淺談乙肝病毒檢測(cè)課件

1、乙肝病毒檢測(cè)乙肝病毒檢測(cè)病毒鑒定方法一、分離培養(yǎng)方法二、快速診斷方法1、光學(xué)顯微鏡檢查 病毒包涵體及某些大病毒顆粒的檢查2、電子顯微鏡的檢查 電鏡直接檢查 免疫電鏡檢查3、血清學(xué)檢查4、病毒基因組檢查 核酸雜交和聚合酶鏈反應(yīng)病毒鑒定方法一、分離培養(yǎng)方法乙肝病毒檢測(cè)一、乙肝五項(xiàng)（兩對(duì)半）二、乙肝病毒核酸定量檢測(cè)乙肝病毒檢測(cè)一、乙肝五項(xiàng)（兩對(duì)半） HBV抗原抗體系統(tǒng)檢測(cè)臨床意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義IgMIgG+-感染或無(wú)癥狀攜帶者+-+-+-急性或慢性乙型肝炎（傳染性強(qiáng)） （大三陽(yáng)）+-+-+急性肝炎趨向恢復(fù)（小三陽(yáng)）-+-+-+既往感染恢復(fù)期-+-+-既往感

2、染恢復(fù)期-+既往感染-+-既往感染或接種疫苗-未感染，無(wú)免疫力 HBV抗原抗體系統(tǒng)檢測(cè)臨床意義HBsAg抗-HBsHBeA淺談乙肝病毒檢測(cè)課件淺談乙肝病毒檢測(cè)課件二、乙肝病毒核酸定量檢測(cè)1.檢測(cè)原理 利用熒光PCR技術(shù)，以HBV基因組中相對(duì)保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異引物及熒光探針，通過PCR對(duì)DNA進(jìn)行快速定量檢測(cè)。 熒光探針TaqMan 探針實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)。在 PCR 反應(yīng)過程中，同時(shí)利用 Taq 酶的 53聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探針降解，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離使得熒光信號(hào)發(fā)射， FAM 熒光檢測(cè)乙型肝炎病毒JOE/RED610 nm 波長(zhǎng)通道檢測(cè)內(nèi)參。二

3、、乙肝病毒核酸定量檢測(cè)1.檢測(cè)原理PCR分四個(gè)階段PCR分四個(gè)階段如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。如何定量？Ct值的概念定量原理確定初始模板的濃度初始 DNA量越多, 熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量定量原理確定初始模板的濃度初始 DNA量越多, 熒光達(dá)到某熒光化學(xué)SYBR Green 1 TaqMan熒光化學(xué)SYBR Green 1 TaqManTaqManTaqManSYBR Green I 工作原理。 SYBR G

4、reen 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未結(jié)合SYBR Green 1 dye變性: 無(wú)熒光信號(hào)SYBR Green I 工作原理。 SYBR Green2.所用試劑組分名稱規(guī)格數(shù)量主要成分 核酸提取試劑DNA提取液I4.5ml/瓶2DNA提取液質(zhì)控品及陽(yáng)性定量參考品陰性質(zhì)控品250ul/管1HBV陰性血清強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品250ul/管1滅活HBV陽(yáng)性血清臨界陽(yáng)性質(zhì)控品250u

5、l/管1滅活HBV陽(yáng)性血清HBV定量參考品（2.0X106IU/ml）250ul/管1滅活HBV陽(yáng)性血清HBV定量參考品（2.0X105IU/ml）250ul/管1滅活HBV陽(yáng)性血清HBV定量參考品（2.0X104IU/ml）250ul/管1滅活HBV陽(yáng)性血清HBV定量參考品（2.0X103IU/ml）250ul/管1滅活HBV陽(yáng)性血清 PCR檢測(cè)試劑HBV-內(nèi)標(biāo)溶液100ul/管1內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒及穩(wěn)定劑HBV-PCR反應(yīng)管1人一份/管20引物、探針、taq酶等2.所用試劑組分名稱規(guī)格數(shù)量主要成分 核酸提取試劑D3、實(shí)驗(yàn)步驟1.DNA提取 將待測(cè)樣本、陽(yáng)性定量參考品、陰性質(zhì)控品、HBV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、

6、 HBV臨界質(zhì)控品進(jìn)行同步處理。1.1 取200 L樣品，加入450 L DNA提取液I和4 L內(nèi)標(biāo)溶液，用振蕩器劇烈震蕩搖勻15秒，瞬時(shí)離心數(shù)秒，100處理10分鐘1.2 12000rpm離心5分鐘，備用2.PCR試劑準(zhǔn)備直接使用HBV-PCR反應(yīng)管3. 加樣HBV-PCR反應(yīng)管分別加入將待測(cè)樣本、陽(yáng)性定量參考品、陰性質(zhì)控品、HBV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、 HBV臨界質(zhì)控品上清20 L。蓋緊管蓋，8000rpm離心數(shù)秒后擴(kuò)增3、實(shí)驗(yàn)步驟1.DNA提取4.PCR擴(kuò)增對(duì)各標(biāo)本進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)條件：93 2分鐘93 45秒55 60秒10個(gè)循環(huán)93 30秒45 60秒30個(gè)循環(huán)FAM通道檢測(cè)HBV核酸，VIC通

7、道檢測(cè)內(nèi)標(biāo)4.PCR擴(kuò)增4.結(jié)果判定1 如果在FAM檢測(cè)通道檢測(cè)擴(kuò)增曲線無(wú)明顯對(duì)數(shù)期或Ct值等于30，VIC檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)期，則為陰性或小于檢測(cè)靈敏度2 FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)期且Ct值小于30按以下方法判斷：C100,HBV DNA濃度5.0E+008 ,HBV DNA濃度5.0X108 IU/ml 如需精確定量結(jié)果，可將樣品用陰性質(zhì)控品稀釋到線性范圍后再檢測(cè)，則樣品HBV DNA濃度=（CX稀釋倍數(shù)） IU/ml4.結(jié)果判定5.注意事項(xiàng)1 每次實(shí)驗(yàn)需檢測(cè)陰性質(zhì)控品、HBV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、 HBV臨界質(zhì)控品，滿足要求方可進(jìn)行判定（陽(yáng)性質(zhì)控品Ct30，陰性質(zhì)控品無(wú)明顯對(duì)數(shù)期

8、或Ct值等于30 VIC檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)期）2 本試劑盒的最低檢出濃度為30IU/ml，最低定量濃度為100IU/ml3 所有樣品包括質(zhì)控品均按傳染性標(biāo)本對(duì)待嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作（帶口罩手套），所有操作在生物安全柜內(nèi)操作，物品不能隨意帶出生物安全柜，用完的物品集中放置高壓滅菌后方可處置。5.注意事項(xiàng)一、乙肝病毒e抗原檢測(cè)1.檢測(cè)原理 在微孔板上預(yù)包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（ HbeAb），配以辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體（ HbeAb-HRP）及TMB（四甲基聯(lián)苯胺）等試劑，采用雙抗夾心法檢測(cè)血清中的乙肝病毒e抗原（ HbeAg）一、乙肝病毒e抗原檢測(cè)1.檢測(cè)原理淺談乙肝病毒檢

9、測(cè)課件2.所用試劑組成成分規(guī)格組成成分規(guī)格1.HbeAg微孔板（包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（ HbeAb）96TX塊7.底物B（過氧化氫）7mlX1支2.HbeAg酶標(biāo)抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體）3.5mlX1支8.終止液7mlX1支3.HbeAg陽(yáng)性對(duì)照血清（含HbeAg陽(yáng)性血清）1mlX1支9.封口膜2張4.HbeAg陰性對(duì)照血清（正常人血清）1mlX1支10.自封袋1個(gè)5.濃縮洗滌（PBS-T緩沖液）12.5mlX1支11. 說明書1張6.底物A（過氧化氫）7mlX1支2.所用試劑組成成分規(guī)格組成成分規(guī)格1.HbeAg微孔板963、實(shí)驗(yàn)步驟1.平衡 試劑盒個(gè)組分取出，平

10、衡至室溫（16-25）余者以自封袋封存2.配液 濃縮洗滌液搖勻后，用蒸餾水或去離子水按1:19稀釋備用3. 編號(hào) 微孔條固定于支架，按序編號(hào)4.加樣 分別用加樣器加入陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清50 L（各加兩孔），待測(cè)血清50 L（1孔），空白對(duì)照（不加）3、實(shí)驗(yàn)步驟1.平衡5.加酶 每空加酶標(biāo)抗體50 L，混勻（空白對(duì)照不加）6.溫浴 37溫浴25分鐘，室溫平衡5分鐘（封口膜覆蓋孔口，避免其他因素影響）7.洗滌 洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時(shí)間）8.顯色 每孔加入A、B底物50 L，混勻，37暗置15分鐘9.終止 每孔加50 L終止液50 L，混勻10.測(cè)定 酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)450nm或雙波長(zhǎng)450/630nm測(cè)定各空OD值，記錄結(jié)果,30分鐘內(nèi)測(cè)定完成）5.加酶4.結(jié)果判定1. 臨界值(C.O)計(jì)算 臨界值=陰性對(duì)照孔OD值均值N X 2.1 注意：陰性對(duì)照孔均值N大于0.1應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)，小于0.05按0.05計(jì)算2. 結(jié)果判定樣品OD值/ C.O 1為HbeAg陽(yáng)性樣品OD值/ C.O 1為HbeAg陽(yáng)性3.陰性對(duì)照孔均值N大于0.1或陽(yáng)性對(duì)照均值0.4實(shí)驗(yàn)無(wú)