酶免疫檢驗專題知識講座培訓(xùn)課件

1、酶免疫檢驗專題知識講座酶免疫檢驗專題知識講座基本概念一、免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫的概念免疫標(biāo)記技術(shù)：標(biāo)記物與免疫活性物質(zhì)的聯(lián)接技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)：以標(biāo)記免疫物質(zhì)檢測相應(yīng)靶物質(zhì)的技術(shù)標(biāo)記的目的.?2酶免疫檢驗專題知識講座基本概念一、免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫的概念標(biāo)記的目的.?2酶免二、常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)類別 標(biāo)記物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定化學(xué)發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免

2、疫分析測定 3酶免疫檢驗專題知識講座二、常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)類別 酶標(biāo)儀4酶免疫檢驗專題知識講座酶標(biāo)儀4酶免疫檢驗專題知識講座熒光顯微鏡5酶免疫檢驗專題知識講座熒光顯微鏡5酶免疫檢驗專題知識講座FCM檢測分析細(xì)胞表面受體的表達(dá)6酶免疫檢驗專題知識講座FCM檢測分析細(xì)胞表面受體的表達(dá)6酶免疫檢驗專題知識講座液閃儀計數(shù)器7酶免疫檢驗專題知識講座液閃儀計數(shù)器7酶免疫檢驗專題知識講座金 免 疫 技 術(shù)8酶免疫檢驗專題知識講座金 免 疫 技 術(shù)8酶免疫檢驗專題知識講座吸水紙吸水紙金標(biāo)抗體包被抗體抗金標(biāo)抗體9酶免疫檢驗專題知識講座吸水紙吸水紙金標(biāo)抗體包被抗體抗金標(biāo)抗體9酶免疫檢驗專題知識講化學(xué)發(fā)光免疫分析技

3、術(shù) 化學(xué)發(fā)光酶免疫測定：測定過程與傳統(tǒng)ELISA相似，僅最后一步酶反應(yīng)所 用底物為發(fā)光劑（魯米諾-過氧化氫發(fā)光體系）10酶免疫檢驗專題知識講座化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 化學(xué)發(fā)光酶免疫測定：測定過程標(biāo)記免疫技術(shù)的分類一、按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型二、按測定方式劃分的類型三、按測定用途劃分的類型11酶免疫檢驗專題知識講座標(biāo)記免疫技術(shù)的分類一、按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型11酶免疫檢驗1、酶免疫技術(shù)2、熒光免疫技術(shù)3、放射免疫技術(shù)4、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)5、金免疫技術(shù)按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型12酶免疫檢驗專題知識講座1、酶免疫技術(shù)按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型12酶免疫檢驗專題知識1、均相型（homogenous）

4、2、非均相型（異相型 heterogeneous）按測定方式劃分的類型13酶免疫檢驗專題知識講座1、均相型（homogenous）按測定方式劃分的類型13酶均相型（homogenous）反應(yīng)完成后，不用分離結(jié)合與游離的標(biāo)記物非均相型（異相型heterogeneous）反應(yīng)完成后，要分離結(jié)合與游離的標(biāo)記物。又可分為液相異相免疫測定和固相異相免疫測定14酶免疫檢驗專題知識講座均相型（homogenous）非均相型（異相型heterog1、免疫測定技術(shù)2、免疫組化技術(shù)按測定用途劃分的類型15酶免疫檢驗專題知識講座1、免疫測定技術(shù)按測定用途劃分的類型15酶免疫檢驗專題知識講第八章 酶免疫技術(shù)16酶免疫

5、檢驗專題知識講座第八章 酶免疫技術(shù)16酶免疫檢驗專題知識講座本章要求熟悉酶免疫技術(shù)的分類及原理；掌握ELISA的方法類型及各方法的原理；測定方法的標(biāo)準(zhǔn)化；熟悉酶免疫組織化學(xué)技術(shù)的原理；了解各類酶免疫組織化學(xué)技術(shù)；熟悉免疫印跡法的原理。17酶免疫檢驗專題知識講座本章要求熟悉酶免疫技術(shù)的分類及原理；17酶免疫檢驗專題知識講酶免疫技術(shù)的基本原理酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記抗原或酶標(biāo)記抗體為主要試劑，通過復(fù)合物中的酶催化底物呈色而對被測物進(jìn)行定性或定量的標(biāo)記免疫技術(shù)。 18酶免疫檢驗專題知識講座酶免疫技術(shù)的基本原理酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記抗原或酶在免疫組化染色時可指示待測反應(yīng)物的存在和定位，在酶免疫測定中，則可根

6、據(jù)呈色物的有無和呈色深淺作定性或定量觀察。由于此技術(shù)是建立在抗原抗體反應(yīng)和酶的高效催化作用的基礎(chǔ)上，故而該技術(shù)具有檢測靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確性好等特點，而且，可與其他技術(shù)偶聯(lián)而衍生出適用范圍更廣的新方法。 19酶免疫檢驗專題知識講座在免疫組化染色時可指示待測反應(yīng)物的存在和定位，在酶 酶免疫技術(shù)的分類 按檢測對象的不同一般分為兩類 1.酶免疫組織化學(xué)技術(shù) 用于檢測組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原或抗體。可指示待測反應(yīng)物的存在和定位。2.酶免疫測定技術(shù) 用于檢測液體樣本中可溶性抗原或抗體。 根據(jù)呈色物的有無和呈色深淺作定性或定量觀察。20酶免疫檢驗專題知識講座 酶免疫技術(shù)的分類 按檢測對象的不同一般分

7、為兩21酶免疫檢驗專題知識講座21酶免疫檢驗專題知識講座酶免疫技術(shù)的分類 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的和游離的酶標(biāo)記物，可分為： 1. 均相法：不需要分離結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物，直接進(jìn)行測定。 2. 異相法：需要分離結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物后才能進(jìn)行測定。 固相酶免疫：ELISA 液相酶免疫22酶免疫檢驗專題知識講座酶免疫技術(shù)的分類 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)基本原理 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，且既保留其免疫活性又保留

8、酶的活性。 標(biāo)本中的抗原或抗體、標(biāo)記抗原或抗體能按一定的次序與固相載體表面的抗體或抗原反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開。最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。 加入酶底物，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺對標(biāo)本中的抗原或抗體定性或定量分析。23酶免疫檢驗專題知識講座酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunos 24酶免疫檢驗專題知識講座 24酶免疫檢驗專題知識講座方法類型及基本原理ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。雙抗體夾心法 雙位點一步法間接法 競爭法 捕獲法

9、 雙抗原夾心法中和法25酶免疫檢驗專題知識講座方法類型及基本原理ELISA可用于測定抗原，也可用于測定一、雙抗體夾心法屬于非競爭結(jié)合測定。它是檢測抗原最常用的ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測。 用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對于待測抗原是過量的,因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量。26酶免疫檢驗專題知識講座一、雙抗體夾心

10、法屬于非競爭結(jié)合測定。它是檢測抗原最常用（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。（2）加受檢標(biāo)本：讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。（3）加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。（4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。27酶免疫檢驗專題知識講座（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)（二）雙位點一步法屬

11、于雙抗體夾心法測定抗原；應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體；標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。但要注意防止鉤狀效應(yīng)。28酶免疫檢驗專題知識講座（二）雙位點一步法屬于雙抗體夾心法測定抗原；28酶免疫檢驗專（三） 雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。形成“抗原-抗體-酶標(biāo)記抗原”復(fù)合物29酶免疫檢驗專題知識講座（三） 雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物四、間接法此法是測定抗體最常

12、用的方法,屬非競爭結(jié)合試驗。 基本原理:將抗原連接到固相載體上，樣品中待測抗體與之結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗(針對受檢抗體的抗體，如羊抗人IgG抗體)與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，測定加底物后的顯色程度，確定待測抗體含量。30酶免疫檢驗專題知識講座四、間接法此法是測定抗體最常用的方法,屬非競爭結(jié)合試驗。 3特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合抗原及雜質(zhì)；加待測血清，血清中若有相應(yīng)的抗體則與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌后，固相載體上僅剩下特異性抗體。其他免疫球蛋白及雜質(zhì)不能與固相抗原結(jié)合被去除；加酶標(biāo)抗免疫

13、球蛋白（酶標(biāo)抗抗體）與固相復(fù)合物中的抗體相結(jié)合。洗滌后，固相載體上的酶量與待測血清中特異性抗體的量相關(guān)。若欲測人對某種病原微生物的抗體，可用酶標(biāo)記羊抗人IgG抗體；加入底物顯色，顏色深淺代表樣本中待測抗體量。 31酶免疫檢驗專題知識講座特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合抗原五、競爭法 方法和特點: 酶標(biāo)記抗原（抗體）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記抗原或抗體具有相同的與固相抗體（抗原）結(jié)合的能力； 測定管中加入待測樣本與一定量酶標(biāo)抗原（抗體）的混合溶液，使兩者競爭性的與固相抗體（抗原）反應(yīng)； 免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相載體上復(fù)合物中被測定的酶標(biāo)抗原（抗體）的量（酶活性）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中

14、非標(biāo)記抗原（抗體）的濃度成反比。 可用于測定抗原，也可用于測定抗體。32酶免疫檢驗專題知識講座五、競爭法 方法和特點: 32酶免疫檢驗專題知識講座33酶免疫檢驗專題知識講座33酶免疫檢驗專題知識講座六、捕獲法測IgM抗體 先將針對IgM的第二抗體連接于固相載體，用以結(jié)合（“捕獲”）樣品中所有IgM（特異或非特異），洗滌除去IgG等無關(guān)物質(zhì)，然后加入特異抗原與待檢IgM結(jié)合；再加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物作用顯色后，即可對樣品中待檢IgM是否存在及其含量進(jìn)行測定。 34酶免疫檢驗專題知識講座六、捕獲法測IgM抗體 先將針對IgM的第二抗體連接于

15、固相載抗-鏈（或抗-IgM抗體）包被在固相上，形成固相抗-鏈（或抗-IgM抗體），洗滌；加入稀釋待測樣本，樣本中所有的IgM與抗-鏈結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)；加入特異性抗原，它只與固相上特異性的IgM結(jié)合。洗滌；加入針對特異性抗原的酶標(biāo)抗體，使之與結(jié)合在固相上抗原結(jié)合，洗滌；加底物顯色，若有顏色顯示，則表示待測樣本中有特異性的IgM抗體存在。35酶免疫檢驗專題知識講座抗-鏈（或抗-IgM抗體）包被在固相上，形成固相抗-鏈七、中和法常用于已知中和抗原檢測樣本中的未知抗體。在固相上包被已知抗體，當(dāng)檢測樣本中含有待測抗體時，與反應(yīng)體系中加入的中和抗原結(jié)合，反應(yīng)過程不能形成“抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體”復(fù)

16、合物，加入底物不顯色，實驗結(jié)果判為陽性；當(dāng)檢測樣本中無待測抗體時，加入的中和抗原則與固相抗體結(jié)合，形成“抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體”免疫復(fù)合物，加入底物顯色，實驗結(jié)果判為陰性。36酶免疫檢驗專題知識講座七、中和法36酶免疫檢驗專題知識講座固相酶免疫測定的技術(shù)要點ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液37酶免疫檢驗專題知識講座固相酶免疫測定的技術(shù)要點ELISA中有三個必要的試劑：

17、免疫吸試劑的準(zhǔn)備固相載體：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯吸附蛋白質(zhì)的能力較強，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上并保留原來的免疫活性。載體的性狀主要有三種：小試管、小珠和微量ELISA板。抗原和抗體：所用抗原要求純度高，抗體效價高，結(jié)合力強。酶和底物： ELISA中最常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶38酶免疫檢驗專題知識講座試劑的準(zhǔn)備固相載體：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯吸附蛋白質(zhì)的酶和酶作用底物要求活性高 有可結(jié)合的基團(tuán)，不影響抗原抗體的免疫活性 反應(yīng)產(chǎn)物易于判定或測量，方法簡單,敏感,重復(fù)性好 酶活性不受樣品中其他成分的影響,在均相酶免疫測定抗原抗體反應(yīng)后酶活性可被抑制或激活 本身及產(chǎn)物無危害,性

18、質(zhì)穩(wěn)定,價廉易得 39酶免疫檢驗專題知識講座酶和酶作用底物要求活性高 39酶免疫檢驗專題知識講座常用酶及酶的底物DH2 + H2O2 D + 2H2O 底物 受氫體 E 有色物質(zhì) 辣根過氧化物酶 (HRP) 鄰苯二胺(OPD) 靈敏度高,比色方便，穩(wěn)定性差,避光,致癌 四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 穩(wěn)定性好,無致突變作用，水溶性差堿性磷酸酯酶 (AP) 底物: 對硝基苯磷酸酯（p-NPP） 產(chǎn)物: 黃色的對硝基酚-半乳糖苷酶 (-Gal)底物: 4-甲基傘酮基-D-半乳糖苷(4MuG) 產(chǎn)物: 4-甲基傘形酮(熒光計測量)40酶免疫檢驗專題知識講座常用酶及酶的底物DH2 + H2O2 酶 底物 顯色

19、反應(yīng) 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺 橙黃色 492 四甲基聯(lián)苯胺 黃色 450 氨基水楊酸 棕色 550 2,2-氨基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽藍(lán)綠色 642 堿性磷酸酯酶 對硝基苯磷酸酯（p-NPP）黃色 405 -半乳糖苷酶 4-甲基傘酮基-D-半乳糖苷熒光 360,450 41酶免疫檢驗專題知識講座酶 底物 顯色反應(yīng) 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺 橙黃常用酶 底物 加終止液前顏色 加終止液后顏色 辣根過氧化物酶（HRP） 鄰苯二胺（OPD） 橙黃色 棕黃色 RZ3.1 四甲基聯(lián)苯胺（TMB） 藍(lán)色 黃色 堿性磷酸酶（AP） 對硝基苯磷酸酯（p-NPP） 黃色 黃色

20、 42酶免疫檢驗專題知識講座常用酶 底物 加終止液前顏色 加終止液后顏色 辣根過氧化物酶43酶免疫檢驗專題知識講座43酶免疫檢驗專題知識講座交聯(lián)法 交聯(lián)法是以一可同時與酶和抗體（抗原）結(jié)合的交聯(lián)劑作為“橋”，分別連接酶與抗體（抗原）的方法，此類方法中目前最常用的是戊二醛交聯(lián)法，形成的結(jié)合物為： 酶-1-戊二醛-2-抗體（抗原） 1=2 同源雙功能交聯(lián)劑 戊二醛 1=2 異源雙功能交聯(lián)劑 羥琥珀亞胺酯 戊二醛易揮發(fā)，久置可發(fā)生聚合和氧化，降低交聯(lián)作用。由于戊二醛單體的光吸收峰是280nm，而聚合體則在235nm，故新鮮的，保存得法的戊二醛其A235/A280nm的比值小于3。戊二醛應(yīng)避光.低溫保

21、存。 44酶免疫檢驗專題知識講座交聯(lián)法 44酶免疫檢驗專題知識講座直接法 直接法是用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團(tuán)直接可與抗體（抗原）結(jié)合形成標(biāo)記物，如過碘酸鈉法。形成的結(jié)合物為：酶-抗體（抗原）。 45酶免疫檢驗專題知識講座直接法 45酶免疫檢驗專題知識講座測定方法的標(biāo)準(zhǔn)化包被+封閉加樣洗滌孵育終止反應(yīng)結(jié)果的判定46酶免疫檢驗專題知識講座測定方法的標(biāo)準(zhǔn)化包被+封閉46酶免疫檢驗專題知識講座包被將抗原或抗體固定在固相載體的過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非

22、特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。47酶免疫檢驗專題知識講座包被將抗原或抗體固定在固相載體的過程稱為包被(coating包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。包被用抗體IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能

23、用于ELISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。48酶免疫檢驗專題知識講座包被用抗原：48酶免疫檢驗專題知識講座酶免疫檢驗專題知識講座培訓(xùn)課件封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA; 200l/孔10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。 50酶免疫檢驗專題知識講座封閉封閉(blockin

24、g)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白（二）加樣 定量測定加樣量應(yīng)力求準(zhǔn)確，加樣時應(yīng)將液體加在孔底，力求不產(chǎn)生氣泡。樣本和結(jié)合物的稀釋應(yīng)按規(guī)定配制。 一般100l/孔（三）洗滌 洗滌是決定實驗成敗的關(guān)鍵。其目的是洗去沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。 Tween 20在ELISA中最為常用，洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結(jié)合的作用。常用PBS- Tween 20。 洗滌步驟51酶免疫檢驗專題知識講座（二）加樣51酶免疫檢驗專題知識講座孵育 (incubation) 抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為孵育 加樣品后、加結(jié)合物后都要孵育 孵育常采用的溫

25、度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 一般孵育30-60min，溫度低，時間可延長。52酶免疫檢驗專題知識講座孵育 (incubation) 抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程終止反應(yīng)硫酸 檸檬酸 氫氧化鈉 不同的底物有不同的終止劑 53酶免疫檢驗專題知識講座終止反應(yīng)硫酸 53酶免疫檢驗專題知識講座（五）結(jié)果的判定 分光光度計檢測結(jié)果可簡單地用吸光度值（A）表示，并且根據(jù)每次試驗所用的陰性和陽性樣本確定標(biāo)準(zhǔn)。一般以A/A02.1（A：樣本吸光度值，A0：陰性對照吸光度值）表示，但陰性對照吸光度值必須大于0.05（最理想的是0.1），若

26、低于0.05，則以陰性對照吸光度值加0.05為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，這種結(jié)果判定方式目前最常用。用標(biāo)準(zhǔn)抗原或抗體做一系列稀釋度檢測，將測定的A值繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線，可對樣品中抗原或抗體定量。用肉眼判斷結(jié)果時，所用的底物必須顯示較深的顏色。肉眼觀察只能判斷陽性和陰性（如+、+、+、+/、）。54酶免疫檢驗專題知識講座（五）結(jié)果的判定 分光光度計檢測結(jié)果可簡單地用吸光度值（A）55酶免疫檢驗專題知識講座55酶免疫檢驗專題知識講座酶免疫組織化學(xué)技術(shù)（EIHCT ）是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體(抗原)與組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原(抗體)發(fā)生反應(yīng)。如組織或細(xì)胞中含有相應(yīng)抗原(抗體)，二者結(jié)合形成的抗原抗體復(fù)合物中所帶酶分

27、子遇到底物時，催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，在光鏡和電鏡下，就可識別出標(biāo)本中抗原(抗體)的分布位置和性質(zhì)；經(jīng)圖像分析也可達(dá)到定量的目的。EIHCT主要用于標(biāo)本中抗原(抗體)的定位和定性檢測，常用的標(biāo)本有組織切片、組織印片和細(xì)胞涂片等，最常用的酶是HRP，供氫體是DAB。與熒光免疫技術(shù)相比，EIHCT具有染色標(biāo)本可長期保存。可用普通光鏡和電鏡觀察結(jié)果。EIHCT可分為酶標(biāo)記抗體免疫組化技術(shù)、非標(biāo)記抗體酶免疫組化技術(shù)和酶免疫電鏡技術(shù)三種類型。 56酶免疫檢驗專題知識講座酶免疫組織化學(xué)技術(shù)（EIHCT ）是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗57酶免疫檢驗專題知識講座57酶免疫檢驗專題知識講座標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)技術(shù)1

28、、直接法 用酶標(biāo)抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)，形成抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加底物顯色，鏡檢。其技術(shù)要點：標(biāo)本用0.3%H2O2和80%甲醇液處理15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，石蠟切片需常規(guī)脫蠟，用胰酶37消化，PBS洗滌；用10%牛血清白蛋白封閉15 min，即制得抗原片；加酶標(biāo)記抗體，濕盒37溫育30 min或4過夜，PBS洗滌；加底物顯色，光鏡下觀察結(jié)果。該法具有操作簡便、快速、特異性強、非特異顯色低的優(yōu)點，但一種酶標(biāo)抗體只能檢測一種特異性抗原，敏感性較低。2、間接法 用已知抗體（Abl）與標(biāo)本中相應(yīng)抗原（Ag）反應(yīng)，形成Ag-Abl復(fù)合物，加酶標(biāo)記抗抗體（Ab2-E）反應(yīng)，形成Ag

29、-Abl-Ab2-E復(fù)合物，加底物顯色，鏡檢。其技術(shù)要點：按直接法制備抗原片，加Abl（如鼠抗X），濕盒37溫育30 min，PBS洗去未結(jié)合Abl；加酶標(biāo)記抗抗體（如羊抗鼠Ig），濕盒37溫育30 min，PBS洗滌；加底物顯色，光鏡下觀察結(jié)果。間接法用一種酶標(biāo)記抗抗體與多種特異性抗體結(jié)合，可檢測多種抗原，實用性與敏感性均較直接法好。58酶免疫檢驗專題知識講座標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)技術(shù)1、直接法 58酶免疫檢驗專題知識非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)技術(shù)原理酶標(biāo)記抗體的方法，由于酶與抗體共價連接，抗體和酶的活性均受到一定的損害，若非特異性抗體同時被標(biāo)記，將出現(xiàn)非特異性著色。非標(biāo)記抗體酶法，是先用酶免疫動物，制備高效價、特異性的抗酶抗體，將酶與抗酶抗體結(jié)合形成復(fù)合物，然后利用第二抗體（Ab2）作橋，與抗酶抗體和組織抗原上的抗體（Ab1）結(jié)合，通過酶底物的顯色反