質(zhì)譜技術(shù)與生命科學(xué)的發(fā)展

1、質(zhì)譜技術(shù)與生命科學(xué)的發(fā)展姓名：xx學(xué)號：xxxxxxxx班級：xxxxxxxx科目儀器分析任課老師：xxxxxxx【摘要】隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，質(zhì)譜得到了快速的發(fā)展，特別是與生物技 術(shù)的結(jié)合，開創(chuàng)了質(zhì)譜應(yīng)用的新領(lǐng)域。質(zhì)譜已成為生命科學(xué)研究中非 常重要的工具。其研究成果將大大豐富人類生命科學(xué)的研究，并將使 人類對生命的本質(zhì)，其發(fā)生發(fā)展過程的認(rèn)識達(dá)到一個(gè)前所未有的新高 度?！娟P(guān)鍵詞】生物質(zhì)譜蛋白質(zhì)核酸臨床醫(yī)學(xué)【前言】生命科學(xué)被譽(yù)為21世紀(jì)的最前沿科學(xué)之一，隨著人類第一張基因序列草 圖的完成和發(fā)展，生命科學(xué)的研究也將進(jìn)入一個(gè)嶄新的后基因組學(xué)，即蛋白 質(zhì)組學(xué)時(shí)代。正如基因草圖的提前繪制得益于大規(guī)模全自動

2、毛細(xì)管測序技術(shù) 一樣，后基因組研究也將會借助于現(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)等得到迅猛發(fā)展。20多 年來生命科學(xué)的飛速發(fā)展，均得益于重大技術(shù)的突破。如果沒有分子克隆、 PCR （多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)，我們今天就不可能取得在生物、醫(yī)療、藥物領(lǐng) 域的許多成就，例如人類基因組計(jì)劃就有賴于分子克隆技術(shù)。任何一個(gè)時(shí)期 科學(xué)的飛速發(fā)展都得益于相關(guān)技術(shù)的發(fā)展。一項(xiàng)技術(shù)對生命科學(xué)的促進(jìn)作用 可以持續(xù)相當(dāng)一段時(shí)間，之后將產(chǎn)生另一重大技術(shù)并由它來領(lǐng)跑，而質(zhì)譜技 術(shù)就是今后一個(gè)時(shí)期內(nèi)的“領(lǐng)跑技術(shù)”，將開啟生命科學(xué)的嶄新發(fā)展時(shí)代?！举|(zhì)譜的發(fā)展歷史】質(zhì)譜的開發(fā)歷史要追溯到20世紀(jì)初J. J.T hom so n創(chuàng)制的拋物線質(zhì)譜裝 置

3、，1919年Aston制成了第一臺速度聚焦型質(zhì)譜儀，成為了質(zhì)譜發(fā)展史上的 里程碑。從J. J. Tho mso n制成第一臺質(zhì)譜儀，到現(xiàn)在已有近90年了，早期 的質(zhì)譜儀主要是用來進(jìn)行同位素測定和無機(jī)元素分析，隨著離子光學(xué)理論的 發(fā)展，質(zhì)譜儀不斷改進(jìn)，其應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大。二十世紀(jì)四十年代以后 開始用于有機(jī)物分析，到20世紀(jì)50年代后期已廣泛地應(yīng)用于無機(jī)化合物和 有機(jī)化合物的測定。六十年代出現(xiàn)了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，使質(zhì)譜儀的應(yīng)用 領(lǐng)域大大擴(kuò)展，開始成為有機(jī)物分析的重要儀器。計(jì)算機(jī)的應(yīng)用又使質(zhì)譜分 析法發(fā)生了飛躍變化，使其技術(shù)更加成熟，使用更加方便。八十年代以后又 出現(xiàn)了一些新的質(zhì)譜技術(shù)，如快

4、原子轟擊電離子源，基質(zhì)輔助激光解吸電離 源，電噴霧電離源，大氣壓化學(xué)電離源，以及隨之而來的比較成熟的液相色 譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀，富立葉變換質(zhì)譜儀等。這些新的 電離技術(shù)和新的質(zhì)譜儀使質(zhì)譜分析又取得了長足進(jìn)展。質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué) 領(lǐng)域的應(yīng)用，更為質(zhì)譜的發(fā)展注入了新的活力，形成了獨(dú)特的生物質(zhì)譜技術(shù)?！举|(zhì)譜分析法】質(zhì)譜分析法，2 002年諾貝爾化學(xué)獎表彰的兩項(xiàng)成果之一，是通過對被測 樣品離子的質(zhì)荷比的測定來進(jìn)行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要 離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運(yùn)動行為的不同，把離子按質(zhì)荷 比(m/z)分開而得到質(zhì)譜，通過樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，可以得到樣品

5、的定 性定量結(jié)果?！旧镔|(zhì)譜技術(shù)】電噴霧質(zhì)譜技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)是誕生于80年代末期 的兩項(xiàng)軌電離技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的 質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性的變革。它們具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍，使得 在pmol ( 10-12甚至fmo l( 10- 15的水平上準(zhǔn)確地分析分子量高達(dá)幾萬到幾 十萬的生物大分子成為可能，從而使質(zhì)譜技術(shù)真正走入了生命科學(xué)的研究領(lǐng) 域，并得到迅速的發(fā)展。以下主要介紹與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)的幾項(xiàng)質(zhì)譜技術(shù)。電噴霧質(zhì)譜技術(shù)(El ect ros pra y I oni zsa tio n M ass Spe ctr ome tr y,E SI -

6、MS)電噴霧質(zhì)譜技術(shù)是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使 從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電 荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析 物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電 荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比(m/z)降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可 以檢測的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量也 可以根據(jù)質(zhì)荷比及電行數(shù)算出。電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)勢就是它可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液一 質(zhì)聯(lián)用(LC MS )是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達(dá)到檢測大分子物質(zhì)的目的?；|(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜

7、技術(shù)(Mat riX As sis ted Las er Des orp tio n / Ion iz ati on, MAL DI )基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體 時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。MALD AI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖 多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對應(yīng)關(guān) 系。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間(Time-of-Fli ght ,TOF)檢測器來檢測， 理論上講，只要飛行管的長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質(zhì)量數(shù)是沒有 上限的，因此MAL DI

8、- TOF質(zhì)譜很適合對蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大 分子的研究。快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)(Fa st Ato m B ome bar d-m ent Ma ss Spe ctr ome tr y , FAB MS)是一種軟電離技術(shù)，是用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品，使樣 品離子濺出進(jìn)入分析器，這種軟電離技術(shù)適于極性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定的化合物的 分析，特加適用于多肽和蛋白質(zhì)等的分析研究。FAB MS只能提供有關(guān)離子的精確質(zhì)量，從而可以確定樣品的元素組成和 分子式。而FABMS MS串聯(lián)技術(shù)的應(yīng)用可以提供樣品較為詳細(xì)的分子結(jié)構(gòu)信 息，從而使其在生物醫(yī)學(xué)分析中迅速發(fā)展起來。同位素質(zhì)譜同位素質(zhì)譜是一種開

9、發(fā)和應(yīng)用比較早的技術(shù)，被廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域， 但它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用只是近幾年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合 物的能力，該化合物又易于用同位素標(biāo)示，人們就想到用同位素質(zhì)譜的方法 檢測其代謝物中同位素的含量以達(dá)到檢測該病原菌的目的，同時(shí)也為同位素 質(zhì)譜在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了 一條思路?！旧镔|(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用】隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，質(zhì)譜的應(yīng)用范圍已擴(kuò)展到生命科學(xué)研 究的許多領(lǐng)域，特別是質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、醫(yī)學(xué)檢測、藥物成分分析及核酸等領(lǐng) 域的應(yīng)用，不僅為生命科學(xué)研究提供了新方法，同時(shí)也促進(jìn)了質(zhì)譜技術(shù)的發(fā) 展。質(zhì)譜與蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)分子量的測定蛋白質(zhì)類生物大分子分子量的測定有著十分重要 的意義

10、，如對均一蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定，既要測定蛋白質(zhì)的分子量，又要 測定亞基和寡聚體的分子量及水解、酶解碎片的分子量。常規(guī)的分子量測定 主要有滲透壓法、光散射法、超速高心法、凝膠層析及聚丙烯酸胺凝膠電泳 等。這些方法存在樣品消耗量大，精確度低易受蛋白質(zhì)的形狀影響等缺點(diǎn)。MALI MS技術(shù)以其極高的靈敏度、精確度很快在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣 泛的應(yīng)用，特別是在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用，至今已被分析的蛋白質(zhì)已有數(shù)百 種之多，不僅可測定各種親水性、疏水性及糖蛋白等的分子量，還可直接用 來測定蛋白質(zhì)混合物的分子量，也能被用來測定經(jīng)酶等降解后的混合物，以 確定多肽的氨基酸序列?？梢哉J(rèn)為這是蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破

11、。蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)組是指一個(gè)基因組、一個(gè)細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部 蛋白質(zhì)成分。蛋白質(zhì)組的研究是從整體水平上研究細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的 組成及其活動規(guī)律，包括細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)的分離、蛋白質(zhì)表達(dá)模式的識別、 蛋白質(zhì)的鑒定、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的分析及蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建。質(zhì)譜技 術(shù)作為蛋白質(zhì)組研究的三大支撐技術(shù)之一，除了用于多肽、蛋白質(zhì)的質(zhì)量測 定外，還廣泛地應(yīng)用于肽指紋圖譜測定以及氨基酸序列惻定等。肽指紋圖譜(PeP tid e M ass Fi nge rpr in tin g,P MF )測定是對蛋白酶解 或降解后所得多肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法，對質(zhì)譜分析所得肽片與多肽 蛋白數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理

12、論肽片進(jìn)行比較，從而判別所測蛋白是已知還是未 知。由于不同的蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸序列，因而不同蛋白質(zhì)所得肽片具 有指紋的特征。采用肽指紋譜的方法已對酵母、大腸桿菌、人心肌等多種蛋白質(zhì)組進(jìn)行 了研究。對大腸桿菌經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)的研究表明，三個(gè)肽片即可達(dá)到 對蛋白質(zhì)的正確識別。而采用原位酶解的方法對酵母蛋白質(zhì)組研究的結(jié)果顯 示，約90%的蛋白質(zhì)被識別，其中三十多種新蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，而這些蛋白質(zhì) 是酵母基因組研究中未能識別的開放閱讀框架。研究顯示，肽指紋譜的方法 比氨基酸組成分析更為可靠，這是因?yàn)镸ALDI測定肽質(zhì)量的準(zhǔn)確度為99.9 %， 而氨基酸組成分析的準(zhǔn)確度僅為90 %。另外MALD

13、I可以耐受少量雜質(zhì)的存在， 對于純度不是很高的樣品也能得到理想的結(jié)果。對肽序列的測定往往要通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)才能達(dá)到分析目的，它采用不 同的質(zhì)譜技術(shù)選擇具有特定質(zhì)荷比的離子，并對其進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解高，通過 推斷肽片的斷裂，即可導(dǎo)出肽序列。質(zhì)譜與核酸研究現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)自誕生以來在多肽及蛋白質(zhì)的研究中獲得了極大的成功， 于是人們開始償試著特質(zhì)譜技術(shù)用于核酸的研究工作，近年來合成寡核苷酸 及其類似物作為反義治療劑在病毒感染和一些癌癥的治療方面有著良好的前 景，寡核苷酸作為藥物其結(jié)構(gòu)特征必須進(jìn)行確證。常規(guī)的色譜或電泳技術(shù)只 能對其濃度和純度進(jìn)行分析，而對其堿基組成、序列等結(jié)構(gòu)信息卻無能為力。ESI和MALD

14、I質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為寡核苷酸及其類似物的結(jié)構(gòu)和序列分析 提供了強(qiáng)有力的方法，它是將被測寡核苷酸樣品先用外切酶從3或5端進(jìn) 行部分降解，在不同時(shí)間內(nèi)分別取樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得寡核苷酸部分降解 的分子離子峰信號，通過對相鄰兩個(gè)碎片分子質(zhì)量進(jìn)行比較，可以計(jì)算出被 切割的核苷酸單體分子質(zhì)量，將其與四個(gè)脫氧苷酸的標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行對照， 就可以讀出寡核苷酸的序列。由于MALDI技術(shù)分辨率的問題，使得其更適合 于減基數(shù)較少的短鏈核酸的分析。如何獲得高分辨率的DNA質(zhì)譜圖一時(shí)間成為了研究的熱點(diǎn)問題，由于DNA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)存在著不同于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，使得DNA樣品存在某些特殊性， 一是其結(jié)構(gòu)中存在著磷酸基團(tuán)，有形

15、成鈉磷化合離子的趨勢；二是在激光解 吸離子化過程中它的結(jié)構(gòu)不如蛋白質(zhì)穩(wěn)定，易形成碎片，這導(dǎo)致峰寬和分子 離子的強(qiáng)度變?nèi)?，從而使得分辨率下降?9 95 年，M . L . V est al 等把離子延遲引出(lo nDe lay ed E xtr act ion , D E) 技術(shù)應(yīng)用于MALDI MS中，不但提高了 MALDI MS的分辨率，而且也開創(chuàng)了 質(zhì)譜應(yīng)用于DNA研究領(lǐng)域的新局面。國內(nèi)鄧慧敏等也應(yīng)用DE MALDI-MS法測 定了混合堿基DNA，獲得了高分辨率的DNA質(zhì)譜圖。 質(zhì)譜與臨床醫(yī)學(xué)除了應(yīng)用于蛋白質(zhì)和核酸研究以外，質(zhì)譜還以其靈敏度和高分辨率在臨 床醫(yī)學(xué)檢直中得到了廣泛的應(yīng)用，

16、如對藥物代謝產(chǎn)物的動態(tài)分析，癌細(xì)胞蛋 白質(zhì)的鑒定，同位素標(biāo)記物的檢測等。其中用同位素14C標(biāo)記的14C-尿素呼 吸試驗(yàn)和15N標(biāo)記的15N-排泄試驗(yàn)已成為臨床檢測胃幽門螺桿菌（HP）的有 效手段。 質(zhì)譜與檢測隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，大量的生物工程產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)的測定 分子量及純度的方法已不能擔(dān)當(dāng)此重任，現(xiàn)在人們把MALD I-T OF- MS應(yīng)用于此 領(lǐng)域，得到了很好的效果。蔡耘等用上述技術(shù)對重組的人表皮生長因子（hEGF） 白細(xì)胞介素-3 （ IL 3 ）、腫瘤壞死因子（TNF ）粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落刺激 因子（GM CSF ）、粒細(xì)胞集落刺激因子（GCSF ）堿性成纖維生長因子（bFG

17、 F） 等六種基因工程產(chǎn)品進(jìn)行了測定，獲得了準(zhǔn)確的分子量信息及純度信息，這 為基因工程產(chǎn)品的檢測研究開辟了 一條新途徑?！旧镔|(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用的意義以及展望】質(zhì)譜分析法，對人類疾病治療意義重大，其出現(xiàn)具有里程碑的意義。所 有生命現(xiàn)象（包括遺傳、健康、疾病等）的執(zhí)行體都是蛋白質(zhì)，過去在基因、 核酸水平分析生命現(xiàn)象，認(rèn)為核酸水平的變化能代表蛋白質(zhì)的變化，而其實(shí) 蛋白質(zhì)的變化遠(yuǎn)比核酸的變化要復(fù)雜得多。質(zhì)譜技術(shù)問世之前沒有任何手段 能對蛋白質(zhì)進(jìn)行快速、通量地分析，用傳統(tǒng)方法分析、鑒定未知的蛋白質(zhì)， 必須先分離純化，對一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的分析，就需要若干年的時(shí)間。而質(zhì)譜技 術(shù)的出現(xiàn)，能對蛋白質(zhì)的復(fù)雜性進(jìn)行分析，一

18、天可能完成上千個(gè)樣本的分析， 這大大縮短了科研時(shí)間，從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模分析、鑒定成為可能。再者，生物質(zhì)譜技術(shù)在工業(yè)制藥領(lǐng)域也很重要。一個(gè)人在健康或生病狀 態(tài)下，基因是不變的，只是蛋白質(zhì)有了略微的變化。質(zhì)譜技術(shù)則提供了一種 發(fā)現(xiàn)和鑒定在疾病作用下表達(dá)異常的蛋白質(zhì)的方法。這種蛋白質(zhì)可以作為藥 物篩選的作用靶點(diǎn)，即通過對疾病發(fā)生的不同階段蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)一些疾病不同時(shí)期的蛋白標(biāo)志物，這樣不僅可以為疾病的早期發(fā)現(xiàn)提供重要的診斷指標(biāo)，還對藥物的發(fā)現(xiàn)具有指導(dǎo)意義。癌癥研究為例，挽救病人 的最有效的手段就是癌癥的早期診斷和治療。采用質(zhì)譜技術(shù)的方法研究正常 組織、癌組織和癌旁組織的蛋白質(zhì)的表達(dá)譜，通過差異比較，可以發(fā)現(xiàn)與腫 瘤早期發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)，并經(jīng)過進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證，可以有效地發(fā)現(xiàn)腫瘤 早期診斷的分子標(biāo)志物。我國僅有的幾個(gè)生物質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院已經(jīng) 開始了對白血病、