原位分子雜交組織化學

1、關于原位分子雜交組織化學第1頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四一、概念 用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織、細胞中待測的核酸按堿基配對的原則進行特異性結合，形成雜交體，然后再用與標記物對應的檢測系統(tǒng)，通過組織化學或免疫組織化學方法在核酸原有位置進行細胞內定位。第2頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四二、原位雜交的基本原理第3頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四三、原位雜交組織化學技術的應用1.細胞特異性mRNA轉錄的定位；2.癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉錄水平的表達及其變化的研究； 3.病原微生物檢測；4. 基因在染色

2、體上的定位；5. 檢測染色體的變化；6. 分裂間期細胞遺傳學的研究。第4頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四四、核酸探針的種類根據(jù)探針的核酸性質不同 DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針、寡核苷酸探針根據(jù)探針的標記方法不同 放射性探針：32P、3H、35S 非放射性探針：生物素標記 地高辛標記 熒光標記第5頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四 DNA探針1. 克隆在質粒載體中，可以無限增殖，制備簡便。2. 不易降解。標記的方法較成熟多樣（切口平移等） cDNA 探針1. 互補于 mRNA 的DNA 分子。2. 逆轉錄合成，不含內含子序列，適

3、宜基因表達的檢測。單鏈比雙鏈靈敏度高，且不需變性，使能與靶mRNA結合的探針濃度提高。第6頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四cRNA探針單鏈分子，雜交反應效率高。可控制轉錄方向，得到同義RNA 探針（與mRNA同序列），或反義RNA 探針（cRNA，與mRNA 互補）?？蓹z測DNA 和mRNA，還可觀察基因的轉錄狀況。易于降解，標記方法復雜。寡核苷酸探針鏈短、分子量小、序列復雜度低，雜交時間比克隆探針短?？勺R別靶序列中一個堿基的變化，故成套探針用于堿基點突變的檢測。一次可大量合成，價格低廉，易于標記。缺點：與克隆探針比較，特異性差，雜交信號弱。第7頁，共29頁，2022年

4、，5月20日，2點34分，星期四設計篩選寡核苷酸探針的原則長30-50bp，長探針則雜交時間長，短則特異性差。堿基成分：GC含量為 40%-60%。探針分子內不能有互補區(qū)。第8頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四探針種類 優(yōu)點 缺點 cDNA 1.制備簡單 2.放射比活性高 3.信號特異性強 4.雜交體較穩(wěn)定 1.變性后才能使用 2.要基因克隆 3.組織穿透力差 4.易于退火 cRNA 1.信號特異性強 2.不需變性 3.雜交后可用RNase除去 未雜交的探針 4.雜交體非常穩(wěn)定 5.不會退火 1. 易被Rnase降解 2. 易吸附于器皿上 3. 組織穿透力差 4.需做亞克

5、隆寡聚核苷酸 1.易制備 2.使用方便 3.組織穿透力強 4.不需做克隆 5.不會退火 6.只要知道氨基酸順序便 可制備探針 1.需核酸合成儀 2.需明確mRNA順序 3.單堿基錯誤將影響雜交 4.雜交體不太穩(wěn)定 第9頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四五.探針標記 探針的標記物分為放射性標記和非放射性標記兩大類： 放射性標記物一般為125I 、35S或32P； 非放射性標記有生物素或地高辛的間接標記，也有FITC或者羅丹明對探針分子的直接標記。 第10頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四探針標記方法比較敏感性：放射性探針地高辛探針生物素探針對人危害性：

6、放射性探針、生物素探針放射性探針受半衰期限制，不可長期保存。生物素探針受內源性生物素影響，可致假陽性；地高辛探針則顯色復雜。 第11頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四探針標記方法 探針標記方法很多，大致分為： 引入法和化學修飾法。 *引入法：運用標記好的核苷酸來合成探針； *化學修飾法：采用化學方法將標記物摻入已合成的探針分子中去，或改變探針原有的結構，使之產(chǎn)生特定的化學基團。第12頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四引入法較化學修飾法更常用，按其整合的方法不同，引入法分為： *缺口平移法 *隨機引物法 *末端標記法 *PCR擴增標記法 *RNA體外轉

7、錄法第13頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四缺口平移法 原理：利用DNA酶I在雙鏈DNA的各股單鏈的不同位 置上造成隨機切口，再利用大腸桿菌DNA聚合酶進 行53修復，將已標記dNTP 摻入到新合成的DNA 鏈中。第14頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四隨機引物法原理：將長6個核苷酸的寡核苷酸片段（隨機引物）與 單鏈DNA或變性的雙鏈DNA隨機互補結合（退火），在 引物的3羥基末端逐個加上核苷酸直至下一個引物， 即形成標記的DNA探針。 第15頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四 末端標記法 原理：將標記物導入線性DNA或RNA的

8、5端或3端的一類 標記方法。主要分為： 5末端標記法，3末端標記 法，T4聚合酶替代法。第16頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四五、ISHH基本程序（以檢測組織細胞內的mRNA為例）(一）雜交前處理玻片預處理（滅活Rnase)切片處理（增強組織通透性和探針穿透性）第17頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四 1.玻片預處理（滅活Rnase) 玻片置于熱肥皂水浸泡4小時以上 自來水 清洗干凈置于酸缸中浸泡過夜 清水洗凈烘 干 烘箱溫度最好在150或以上烤干4小時 以上。以去除任何RNA酶.蓋玻片在有條件時 最好用硅化處理,錫箔紙包裹無塵存放. 粘附劑:常用

9、的粘附劑多聚賴氨酸溶液。第18頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四 2 .切片處理：增強組織通透性和探針穿透性1）充分脫蠟2）防止探針與組織中堿性蛋白靜電結合，降低背景稀酸處理（0.2 mol/l HCL 10min）乙?；?.25%乙酸酐10min）第19頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四3）去污劑：增加組織通透性，利于探針進入 0.01%-0.3% Triton X-100 15min4）酶消化：使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露 蛋白酶K、鏈酶蛋白酶、胃蛋白酶 1ug/ml蛋白酶K ，37，15-30min 5）雜交緩沖液孵育：阻斷非特異性結合位點第

10、20頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四 3.防止RNA酶的污染由于在手指皮膚及實驗用玻璃皿上均可能有RNA酶,為防止其污染影響實驗結果,在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套.所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫(160)烘烤以達到消除RNA酶的目的.要破壞RNA酶,其最低溫度必需在150左右. 第21頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四（二） 雜交反應： 將雜交液滴于經(jīng)預雜交處理的組織細胞切片上，加蓋硅化的蓋玻片，按所要求的溫度進行的孵化。第22頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四 雜交液 1）一定濃度的探針2）高濃度Na+

11、:使雜交率增加，減少靜電結合3）硫酸葡聚糖：10%硫酸葡聚糖，形成探針混合液基質， 對DNA有濃縮作用，可提高雜交的反應速度10倍以上， 但不影響探針的洗脫強度；雜交時常用濃度為5% 10%，但濃度高時會使溶液的粘度增大，不利雜交探 針的滲透。4）牛血清白蛋白、載體DNA或RNA：阻斷非特異 性結合，降低背景。第23頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四 探針濃度： 以最低濃度達到與靶核酸的最大飽和結合度 0.5-5.0ug/ml，10-20ul/片 雜交時間： 一般為1620小時 雜交嚴格度： 反應體系中避免非同源性或只有部分同源性的核酸順序形成雜交復合物的條件。 低雜交溫

12、度、低甲酰胺的濃度、高離子強度條件下，嚴格度低，反之嚴格度高。嚴格度愈高，雜交反應特異性愈強，但敏感性愈低。第24頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四 (三）雜交后處理 目的：除去未參與雜交體形成的過余探針，除去探針與組織標本之間的非特異性結合，降低背景，有利于信號的檢測。鹽溶液洗滌：鹽濃度由高至低 溫度 由低至高高濃度的鹽可減少探針與組織標本間的靜電結合。洗滌過程中至少有一次高嚴格度條件下的洗滌，即低鹽、高溫、高甲酰胺第25頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四 (四）雜交顯示 放射自顯影 酶檢測系統(tǒng)（HRP、AP） 第26頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四第27頁，共29頁，2022年，5月20日，2點34分，星期四 (五）對照實驗和結果判斷