畢業(yè)論文-應用高通量測序分析母嬰皮膚不同部位馬拉色菌的分布情況

1、PAGE PAGE 26應用高通量測序分析母嬰皮膚不同部位馬拉色菌的分布情況生命科學學院生物科學專業(yè) 導師：PAGE 0目錄 TOC o 1-1 h z u HYPERLINK l _Toc232185783 摘要 PAGEREF _Toc232185783 h 1 HYPERLINK l _Toc232185784 ABSTRACT PAGEREF _Toc232185784 h 2 HYPERLINK l _Toc232185785 第一部分 前言 PAGEREF _Toc232185785 h 3 HYPERLINK l _Toc232185786 第二部分 材料和方法7 HYPERLI

2、NK l _Toc232185787 第三部分 結(jié)果和討論 PAGEREF _Toc232185787 h 14 HYPERLINK l _Toc232185788 第四部分 實驗總結(jié) PAGEREF _Toc232185788 h 23 HYPERLINK l _Toc232185790 致謝 PAGEREF _Toc232185790 h 24 HYPERLINK l _Toc232185791 參考文獻 PAGEREF _Toc232185791 h 25應用高通量測序分析母嬰皮膚不同部位馬拉色菌的分布情況摘要皮膚真菌是一類能夠較長期地寄生在人體皮膚表面的真菌。皮膚真菌附著在人體皮膚表面

3、，以人體細胞及腺體分泌的物質(zhì)為營養(yǎng)進行生長繁殖，并影響宿主的日常生理代謝。人的健康狀態(tài)和外界環(huán)境的變化都會對皮膚真菌的分布情況和多樣性產(chǎn)生影響。不同部位皮膚的生理特性差異構成了不同部位皮膚真菌的種屬特點。馬拉色菌屬是皮膚真菌中豐度最高的屬，該屬真菌密切參與皮膚代謝，并可能引發(fā)馬拉色菌病等多種皮膚疾病。研究馬拉色菌在皮膚表面的分布及多樣性情況對于了解皮膚健康、防治皮膚疾病有著重要的意義。本實驗采用高通量測序的方法對5組母嬰七個部位（共195個樣品）真菌組成進行分析，主要考察了馬拉色菌種水平上的分布特點。我們發(fā)現(xiàn)馬拉色菌在油性部位相對比較多，其中最多的兩種是M.globosa和M.restrict

4、a。但沒有發(fā)現(xiàn)母嬰間馬拉色菌分布的相關性。關鍵詞：皮膚 真菌 母嬰 馬拉色菌 高通量測序 Exploration of Skin Malassezia Community between Mother and Infant through High-Throughput PyrosequencingABSTRACTSkin fungi is a kind of longer-term parasites in the human skin surface fungi: they cover the human skin and live on the nutrition produced by

5、 human cells and glands, and conversely they will act on skin metabolism; meanwhile, environment will also affect these organisms. Differentiated skin character determined the fungi communityin particular sites. Malassezia is the most abundant genus in the skin fungus, which closely involved in the

6、skin metabolism and may cause Malassezia diseases or some other skin diseases. Researches on skin Malassezia distribution and diversity have important implications of understanding of skin health and prevention of skin disease.This study analyzed five groups of mother and infant skin fungi community

7、 in seven parts through high-throughput pyrosequencing, focusing on the distribution of Malassezia species level. We found relatively more Malassezia in oily parts, M.globosa and M.restricta two kinds of majority, but found no correlation between the mother and infant.Keyword: skin fungi mother infa

8、nt Malasseiza high-throughput pyrosequencing第一部分 前言皮膚和微生物的關系皮膚是人體最重要的器官之一，它是機體對外部環(huán)境的第一道屏障，既能保護人體不受病原體侵入，也是人體與環(huán)境發(fā)生交互作用的主要場所。皮膚表面布滿了毛囊、皮脂腺和汗腺，這些孔道經(jīng)過新陳代謝作用像外界排放出油脂和汗液等代謝產(chǎn)物并堆積于皮膚表面。這些腺體和孔道在皮膚上的分布并不均勻，這就造成我們身體不同部位的皮膚性質(zhì)的不同。皮脂腺分布較多的額頭、鼻子和背部，通常會產(chǎn)生較多的油脂，因此這些部位皮膚會比較油性（seborrheic）；有些皮膚部位如肘窩和腋下，汗腺分布較多，則該部位就會相對濕

9、潤（moist）；其他一些部位腺體分布較少，從而皮膚呈干性（dry）。這些由皮膚分泌并堆積于皮膚表面的代謝物，由充當分解者角色的皮膚微生物分解并作為養(yǎng)分加以利用。所以，一定意義上，皮膚微生物并不是對人體有害的，相反，它們分解了皮膚代謝物，將原本不溶于水的大分子物質(zhì)分解為可溶于水的小分子物質(zhì)，防止毛孔的堵塞，對維持皮膚表面的清潔起到了重要的作用，大部分皮膚微生物是常駐人體皮膚表面的，和人類處于共生關系。只有部分病原體和條件致病菌會造成一些皮膚疾病。不同性質(zhì)的皮膚表面所附著的微生物種類和豐度有明顯的不同。目前對于皮膚細菌多樣性的研究較為成熟。已有知識表明，油性皮膚部位葡萄球菌豐度較高，而濕性皮膚部

10、位則是丙酸桿菌和棒狀桿菌較高；油性皮膚細菌多樣性較低，濕性部位較高等等。皮膚真菌的研究進展相比細菌，目前對皮膚真菌的研究較少。然而，皮膚真菌相關研究和細菌具有同等重要的意義。皮膚表面有多種真菌，其中有少數(shù)致病菌，其余大都屬于正常菌群，而正常菌群中還可能存在部分條件致病菌，即指在特定條件下（包括溫度，濕度，酸堿度等因素），會由正常菌群轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【鹌つw疾病。目前已知的真菌引起的皮膚病，常見的有：由紅色毛癬菌引起的腳氣，由白色念珠菌引起的皮膚瘙癢癥，由馬拉色菌引起的各類皮炎及皮癬等。皮膚真菌多樣性水平與細菌相比較低，在門分類水平下主要為擔子菌門和子囊菌門兩個門，擔子菌門下真菌的所占比重較大，而

11、子囊菌門下真菌的種類較多。皮膚真菌中豐度第一位的是馬拉色菌（60%-80%），其具體分類信息為擔子菌門，黑粉菌亞門，外擔子菌綱，馬拉色菌目，馬拉色菌科，馬拉色菌屬。馬拉色菌屬下目前已在人皮膚上發(fā)現(xiàn)了8個種，分別是：M.globosa，M.restricta，M.sympodialis，M.furfur，M.slooffiae，M.obtusa，M.dermatis，M.yamatoensis，M.japonica。雖然這幾種馬拉色菌都能在健康人皮膚表面檢測到，但已有研究表明，數(shù)種皮膚疾病的發(fā)生與某幾種馬拉色菌有關。Luciana等人用分子方法分析了牛皮癬患者健康皮膚和患處的真菌多樣性，發(fā)現(xiàn)M.

12、furfur在患處的豐度明顯比健康皮膚部位高，而健康皮膚部位主要是M.globosa和M.restricta。馬拉色菌具有親脂（lipophilic）的特性，Gabriella等人應用半定量蛋黃平板法測定了各種從皮膚表面分離得到的馬拉色菌的細胞外磷脂酶產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)蛇皮癬患者患處分離得到的馬拉色菌株磷脂酶活性顯著比健康皮膚分離株高，并推測馬拉色菌的這種親脂活性可能與皮膚病導致的皮膚潰爛瘡口形成有關。馬拉色菌還可能與其他疾病的發(fā)生有關，包括脂溢性皮炎、過敏性皮炎、毛囊炎、甲癬等。其中許多研究者認為M.globosa是導致花斑癬的致病因子。母嬰皮膚微生物研究的意義嬰兒在出生之前是被水包圍的，出生以后嬰

13、兒從無菌的環(huán)境到了散布著微生物的空氣中，這種環(huán)境的瞬時轉(zhuǎn)變也使得皮膚表面的微生物發(fā)生了變化。在子宮中，嬰兒的皮膚還是無菌的，嬰兒出生時，皮膚微生物的來源有兩種。順產(chǎn)的嬰兒的皮膚微生物來源于母親的陰道微生物，主要包括乳酸桿菌等乳桿菌目的微生物；剖腹產(chǎn)的嬰兒由于整個出生過程是無菌的，因此他們的皮膚微生物來源于周圍環(huán)境。這種差異在出生之后的10分鐘內(nèi)是非常明顯的，而且順產(chǎn)嬰兒的皮膚微生物和母親的陰道微生物高度相關，剖腹產(chǎn)嬰兒的皮膚微生物則與母親的皮膚微生物高度相關。現(xiàn)今，對于母嬰微生物關聯(lián)的研究還不多。但新生兒與母親的關系密切，母親會經(jīng)常接觸嬰兒，兩者的皮膚微生物便可借機傳播。同時，嬰兒免疫系統(tǒng)發(fā)育

14、尚不完全，人體和微生物之間的免疫平衡尚未建立；因此，成人皮膚的常駐微生物很可能就會變?yōu)闂l件致病菌，引發(fā)嬰幼兒疾病。剖腹產(chǎn)和順產(chǎn)嬰兒在出生時候的微生物群落組成差異很大，而這種差異的潛在風險以及會在何時消失目前仍是未知的。本實驗中，我們希望對采集到的受試者身體7個部位樣品-額頭、背部、鼻孔、肘窩、指縫、前臂和手背（嬰兒因為采樣操作不便，未采集鼻孔樣品）的真菌多樣性，特別是豐度居首的馬拉色菌的多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)一些規(guī)律和有價值的結(jié)果，為后續(xù)深入研究皮膚真菌多樣性提供理論依據(jù)及經(jīng)驗。皮膚真菌的研究方法ITS鑒定的原理真菌研究方法一般有細胞培養(yǎng)和分子生物學方法兩種。細胞水平研究馬拉色菌非常困難，馬拉色

15、菌對培養(yǎng)環(huán)境很挑剔，生長周期也很長（一般在數(shù)周左右）。目前研究馬拉色菌大多采用非培養(yǎng)的分子生物學方法，通過PCR和測序得到不同樣品中馬拉色菌序列片段，進而分析得到其在樣品中的多樣性等信息。分子生物學方法的優(yōu)點在于獲得數(shù)據(jù)的速度快且數(shù)據(jù)量大，實驗難度低；其不足之處則是在實驗過程中存在許多容易產(chǎn)生偏差（biase）的地方，而PCR和測序等實驗關鍵步驟會放大這些偏差，造成實驗結(jié)果多樣性高于實際水平。由于分子方法單次可以得到的數(shù)據(jù)量遠高于培養(yǎng)方法，故即使會產(chǎn)生一定的誤差，研究者一般還是會選用該方法。真菌PCR引物設計區(qū)域一般選擇真菌基因組的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）。這是因為真核生物的rDNA 上的5.8、

16、18和28S rRNA 基因有極大的保守性，即存在著廣泛的異種同源性。而ITS區(qū)由于不加入成熟核糖體，所以ITS片段在進化過程中承受的自然選擇壓力非常小，因此能容忍更多的變異。在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關系非常接近的2個種都能在ITS 序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進化特征。研究表明，ITS 片段的進化速率是18S rDNA的10倍。這就是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎。ITS1 和ITS2 是中度保守區(qū)域,，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯。這種特點使ITS 適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系

17、統(tǒng)發(fā)育關系分析。由于ITS 的序列分析能實質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異，此外ITS 序列片段較小、易于分析, 目前已被廣泛應用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。圖1.1真菌各類引物位置（摘自reference 1）高通量測序技術在首次利用商業(yè)化的焦磷酸測序成功完成了支原體的測序之后，第二代測序技術開始引起了人們的關注。第二代測序技術是邊合成邊測序，它們共同的特點是高通量，低成本。目前最常用的高通量測序技術有焦磷酸測序、Illumina和Solexa三種。對于微生物生態(tài)中16S rRNA以及真菌ITS分析，最常用的是焦磷酸測序技術，其最大的優(yōu)點在于讀長較其它兩種測序方

18、法更長，可以達到400 bp-800 bp，并且不需要通過拼接即可覆蓋2-3個高變區(qū)。焦磷酸測序的原理是利用乳液PCR和ATP依賴的熒光激發(fā)反應。首先，在DNA片段或PCR產(chǎn)物的兩端加上接頭A和接頭B，接頭A用于結(jié)合測序引物，接頭B利用生物素-鏈霉親和素作用結(jié)合在磁珠上。用磁珠結(jié)合連接Adaptor后的DNA片段，并進行乳液PCR擴增增強熒光信號強度。然后每個磁珠會分別散布在一個小孔中，開始測序反應。每輪測序?qū)⒓尤胍环NdNTP，若與模板匹配，釋放出的高能磷酸鍵就會使底物APS在ATP硫化酶的催化下生成ATP，繼而ATP熒光素酶利用ATP激發(fā)熒光（圖1.2），焦磷酸測序一次能夠得到0.5 gb的

19、數(shù)據(jù)量。因為測序成本的下降，越來越多的研究開始通過直接測序而非一些序列多態(tài)性來研究微生物生態(tài)，為了盡可能的重現(xiàn)實際環(huán)境中的物種組成，測序深度和序列準確性是非常重要的。高通量測序的錯誤率一般均高于Sanger法測序，這對于群落分析來說是致命的一個缺點，錯誤率提高會導致序列之間的差異，從而導致多樣性高于真實值。對測序結(jié)果進行篩選（如質(zhì)量篩選，長度篩選，降噪等等）后的數(shù)據(jù)才認為是可信的數(shù)據(jù)。近年來，出現(xiàn)了多種針對微生物生態(tài)高通量測序結(jié)果進行分析的處理流程，如Mothur，QIIME等等。第二部分 材料和方法 實驗材料儀器與耗材：材料聚酯纖維拭子儀器Corneometer皮膚水分測定儀Vapomete

20、r皮膚水分蒸發(fā)測定儀HmeterpH測定儀Sebumeter油脂測定儀MOBIO VOTEX-Genie 2振蕩儀恒科DK 80水浴鍋Takara PCR儀Eppendorf臺式高速離心機5415D天能電泳儀復日凝膠成像系統(tǒng)FR-200ANanodrop 3300羅氏454 GS-FLX焦磷酸測序儀試劑與試劑盒：試劑潤濕液（0.15 M NaCl and 0.1% Tween）小牛血清（20 mg/mL）Takara ExTaq PreMixBiowest瓊脂糖Picogreen熒光染料TAE 緩沖液試劑盒MOBiO PowerSoilTM DNA Isolation KitMOBIO Ult

21、raCleanTM PCR Clean-up DNA Purification KitAxygen AxyPrep DNA膠回收試劑盒數(shù)據(jù)分析軟件MothurExcelBioeditMegaOtupipe實驗流程 采樣對象介紹采樣對象為5對母親和嬰兒，母親的年齡在29-33歲之間，嬰兒年齡在2-4個月之間?，F(xiàn)將母親編號為M01-M05，對應的嬰兒編號為I01-I05（即M01為母親，I01為她的孩子，以此類推）。5名嬰兒中包括3名男嬰和2名女嬰，其中剖腹產(chǎn)1名和順產(chǎn)4名（表2.1）。采樣對象一周之內(nèi)不能使用任何抗生素類和甾醇類產(chǎn)品，采樣前12小時內(nèi)不能在采樣部位上使用任何清潔用品（包括水洗）或

22、護膚品，在采樣前經(jīng)過醫(yī)生檢查并未患有皮膚病。受試者在采樣前均已簽署知情同意書，充分了解本次采樣的流程和目的。表2.1 母親和嬰兒的基本信息母親編號年齡生產(chǎn)方式母乳嬰兒編號嬰兒年齡性別M0131歲剖腹產(chǎn)是I013個月男M0229歲順產(chǎn)是I022個月男M0331歲順產(chǎn)是I033個月女M0433歲順產(chǎn)是I043個半月男M0532歲順產(chǎn)是I052個月女 樣品采集和皮膚參數(shù)本次實驗的采樣選取了七個部位。其中對母親的七個采樣點分別為：額頭（Glabella，Gb）、后背（Back，Ba）、鼻孔（Nares，Na）、肘窩（Antecubital fossa，Av）、指縫（Interdigital web s

23、pace，Is，采樣位置在中指與無名指之間）、前臂（Volar forearm，Vf）和手背（Hand back，Hb）。而嬰兒由于好動，鼻孔采樣較危險，所以只采了余下六個部位，包括額頭、后背、肘窩、指縫、前臂和手背。這些部位可以簡單的分為三類：額頭和后背屬于油性部位，鼻孔、肘窩和指縫屬于潮濕部位，前臂和手背屬于干性部。對于肘窩、指縫、前臂和手背這類部位，每次采樣隨機決定采集左手還是右手。每名受試者都會進行三次重復采樣，采樣日期為2011年7月19日，7月21日和7月23日，即一共得到195個樣品。采樣由采樣公司專人完成。采樣時，工作人員需戴手套、帽子，穿防護衣，以避免交叉污染。受試者在事先約

24、定的房間內(nèi)等候，室溫維持在24C。采樣順序為先母親后嬰兒，采集部位依次為手背指縫前臂肘窩鼻孔額頭背，結(jié)束后再測定皮膚參數(shù)。 采樣方法具體如下：取一支無菌聚酯纖維拭子蘸取潤濕液，在受試者皮膚相應部位22 cm2的部位反復來回用力擦拭50次，持續(xù)時間約30 s，鼻孔采樣時用無菌拭子沿著鼻孔粘膜表面輕輕繞2圈。將鑷子過火高溫消毒，待鑷子冷卻后用其扯下拭子頭部放入一個MOBiO PowerSoilTM試劑盒提供的PowerBead Tube中，注意拭子頭不要碰到管壁，完成后換一根新的拭子進行下一采樣。采集過后樣品放于4保存，在12小時內(nèi)提取DNA。采樣過后在受試者皮膚采樣點的周圍進行參數(shù)測定，測定的參

25、數(shù)包括油脂，角質(zhì)層含水量，水分蒸發(fā)量和pH值（圖2.1）。其中，鼻孔并未進行測定，指縫由于皮膚面積較小，采樣部位與參數(shù)測定部位是左右對稱兩個部位，只測了一次。嬰兒的指縫由于面積太小并沒有進行測定。另外，由于水分蒸發(fā)量和pH值的測量需要停留較長的時間，嬰兒樣本也并未進行測定。 樣品的DNA提取DNA提取使用MOBiO PowerSoilTM DNA Isolation Kit。步驟為：檢查Solution C1是否有沉淀，若有則水浴加熱到60C至溶解；向裝有拭子的PowerBead Tubes管中加入60 L Solution C1，顛倒翻轉(zhuǎn)數(shù)次混勻；水平固定Tubes，65C水浴10min；將

26、Tubes放在MOBIO VOTEX-Genie 2振蕩儀，最高速度振蕩2 min；室溫10,000g離心1min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的2ml Collection Tube；加入250 LSolution C2，振蕩5 s混勻，4C溫育5 min;室溫10,000g離心1min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的2ml Collection Tube，避免吸入沉淀；加入200 LSolution C3，振蕩5 s混勻，4C溫育5 min；室溫10,000g離心1min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的2ml Collection Tube，避免吸入沉淀；使用前搖勻Solution C4，加入1.2ml，振蕩5s

27、混勻；加675 L混合液到Spin Filter中，10,000g離心1 min，棄廢液；重復上一步驟，直至所有混合液過完柱；加入500 L Solution C5，室溫10,000g離心30 s，棄廢液；10,000g空離2 min，將Filter置于新的2ml Collection Tube中;加入100 L Solution C6至膜中央，靜置1 min后10,000g離心1 min;棄去離心柱，樣品-20C保存。 真菌ITS擴增我們采用兩輪PCR法對引物進行擴增。第一輪使用不帶Adapter的NLC2和NSA3引物；第二輪使用帶有Adaptor和Tag（每個為不同的8聚寡核苷酸標簽）的

28、長引物擴增，包含以下幾個部分：在58A2R的5端加上樣品特異性的寡核苷酸標簽，再連上焦磷酸測序引物AdaptorA，NSI1的5端連上焦磷酸測序時序列連接磁珠所需的AdaptorB（圖2.2）。圖2.2用于焦磷酸測序的PCR的Adaptor引物組成引物序列為：第一輪：NLC2：GAGCTGCATTCCCAAACAACTCNSA3：AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA第二輪：AdaA-58A2R：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACGACTNNNNNNNNTCCTGCGTTCTTCATCGATAdaB-NSI1：CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCGACT

29、CAGATTGAATGGCTTAGTGAGGPCR反應體系如下：表2.2 PCR反應體系及反應條件組分體積（L）反應條件第一輪（25 L體系）94C 5 min94C 30 s50C 30 s72C 90 s72C 10minExTaq Premix12.5BSA1NLC22(2.5pM)30循環(huán)NSA32(2.5pM)dd H2O1.5模板6第二輪（50 L體系）94C 5 min94C 30 s53C 1 min72C 45 s72C 10minExTaq Premix25BSA2AdaA-58A2R2(2.5pM)20循環(huán)AdaB-NSI12(2.5pM)dd H2O15第一輪產(chǎn)物4將P

30、CR產(chǎn)物在1.5%（wt/vol）的瓊脂糖凝膠中電泳（170V，20 min），電泳后將凝膠浸泡于含有20 g/mL溴化乙錠（EB）的TAE緩沖液中20min后在紫外燈（216nm）照射下檢測。 PCR產(chǎn)物的純化為了避免PCR擴增后的引物二聚體對后續(xù)濃度測定產(chǎn)生干擾，故先對PCR產(chǎn)物進行純化。純化使用MOBIO UltraCleanTM PCR Clean-up DNA Purification Kit。步驟為：加入PCR體系5倍的SpinBind液（使用前搖晃）和PCR產(chǎn)物；吹打混勻，可能會分層（油層在上），一定要充分混勻；將混合液轉(zhuǎn)移到SpinFliter中，避免吸入油層；10,000g離

31、心30 s，棄廢液；加入300L SpinClean Buffer，10,000g離心1 min，棄廢液；10,000g空離2 min，將Filter置于新的Collection Tube中；加入50 L Elution Buffer，10,000g離心1 min；棄離心柱，樣品-20C保存。將純化產(chǎn)物在1.5%（wt/vol）的瓊脂糖凝膠中電泳（170V，20 min），電泳后將凝膠浸泡于含有20 g/mL 溴化乙錠（EB）的TAE緩沖液中20 min后在紫外燈（216 nm）照射下檢測。 產(chǎn)物混合和送焦磷酸測序先把純化產(chǎn)物進行適度稀釋以滿足Nanodrop的測定范圍（10500 ng/mL

32、）。將稀釋產(chǎn)物與DNA染料Picogreen進行等比例混合，用Nanodrop 3300進行濃度測定，根據(jù)樣品的濃度決定混合時各個樣品的加入體積。焦磷酸測序的每個測序板加入105個樣品（5個人，每個人21或18個樣品），每個測序板內(nèi)的八聚寡核苷酸標簽不能重復。將大于5ng/L的樣品按每個樣品20 ng的量在1.5 mL離心管中混合，其他樣品在另一離心管按照5 ng/樣的體積混合。預混合之后，測定這兩管的濃度，根據(jù)樣品數(shù)量和濃度確定混合的體積，用Axygen AxyPrep DNA膠回收試劑盒回收混合產(chǎn)物以去除殘余的引物片段或雜帶。具體步驟如下：將樣品混合液進行1%瓊脂糖凝膠電泳（120V，40

33、 min），電泳后將凝膠浸泡于含有20 g/mL 溴化乙錠（EB）的TAE緩沖液中10 min后在紫外燈（216 nm）照射下進行割膠，回收片段長度在400600之間的片段。用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計算凝膠重量；加入三倍凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻75C水浴融化凝膠，每2-3min間斷混合直至凝膠塊完全融化（約6-8 min）；加入0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻；吸取混合液加入套有2 mL離心管的DNA制備管中，12,000g離心1 min，棄廢液；加入500 L Buffer W1，12,000g離心30 s，棄廢液；加入700 L

34、Buffer W2，12,000g離心30 s，棄廢液。重復此步驟一次；12,000g離心1 min；將制備管置于新的1.5 mL離心管內(nèi)，在制備膜中央加25-30 L Eluent，室溫靜置1 min。12,000g離心1 min洗脫DNA?；厥债a(chǎn)物用Nanodrop 3300測定濃度，確保樣品總量不少于100 ng。將混合樣品送至公司進行454焦磷酸測序。 數(shù)據(jù)分析使用Mothur抽提出原始數(shù)據(jù)，設定標準，去掉低質(zhì)量的測序序列。對測序結(jié)果進行分庫，確定樣品來源。對樣本總體進行Local Blast初步確定分類信息,使用Excel對結(jié)果分類計數(shù)，挑選出Malassezia，使用Otupipe

35、進行聚類分析。第三部分 結(jié)果與討論 皮膚參數(shù)分析在進行參數(shù)統(tǒng)計時，我們都將去除20%的極端值后進行。 油脂含量由于干性和潮濕部位的皮膚油脂含量低于檢測值，所以未做測量。同時嬰兒的油性部位額頭和后背的測量值也過低，不做考量。母親的樣本中，額頭油脂含量：33.221.2 au（arbitrary unit），后背油脂含量：7.05.5 au（arbitrary unit）。顯然后背的油脂含量較額頭低。在每個母親的樣本中均有體現(xiàn)（圖3.1），但每個人的油脂含量因人而異：圖3.1母親額頭和后背油脂含量變化，縱軸為油脂測定量，橫軸為樣品編號。 角質(zhì)層水含量在母親組中，油性部位（額頭和后背）含有較高角質(zhì)層

36、含水量，但潮濕部位（指縫和肘窩）的角質(zhì)層含水量并不高，與干性部位相差無幾（圖3.2）。指縫的測定值與其他部位相比較低，可能是由于指縫的接觸面積過小導致儀器的誤差較大。過去的研究中，女性角質(zhì)層含水量的分布大約在30-50 au，而在本研究中，角質(zhì)層含水量的變化范圍更高些，這可能是因為采樣的季節(jié)是夏季，人體皮膚汗腺活動旺盛，一定程度上導致了這種變化。嬰兒組各部位的角質(zhì)層含水量高于母親的對應部位。圖3.2角質(zhì)層含水量變化水分蒸發(fā)量和pH值母親各部位的水分蒸發(fā)量和pH值相對比較均衡，變化不大（表3.1）。表3.1 母親皮膚表面水分蒸發(fā)和pH值水分蒸發(fā)（au）pHGb21.39.74.30.2Ba19.

37、48.14.40.3Af17.88.04.10.1Is25.24.84.40.1Vf16.78.04.40.2Hb21.711.34.50.4二 樣品制備和測序MOBIO試劑盒利用了物理破碎的方法進行DNA提取，這種方法能夠更好地獲得拭子上的微生物。圖3.3為PCR產(chǎn)物電泳圖，圖3.4為PCR產(chǎn)物純化后電泳圖。所用Marker均為D2000，從大到小的片段長度分別為：2000,1000,750,500,250,100 bp。圖3.3圖3.4從電泳圖可以看到PCR產(chǎn)物的條帶大小在500 bp左右（圖3.3），用包含Adapter的長引物進行PCR后的產(chǎn)物中含有大量的引物二聚體。AdaA-58A2

38、R的長度為57 bp，AdaB-NSI1長度為52 bp，這對長引物在PCR的過程中可以自身互補進行擴增。再加上皮膚表面真菌含量很低，如果在開始時候就用帶有Adaptor的引物，PCR得到目的片段的效率很低，因此正式實驗采用兩輪PCR，先用NSA3/NLC2作為外引物擴增30個循環(huán)，然后用包含Adapter的AdaB-NSI1/AdaA-582R引物對上一輪PCR產(chǎn)物再擴增20個循環(huán)。第二輪PCR產(chǎn)物在純化之后，大部分引物二聚體已被去除（圖3.4），純化后的PCR產(chǎn)物得率約在90%左右。最終的膠回收可以完全去除引物片段。PCR產(chǎn)物的濃度在混樣前需測定，然后根據(jù)樣品濃度差異事先進行分組預混有利于

39、降低高通量測序時產(chǎn)生的誤差。將混合完畢的樣品送測序公司進行454測序。三 微生物群落多樣性分析對原始的測序數(shù)據(jù)，經(jīng)過最初的質(zhì)量篩選后，共得到102783條序列，長度主要分布在250-500bp之間，平均每個樣品的序列數(shù)量為527條。1 屬及屬以上分類水平上面三幅圖中出現(xiàn)的分類為含量前12名，基本大于1%，others中為含量均低于1.0%其他屬或目。在母親和嬰兒中含量最多的均為Malassezia（馬拉色菌屬），分別為69.1%和71.8%，與總樣本中70.4%含量基本一致，所以后續(xù)的分析重點就集中于馬拉色菌屬。除此外，母嬰中含量均超過1.0%的有Tremellales（8.4%，6.7%），

40、Mycosphaerellaceae（2.3%，2.7%），Saccharomycetales（1.5%，2.2%），Alternaria（2.6%，1.4%），Candida（1.5%，1.6%），Cladosporium（1.1%，1.4%），Dothioraceae（1.0%，1.1%）（括號中的百分比，前者為母親樣本中的，后者為嬰兒樣本中的）。僅在母親樣本中含量超過1.0%為Lentinula（1.7%），Rhodotorula（1.6%）。而僅在嬰兒樣品中超過1.0%的有：Cryptococcus（1.4%），Aspergillus（1.1%）。以上這些主要真菌經(jīng)雙尾t檢驗，在母嬰間

41、均無顯著性差異。2 Malassezia分布特點在不同個體間的Malassezia含量是不同的，但經(jīng)雙尾t檢驗母嬰之間并沒有顯著性差異（圖3.8）。而在不同部位間的Malassezia含量則有著顯著的不同，可以看到在油性部位的額頭（Gb）和后背(Ba)和潮濕部位的鼻孔(Na)和肘窩中(Av)中的含量均高于整體70.4%的評均值（圖3.9）。部位間的關系為：油性部位 潮濕部位 干性部位。這種分布特點符合Malassezia常出現(xiàn)在皮脂分泌旺盛的部位和具有嗜脂性的特點。在圖3.10顯示的是母嬰間不同部位Malassezia含量的變化，其中嬰兒的鼻孔（Na）位置沒有采樣所以為0?？梢钥吹侥笅胫g的結(jié)

42、果在額頭（Gb）、后背（Ba）、指縫（Is）和手背（Hb）這些位置均不同。但通過雙尾t檢驗，只在指縫部位存在極顯著性差異（p值=0.0053），而且嬰兒的指縫的Malassezia含量高于平均值，甚至高于油性部位的后背，而母親的則相反，甚至低于干性部位的前臂。這可能在于2、3個月大的嬰兒手一直包在衣服中，缺少與環(huán)境接觸和洗手的次數(shù)少，更易堆積油脂和汗水使得Malassezia大量繁衍；相對的母親的手活動頻繁接觸陽光和風也就更易顯得干燥。表3.2母嬰各部位Malassezia含量GbBaNaAvIsVfHbM010.9505 0.8451 0.9395 0.8223 0.5923 0.6146

43、0.4129 I010.9248 0.9519 0.9572 0.8993 0.8510 0.8419 M020.3220 0.9630 0.9490 0.8397 0.2099 0.7800 0.2602 I020.8637 0.7690 0.6691 0.6360 0.3958 0.3445 M030.6099 0.8254 0.6519 0.6293 0.3114 0.3080 0.2479 I030.8064 0.1723 0.0740 0.8289 0.2078 0.3925 M040.9930 0.9386 0.9322 0.5440 0.1239 0.3019 0.4543 I0

44、40.9618 0.8504 0.9806 0.6990 0.4266 0.4492 M050.6155 0.9956 0.6776 0.8747 0.7996 0.8286 0.7256 I050.9684 0.9843 0.7703 0.9732 0.7150 0.8767 總平均0.8016 0.8296 0.8300 0.7161 0.6074 0.5429 0.5006 母平均0.6982 0.9135 0.8300 0.7420 0.4074 0.5666 0.4202 嬰平均0.9050 0.7456 0.6902 0.8073 0.5193 0.5809 p值0.1347 0.

45、2686 0.7690 0.0053 0.6819 0.0915 3 Malassezia的OTU分析 我們把樣本中的所有Malassezia抽提出來，使用Otupipe軟件對其進行序列聚類，去除小于等于100條的OTU(可操作分類單位)，最后得到11個OTU。對這11個OTU的代表序列通過Local Blast和畫系統(tǒng)發(fā)育樹來確定其分類信息。圖3.11OTU1:M.obtusa,OTU2:M.furfur,OTU3:M.globosa1,OTU4:M.globosa2,OTU6:M.restricta1,OTU7:M.restricta2,OTU8:M.restricta3,OTU9:M.s

46、ympodialis。剩下的OTU5、OTU10和OTU11無法確定分類，所以后面的分析不做考慮。表3.3母嬰各部位具有的不同OTU的序列數(shù)OTU1OTU2OTU3OTU4OTU5OTU6OTU7OTU8OTU9OTU10OTU11總計M_Gb7 15 59 658 1 4265 27 6 1 13 32 5084 I_Gb22 20 108 2418 19 2251 242 34 5 57 122 5298 M_Ba2 124 56 4982 0 870 13 1 1 14 28 6091 I_Ba227 5 17 2997 1 271 9 8 100 8 16 3659 M_Na5 61

47、37 1119 3 7087 31 10 0 0 1640 9993 M_Av22 656 131 2894 4 1232 35 7 4 37 123 5145 I_Av987 9 38 2013 4 175 40 14 0 13 5 3298 M_Is23 164 42 1337 0 1301 41 19 0 1 110 3038 I_Is2020 24 70 2909 31 736 62 61 1 110 222 6246 M_Vf35 68 49 2050 9 950 44 14 0 24 161 3404 I_Vf74 26 47 1807 27 764 62 68 3 54 222

48、3154 M_Hb19 12 15 713 4 553 17 3 0 16 54 1406 I_Hb125 46 70 2340 24 1341 63 138 5 131 187 4470 總計3568 1230 739 28237 127 21796 686 383 120 478 2922 60286 我們對母嬰的每個部位的馬拉色菌種進行比較，將每個部位的五個人的平均豐度超過1.0%的定義為該部位的主要馬拉色菌種。對其中在母嬰間含量有明顯差異的主要種，我們將該種的5對母嬰數(shù)據(jù)做t檢驗，根據(jù)p值來確定這種馬拉色菌種在兩者中的分布是否存在顯著的差異。母親額頭部位的主要馬拉色菌種有globosa

49、1(2.0%), globosa2(25.7%), restricta1(68.2%)。嬰兒額頭部位的主要馬拉色菌種有globosa1(1.5%), globosa2(42.0%), restricta1(46.8%)， restricta2（3.8%）。其豐度均沒有存在顯著性差異。母親后背部位的主要馬拉色菌種有furfur(3.2%), globosa1(1.4%), globosa2(82.6%), restricta1(11.5%)。嬰兒額頭部位的主要馬拉色菌種有obtusa(7.6%), globosa2(73.0%), restricta1(13.2%)， sympodialis（3

50、.1%）。其豐度均沒有存在顯著性差異。母親肘窩部位的主要馬拉色菌種有furfur(9.8%), globosa1(2.0%), globosa2(59.7%), restricta1(23.4%)。嬰兒額頭部位的主要馬拉色菌種有obtusa(20.4%), globosa1(1.1%), globosa2(55.5%), restricta1(14.2%)， restricta2（7.5%）。其豐度均沒有存在顯著性差異。母親指縫部位的主要馬拉色菌種有furfur(4.1%), globosa1(1.2%), globosa2(34.6%), restricta1(48.7%), restric

51、ta2(2.6%)。嬰兒額頭部位的主要馬拉色菌種有obtusa(16.3%), globosa1(1.0%), globosa2(57.6%), restricta1(15.0%)， restricta2（1.3%）， restricta3（1.7%）。其豐度均沒有存在顯著性差異。母親前臂部位的主要馬拉色菌種有globosa2(45.7%), restricta1(40.2%), restricta2(1.6%)。嬰兒額頭部位的主要馬拉色菌種有obtusa(2.0%), globosa2(54.8%), restricta1(26.6%)， restricta2（1.6%）， restrict

52、a3（2.2%）。其豐度均沒有存在顯著性差異。母親手背部位的主要馬拉色菌種有obtusa(1.4%), globosa2(46.0%), restricta1(44.1%), restricta2(1.5%)。嬰兒額頭部位的主要馬拉色菌種有obtusa(2.4%), globosa2(47.8%), restricta1(32.9%)， restricta2（1.4%）， restricta3（4.6%）。其豐度均沒有存在顯著性差異。母親鼻孔部位的主要馬拉色菌種有globosa2(12.4%), restricta1(70.1%)。 從圖3.12可以看到，OTU4和OTU6在各部位間占了絕大部

53、分含量。通過對各部位間OTU4和OTU6的兩兩t檢驗（不考慮鼻孔，因為只有母親的五組數(shù)據(jù)），發(fā)現(xiàn)OTU4在后背（Ba）的分布和其他部位均有顯著性差異(其與Gb,Av,Is,Vf,Hb的p值依次為0.0049,0.0173,0.0055,0.0292,0.0054)，而OTU6在額頭（Gb）的分布和其他部位有顯著性差異（其與Ba,Av,Is,Vf,Hb的p值依次為0.0027,0.0033,0.0288,0.0210,0.0343）。第五部分 實驗總結(jié)本實驗使用高通量測序，通過大樣本量和測序量獲得大量數(shù)據(jù)，并用統(tǒng)計學方法研究了嬰兒和母親不同部位馬拉色菌的分布特點。出生2-4個月的嬰兒皮膚上還沒有

54、開始分泌油脂，角質(zhì)層含水量較高；母親的額頭和背部油脂分泌比較旺盛，Malassezia在這兩個部位的含量較高，驗證了它和油脂分泌的相關性很大的特點。母嬰間在指縫部位的Malassezia含量有極顯著性差異。母嬰皮膚表面除了近70%為馬拉色菌外，還存在著其他真菌，其中豐度最高的是銀耳目（8.4%，6.7%）。沒有發(fā)現(xiàn)母嬰間不同部位的馬拉色菌分布多樣性的相關性，不同種馬拉色菌在不同對母嬰樣本中分布各有不同?？偟膩碚f，母嬰皮膚上主要的馬拉色菌為M.globosa和M.restricta，二者分別在后背與額頭的分布與其他部位有顯著性差異。這次實驗是皮膚微生物課題組的一部分，由于時間原因還有一部分的真菌數(shù)據(jù)沒有拿到。在樣本量增加后希望能夠得到更多有價值的結(jié)論。 致謝首先要感謝我的導師全哲學老師對這個課題的指導，全老師在本課題的立意，實驗設計，樣品處理和數(shù)據(jù)分析中都給予我很大幫助，每每在我遇到困難時都給予我建議，為我指明了方向。更重要的是，全老師讓我明白了作為一個科研工作者所應具備的素質(zhì)和態(tài)度。感謝實驗室的曾丹寧師姐和遲亮師兄。那些我們一起在這個大課題下奮斗的日子，那些一起在崇明提DNA的日子，