KRAS和EGFR檢測與臨床應(yīng)用課件

1、和檢測與臨床應(yīng)用和檢測與臨床應(yīng)用匯報內(nèi)容和的簡介及臨床意義的基本原理和技術(shù)特點等位特異性引物設(shè)計試劑盒開發(fā)簡介匯報內(nèi)容和的簡介及臨床意義和的簡介及臨床意義和的簡介及臨床意義背景是一種原癌基因，長約35，位于12號染色體，是基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與3K、和、信號通路的調(diào)控；在通路中位于上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致的活化和通路中信號傳導(dǎo)；是許多惡性腫瘤的常見突變基因：胰腺癌（6590%）、結(jié)直腸癌（40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。背景是一種原癌基因，長約35，位于12號染色體，是基因家族成基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從抗

2、體（西妥昔單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；突變型患者對西妥昔單抗無應(yīng)答，其總體生存期明顯低于野生型患者 , 2008, N J 基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能結(jié)直腸癌患者檢測突變相關(guān)指南歐洲藥品評估局（，2008）指出：野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國臨床腫瘤學(xué)會（，2009）推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測突變，如有12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行單克隆抗體治療；美國指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測基因的基因型；2012年7月6日批準(zhǔn)第一個用于結(jié)直腸癌的基因檢

3、測（），以判斷西妥昔單抗是否有效；美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（，2014）指南說：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行突變檢測（和），至少應(yīng)檢測第二外顯子的突變情況?；蛲蛔冃偷牟∪瞬粦?yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版） 。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗、帕尼單抗時，必須檢測腫瘤組織的基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測腫瘤 基因狀態(tài)，不推薦作為常規(guī)檢查項目。結(jié)直腸癌患者檢測突變相關(guān)指南歐洲藥品評估局（，2008）指出基因突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（，

4、如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗； 突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示） , 2011, . . , 2005, J 基因突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者非小細(xì)胞肺癌患者檢測突變相關(guān)指南美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（，2009）指出，突變與非小細(xì)胞肺癌患者抵抗有關(guān)，基因測序有助于確定哪些病人適合治療。當(dāng)基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。非小細(xì)胞肺癌患者檢測突變相關(guān)指南美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（，20主要突變位點在結(jié)直腸癌中，突變主要發(fā)生于12 (80%)、13 (15-20%

5、)、61和146 (C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746750(1)192235-2249156223E746750(2)192236-2250156225L747753S192240-22571812370E746750I192235-2252()13551E746750192235-22531812728E746750A192237-2251 1512678E746752A192237-2254 1812367E746752V192237-2250 T()12384E746752D192238-2255 186220L747750P1922

6、38-2248 ()12422L747751Q192238-2252 ()12419L747749192239-224796218L747751192239-2253156254L747752192239-2256186255L747750P192239-2248 C12382L747753Q192239-2258()12387L747751S192240-2251126210L747751192240-22541512369L747751P192239-2251 C()12383T790M202369C T6240S768I202303GT6241V769770202307-2308 123

7、76H773774202319-2320 12377D770771202310-2311 12378L858R212573TG6224L861Q212582TA6213突變位點（常規(guī)檢測29個）突變外顯子堿基變化 G719A18突變與藥物療效關(guān)系所在外顯子突變類型與療效關(guān)系18G719A()3種點突變藥敏突變1919種缺失突變藥敏突變20點突變S768I藥敏突變20點突變T790M耐藥突變*203種插入突變耐藥突變*21點突變L858R藥敏突變21點突變L861Q藥敏突變突變與藥物療效關(guān)系所在外顯子突變類型與療效關(guān)系18G719A 試劑盒突變結(jié)果檢測組別突變類型所占比例對吉非替尼敏感性證據(jù) 1

8、 19 ; L858R 90%充分2T790; T790858R; G719X; L861Q; S768I 7%有限3T790M ; 20 ; 3%無 試劑盒突變結(jié)果檢測組別突變類型所占比例對吉非替尼敏感性證據(jù)的基本原理和技術(shù)特點的基本原理和技術(shù)特點原理是 (擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng))的縮寫。根據(jù) 過程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補配對來實現(xiàn)對突變位點的檢測, 當(dāng)引物 3 末端出現(xiàn)錯配時, 產(chǎn)物將不能延伸。因此設(shè)計兩條上游（或下游）引物，使其3末端分別與突變位點堿基匹配和錯配，共用下游（或上游）引物，分別擴(kuò)增野生型和突變型目的片斷。原理是 (擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng))的縮寫。原理 () , a . 3 . ,

9、. a a , (). F. M. 2008, 原理 () , a . 產(chǎn)物檢測 每個循環(huán)檢測熒光信號，不同產(chǎn)物，不同熒光信號相比凝膠電泳：更快，可定量，無產(chǎn)物污染信號產(chǎn)生方法： ()，雙環(huán)探針(廈門艾德)， ， ， 2 2 . G. V. 2013, 產(chǎn)物檢測 每個循環(huán)檢測熒光信號，不同產(chǎn)物，不同熒光信號 2應(yīng)用于 的GCATGAAGG alleleA allele55553333AS primerAS primerMismatchMismatchReverse primerReverse primerFAM-53-BHQ1FAM-53-BHQ1ProbeProbe應(yīng)用于 的GCATGAAG

10、G alleleA allele5技術(shù)特點優(yōu)點：靈敏度高（0.1-1%）操作簡便周期短不產(chǎn)生產(chǎn)物污染適用樣本類型多（如）精確突變類型缺點：方法建立需時較長僅能檢測已知突變技術(shù)特點優(yōu)點：缺點：測序法與法相比較測序法焦磷酸測序敏感度10-20%5-10%1%標(biāo)本成功率 低較高高商用試劑盒無有有流程與速度1-2天2-3天1312131213121312131213基因序列和常見突變序列： 12 1312131213三引物設(shè)計原理 F. M. 2008, 三引物設(shè)計原理 F. M. 2008, 三引物設(shè)計野生型引物（F）53 19，51突變型引物（F）5319，49下游引物（R）5325，54三引物設(shè)

11、計三引物設(shè)計下游引物設(shè)計選擇序列：53互補鏈：3- 5下游引物：5- -3三引物設(shè)計下游引物設(shè)計3端增加錯配如果3端是弱錯配（或）則需要引入強(qiáng)的錯配（或）才可阻斷3端的擴(kuò)增；如果3端是強(qiáng)錯配（或）則需要引入弱的錯配（或）或不需引入錯配即可阻斷3端的擴(kuò)增；當(dāng)3端是中度錯配（， 或）則需要引入中度的錯配。野生型引物（F）53 突變型引物（F）53下游引物（R）533端增加錯配如果3端是弱錯配（或）則需要引入強(qiáng)的錯配（或四引物設(shè)計四引物設(shè)計四引物設(shè)計內(nèi)引物（F）53 內(nèi)引物（R）53外引物（F）53外引物（R）53四引物設(shè)計試劑盒開發(fā)簡介試劑盒開發(fā)簡介突變探針和引物設(shè)計序列：1. 5 3 12 2.

12、 5- 3 12 3. 5- 3 12 4. 5- 3 12 5. 5- 3 12 6. 5- 3 12 7. 5- 3 13 8. 參照引物：5 39. 下游引物：53 探針：51-3鎖核酸阻滯探針(野生型)： 5 04-3浙江大學(xué)， 102367478 B突變探針和引物設(shè)計序列：浙江大學(xué)， 102367478 B反應(yīng)體系引物終濃度：0.3 MTaqman探針終濃度：0.1 MLNA阻滯探針終濃度：0.9 MGoldstarbest Taq酶終濃度：0.05 U/l 模板DNA終濃度：10-300 ng/ldNTPs終濃度：0.2 mMMgCl2 終濃度：3.5 mM 循環(huán):95C預(yù)變性10分鐘95C 15秒60C 40秒擴(kuò)增反應(yīng)40循環(huán)，60C 40秒在7500或480檢測儀上進(jìn)行。每個樣本進(jìn)行8管反應(yīng)，每管反應(yīng)加入共同的混合液，阻滯探針及模板，所不同的只有參照引物或者引物。反應(yīng)體系引物終濃度：0.3 M 循環(huán):在7500或480檢擬開發(fā)產(chǎn)品特異性引物：7條 （檢驗特異性）參照引物：1條 （檢驗特異性）下游引物：1條 （檢驗特異性）探針：1條鎖核酸阻滯探針：1條陽性對照：包含7種突變的質(zhì)粒模板（測序）酶，最好為 （ )混合反應(yīng)液擬開發(fā)產(chǎn)品特異性引物：7條 （檢驗特異性）結(jié)果判讀參照引