內(nèi)容文本生化下nucleic acid properties

1、Nucleic Acid PropertiesParts: Nucleic acidsHistory of DNANucleotides are the building blocks of nucleic acidsDNA StructureNucleic Acid Properties(一)物理性質(zhì)形狀：RNA及其組分核苷酸、核苷、嘌呤堿、嘧啶堿的純品都呈白色的粉末或結(jié)晶；DNA則為疏松的石棉一樣的纖維狀固體。溶解性：RNA和DNA都是極性的化合物，一般說來，這些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑。它們的鈉鹽易溶于水。 DNA和RNA在生物細(xì)胞內(nèi)都與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。DN

2、A的一級結(jié)構(gòu):（磷酸二酯鍵） 構(gòu)成DNA的脫氧核苷酸按照一定的排列順序，通過3,5-磷酸二酯鍵相連形成的線形結(jié)構(gòu)。(二)核酸的水解5533糖苷鍵 由戊糖和堿基縮合而成。糖和堿基之間以糖苷相連接。糖的第一位碳原子(C1)與嘧啶堿的第一位氮原子(N1)或與嘌呤堿的第九位氮原子(N9)相連接。所以，糖與堿基間的連鍵是N-C鍵，一般稱之為N-糖苷鍵。(二)核酸的水解：核酸的水解可以分為酸堿水解和酶水解（一）酸或堿水解堿易水解磷酸二酯鍵，DNA和RNA對酸或堿的耐受程度不同，DNA對堿相對較穩(wěn)定。 RNA的2OH基在堿的作用下形成磷酸三酯，既不穩(wěn)定，隨即水解為2，3環(huán)磷酸酯酸易水解N糖苷鍵，嘌呤堿基比嘧

3、啶堿基易被酸水解，RNA相對較穩(wěn)定。 (二）酶水解按底物分：RNA酶(RNase)，DNA酶(DNase)按作用方式分：核酸內(nèi)切酶，核酸外切酶按作用鍵分：水解3-磷酸酯鍵和5-磷酸酯鍵的核酸酶按作用鍵分：水解3-磷酸酯鍵和5-磷酸酯鍵的核酸酶 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶是一類重要的作用于DNA的內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶術(shù)語來自一種現(xiàn)象，即某些細(xì)菌可以通過特異地破壞侵入的病毒DNA來阻止嗜菌體的感染。這樣的細(xì)菌稱之限制性宿主，因為它們可以限制外源DNA的表達(dá)。 限制性宿主可以合成核酸酶，該酶可在特殊的序列區(qū)降解外源DNA，但宿主細(xì)胞本身的DNA并不受該核酸酶的作用。這是因為宿主DNA可被內(nèi)切酶識別的

4、特殊部位的某些堿基已經(jīng)被甲基化了，內(nèi)切酶不能催化已修飾底物的水解。所以任何進(jìn)入宿主細(xì)胞的，在酶識別的特殊部位沒有甲基化的DNA都會受到限制性內(nèi)切酶的切割。限制性內(nèi)切酶 核酸限制性內(nèi)切酶可以識別雙鏈DNA中特定堿基序列的核酸水解酶，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)幾百種限制性內(nèi)切酶，它們以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5端為P，3端為OH。由于限制性內(nèi)切酶能識別DNA特異序列并進(jìn)行切割，因而在基因重組、DNA序列分析、基因組甲基化分析、基因物理圖譜繪制及分子克隆等技術(shù)中收到廣泛應(yīng)用。限制性內(nèi)切酶酶分子識別位點切割位點 限制作用是否需用 ATP類 三亞基雙功能酶 二分非對稱至少在識別位點外 1000b

5、pYes類內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起4-6bp, 大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu) 在識別位點中或靠近識別位點無特異性No類二亞基雙功能酶 5-7 bp 非對稱在識別位點下游 24-26bpYes限制性內(nèi)切酶可分為三類類限制性內(nèi)切酶 類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割, 產(chǎn)生平末端的DNA片段(如Sma: 5-CCCGGG-3)；有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoR切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補(bǔ)的粘性末端。 酶切反應(yīng)的操作步驟 設(shè)計酶切體積為2030l，計算清楚酶切系統(tǒng)中各成分的用量，清晰做好記錄，如果是同一條件下進(jìn)行多個酶切反應(yīng)，建議統(tǒng)一加好共同的組分

6、后，分裝；先加入正確體積的無菌雙蒸水，加入1/10體積的10 x酶切緩沖液，混勻；在冰浴條件下加入適量的限制性內(nèi)切酶；加入適量的DNA樣品；彈勻，短暫離心；置所用限制性內(nèi)切酶最適溫度水浴中，酶切13小時，酶切過夜則建議改用稍大的酶切體積，以避免水分蒸發(fā)過多影響的酶切體系各組分濃度改變過大;置65水浴中10分鐘，對限制性內(nèi)切酶進(jìn)行滅活，不同的酶滅活條件可能不同，請參照說明書進(jìn)行;進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切反應(yīng)的結(jié)果;反應(yīng)體系： 10內(nèi)切酶緩沖液 2l DNA 1-1.5g 限制性內(nèi)切酶 2-5單位用滅菌的ddH2O補(bǔ)至20l，37 1小時?？筛鶕?jù)需要按比例放大。 pGFPuv和pBSK的酶切體系

7、： 酶切體系質(zhì)粒載體（pGFPuv和pBSK）10RE buffer (E)6 l100BSA0.6 lDNA6 gEcoR I0.6 lHind III0.6 lddH2OX l 合計60 l充分混勻后，用離心機(jī)短時（10秒）離心，于37保溫3-4小時或過夜，65保溫10分鐘使限制性內(nèi)切酶失活。 酶的定義: 在標(biāo)準(zhǔn)條件下,1小時完全消化1g線型DNA分子所需的酶量定義為1U；影響限制性內(nèi)切酶活性的生物因子：酶切割位點周圍核苷酸兩側(cè)的堿基的性質(zhì)；識別序列在DNA中的分布頻率；與DNA的構(gòu)象有關(guān)（SC,L,OC）；DNA的純度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）； 內(nèi)切酶用量不超過總反應(yīng)體積

8、的10%；消化時間適當(dāng)延長有利于提高酶活性；加DNAse-free的BSA 可以起到穩(wěn)定酶活性的作用；用硅化處理的器皿進(jìn)行酶切可以提高酶活性；酶切所用器皿和ddH2O要經(jīng)過高溫滅菌方可使用；DNA樣品應(yīng)不含重金屬離子。 DNA的連接在T4DNA連接酶的作用下，平端或帶有相同粘末端的DNA分子可以連接上。DNA連接酶的作分三步：T4DNA 連接酶與輔助因子ATP形成酶-AMP復(fù)合物。酶-AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5-磷酸基和3羥基切口的DNA分子上，使DNA腺苷化。產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來。 Theoretical Basis of Agarose Gel Electrophoresi

9、sAgarose is a polysaccharide from marine alage that is used in a matrix to separate DNA moleculesBecause DNA ia a (-) charged molecule when subjected to an electric current it will migrate towards a (+) polePouring an Agarose Gel123456789Sizing a Piece of DNAThe distance the DNA migrates is dependen

10、t uponthe size of the DNA moleculethe secondary structure of the DNAthe degree of crosslinking in the gel matrixSize of DNA molecule can be determined by using standards of known molecular weight 1. a standard curve is made by plotting the molecular weights of the standards and the distance each fra

11、gment has migrated from the 2. measuring the distance the unknown fragment migrated from the well 3. substituting the distance the unknown migrated into the equation of the line of best fit, and solving for Y (the molecular wt)二、核酸的解離 核酸的堿基、核苷和核苷酸都能發(fā)生解離 1. 堿基的解離：嘧啶和嘌呤化合物雜環(huán)中的氮 2.核苷的解離：由于糖對堿基的解離的影響，增強(qiáng)

12、酸性 解離 3.核苷酸的解離：磷酸基引起的兩個解離常數(shù) pk10.7-1.6 pk25.9-6.5pK1 = 0.9第一磷酸基pK3 = 6.2第二磷酸基pK2 = 3.7含氮環(huán)腺嘌呤核苷酸pK1 = 0.7第一磷酸基pK3 = 6.1第二磷酸基pK2 = 3.7含氮環(huán)烯醇式羥基鳥嘌呤核苷酸pK1 = 0.8第一磷酸基pK3 = 6.3第二磷酸基pK2 = 4.3含氮環(huán)胞嘧啶核苷酸pK1 = 1.0第一磷酸基pK3 = 6.4第二磷酸基烯醇式羥基尿嘧啶核苷酸pH離子化程度小牛胸腺DNA的滴定曲線pH三、核酸的紫外吸收嘌呤堿和嘧啶堿分子中均具共軛雙鍵體系，在紫外區(qū)有吸收（240-290nm，最大

13、吸收在260 nm左右）。DNA的紫外吸收光譜1.天然DNA2.變性DNA3.核苷酸總吸收值2202402602800.10.20.30.4波長（nm）光吸收123Hyperchromicity （增色效應(yīng)） DNA solution characteristically shows an absorbance maximum at 260nm (in the UV region of the spectrum). If the same DNA solution is melted, the absorbance at 260nm increases. This property is te

14、rmed hyperchromicity. The hyperchromic shift is due to the fact that unstacked bases absorb more light than stacked bases.四、核酸的變性、復(fù)性與分子雜交1. 變性穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。 氫鍵斷裂，不涉及到共價鍵的斷裂。變性表征 生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）變性因素 pH（11.3或5.0） 變性劑（脲、甲酰胺、甲醛） 低離子強(qiáng)度 加熱變性DNA的變性過程是突變性

15、的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通過經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.442. 熱變性和Tm影響Tm的因素GC對含量溶液的離子強(qiáng)度溶液的PH變性劑（G+C）% =（Tm 69.3） 2.44Tm vs GC ContentThermal Denaturation of DNA Tm: In the process of thermal denaturat

16、ion, Tm is a point at which 50% of the DNA molecule exists as single strands.Tm is primarily dependent upon 1) Base composition of that DNA molecule. 2) Chemical nature of the solvent and 3) the identities and concentrations of ions in the solutionWhen thermally melted DNA is cooled, the complementa

17、ry strands will again re-form the correct base pairs, in a process termed annealing or hybridization. 3. 核酸的復(fù)性變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性 （Renaturation)。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為“退火” (annealing)。 退火溫度Tm25復(fù)性影響因素 片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)

18、序列數(shù)目）/ 溶液離子強(qiáng)度 4.分子雜交 (Hybridization)DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。探針：用放射性同位素或熒光標(biāo)記的DNA或RNA片段。點雜交：將核酸直接點在膜上，再與核酸雜交。Southern印跡法：將電泳分離后的DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再進(jìn)行雜交。Northern印跡法：將電泳分離后的RNA吸印到纖維素膜上再進(jìn)行分子雜交。Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記DNA探

19、針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜 本章小結(jié)核酸是遺傳物質(zhì)載體的證明和研究歷史 1944 Avery, MacLeod, and McCarty demonstrate DNA could “transform” cells. Some doubt remained. Avery repeated Griffiths experiment of combining heat-killed virulent IIIS bacteria with non-virulent IIR bacteria. In order to isolate the t

20、ransforming substance, he fractionated the heat-killed IIIS cells and selectively removed carbohydrates and lipids, leaving behind proteins and nucleic acids. 1952 Hershey and Chase confirm DNA is a molecule of heredity. proteins labeled with 35S DNA labeled with 32P 雙螺旋模型（Watson和Crick于1953年提出）DNA雙螺

21、旋（B-DNA）是兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一假想的中心軸纏繞形成的右手雙螺旋。糖和磷酸形成每條鏈的骨架，暴露在螺旋的表面，堿基堆積在螺旋的內(nèi)部，一條鏈上的堿基與另一條鏈上的堿基形成位于同一平面的堿基對。腺嘌呤總是與胸腺嘧啶配對（通過二個氫鍵），而鳥嘌呤總是與胞嘧啶配對（通過三個氫鍵）堿基配對，因此雙螺旋中的一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)。相鄰堿基對的距離為0.34nm，沿著螺旋的長軸每一轉(zhuǎn)含有10個堿基對，螺距為3.4nm。螺旋的表面形成大溝和小溝。堿基對之間的疏水相互是穩(wěn)定雙螺旋的主要力。 核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)1.核酸是由構(gòu)件分子核苷酸組成的線性聚合物，分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。

22、每一個核苷酸都是由一個戊糖（對于DNA是2-脫氧核糖，對于RNA是核糖）通過-N-糖苷鍵與一個雜環(huán)堿基（嘌呤或嘧啶）連接組成的，糖的5C位通過酯鍵連接一個磷酸基團(tuán)。2. 每一個核苷酸的磷酸基團(tuán)通過與相鄰的另一個核苷酸的3羥基形成的酯鍵將各個核苷酸連接起來形成聚核苷酸和核酸。由于一個磷酸分別在兩個核苷酸的3和5位都形成了酯鍵，所以連接兩個核苷酸的含有兩個酯鍵的橋梁稱之為磷酸二酯鍵。核酸酶可以在3或5位水解二酯鍵。 3.嘌呤堿基腺嘌呤和鳥嘌呤既出現(xiàn)在DNA中，也出現(xiàn)在RNA中，出現(xiàn)在DNA中的嘧啶堿基是胞嘧啶和胸腺嘧啶，而出現(xiàn)在RNA中的主要是胞嘧啶和尿嘧啶，但RNA中還存在少量的稀有堿基，如假尿

23、嘧啶、二氫尿嘧啶等。 4.核苷酸是核苷的磷酸酯，去掉磷酸基團(tuán)后剩下的部分稱之為核苷。如果核苷5端磷酸化，根據(jù)連接的磷酸基團(tuán)的數(shù)目可以形成核苷一磷酸（通常說的核苷酸，如AMP、GMP等）、核苷二磷酸（如ADP、GDP等）或核苷三磷酸（如ATP、GTP等）。 5. 在核苷5端磷酸化形成一個酯鍵，同一個磷酸又可以在同一個核苷的3端再形成一個酯鍵，形成一個環(huán)核苷酸。其中的環(huán)胸苷酸（cAMP）和環(huán)鳥苷酸（cGMP）是生物體的第二信使，它們可以將細(xì)胞外激素的信息傳遞給細(xì)胞內(nèi)，引起重要的生理效應(yīng)。 6. 核酸的大小變化很大，他們可以與蛋白質(zhì)非共價結(jié)合形成核蛋白，如染色質(zhì)、核糖體和病毒顆粒。DNA是原核生物和真核生