方法，監(jiān)測(cè)啤酒質(zhì)量二、實(shí)驗(yàn)原理：用小火將發(fā)酵液或啤酒中的酒精蒸餾出來(lái)，收集餾出液，測(cè)定其比重，依照比重-酒精度對(duì)比表，可查得酒精含量。三、實(shí)驗(yàn)器材：電爐，調(diào)壓變壓器，鐵架臺(tái)，500mL錐形瓶，冷凝管，100mL量筒或容量瓶。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、酒精度的測(cè)定在已精確稱重至0.05g的500mL三角燒瓶中，稱取l00.0g除氣啤酒，再加50mL水，按上冷凝器，冷凝器下端用一已知重量的100mL容量瓶或量筒接收餾出液。若室溫較高，為了防止酒精蒸發(fā)，可將容量瓶浸于冷水或冰水中。開(kāi)始蒸餾時(shí)用文火加熱，沸騰后可加強(qiáng)火力，蒸餾至餾出液

59、接近100mL時(shí)停止加熱。取下容量瓶，于一般天平上加蒸餾水至餾出液重100.0g，混勻。用比重瓶精確測(cè)定溜出液比重。查比重和酒精對(duì)比表，求得酒精含量。我國(guó)部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定11度啤酒的酒精含量不低于3.2%，12度啤酒的酒精含量不低于3.5。 2、實(shí)際濃度的測(cè)定將上述蒸去酒精的500mL三角燒瓶冷卻至室溫。加蒸餾水將蒸餾殘液調(diào)整至100.0g。按實(shí)驗(yàn)九測(cè)定蒸餾殘液在20時(shí)的比重。查比重-浸出物對(duì)比表，得出實(shí)際濃度。 3、原麥芽汁濃度的計(jì)算 原麥芽汁濃度是指發(fā)酵之前的麥芽汁濃度。生產(chǎn)中為檢查發(fā)酵是否正常，常依照啤酒的實(shí)際濃度來(lái)推算原麥汁濃度和發(fā)酵度。 依照巴林氏的研究，在完全發(fā)酵時(shí)，每2.0665g浸

60、出物可生成1g酒精，0.9565g CO2和0.11g酵母。若測(cè)得啤酒的酒精含量（重量百分比）為A實(shí)際濃度為n，則100克啤酒發(fā)酵前含有浸出物的克數(shù)應(yīng)為： A20665十n生成A克酒精，即從原麥汁中減少A 1.0665克浸出物（CO2和酵母沉淀物）。要生成100克啤酒，需原麥汁為： (100十A 10665)克原麥汁濃度P為： P=（ A20665十n）/（100十A 10665） 我國(guó)部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：11度啤酒原麥汁濃度為10.8112，12度啤酒為11.812.2%。 若計(jì)算所得的原麥汁濃度與發(fā)酵之前的麥汁濃度相符，講明發(fā)酵正常； 若計(jì)算所得的原麥汁濃度與發(fā)酵之前的麥汁濃度不符，講明發(fā)酵不正