水中大腸桿菌的檢測方法

1、附件水中大腸桿菌群檢測辦法-多管發(fā)酵法.辦法概要本辦法系用以檢測水中革蘭氏染色陰性，不產(chǎn)生內(nèi)生抱子之桿狀好氧或兼性厭氧菌，且能在35 1 C . 48 土 3小時發(fā)酵乳糖并產(chǎn)生酸及氣 體之大腸桿菌群（Coliform group ）;在不合體積或不合稀釋度之水樣所 產(chǎn)生之成果，以100 mL水中最大可能數(shù)（MPN/100 mD暗示100 mL 水中消失之大腸桿菌群數(shù)量.實用規(guī)模本辦法實用地面水體.地下水體.廢水.污水及水源水質(zhì)水樣中大腸桿 菌群之磨練.干擾（一）水樣中含有克制或促進大腸桿菌群細菌發(fā)展之物資（二）檢測應(yīng)用的玻璃器皿及裝備含有克制或促進大腸桿菌群細菌發(fā)展的物 資.四.裝備（一）量筒

2、：100至1000 mL之量筒.（二）吸管：有刻度之10 mL滅菌玻璃吸管或市售無菌塑料吸管，或無菌微量吸管（micropipet ）.（三）試管：大小約150 X 15 mm之試管或有蓋螺旋試管.（四）發(fā)酵管（fermentation tube ）:大小約22 x 9 mm之玻璃管.（五）稀釋瓶：容量約100 mL可滅菌之硼硅玻璃成品.（六）錐形瓶：200至2000 mL之可滅菌硼硅玻璃成品.（七）采樣容器：容量120 mL以上無菌之硼硅玻璃瓶或無菌塑料有蓋容器 或市售無菌袋.（八）冰箱：溫度能保持在 4 士 2 c者.（九）天平：待測物重量大于 2 g時，須能精秤至0.01 g;待測物重量

3、不大于 2 g時，須能精秤至0.001 g.（十）造就箱：溫度能保持在 35 士 1 C者.（H一）高壓滅菌釜：溫度能保持在121c （壓力約15 lb/in 2或1.1Kg/cm2）滅菌15分鐘以上者.（十二）高溫干熱烘箱：如用于玻璃器皿等器具之滅菌，溫度須能保持在160c達2小時或170c達1小時以上者.（十三）接種環(huán)：為白金或銀銘合金制，實用于細菌接種或移植，亦可應(yīng)用無菌（十四）pH計：精確度達0.1 pH單位.五.試劑（一）試劑水：蒸儲水或去離子水 ，導(dǎo)電度在25 C時小于2抹mho / cm（二）造就基，應(yīng)應(yīng)用市售商品化造就基.1 .硫酸月桂酸胰化蛋白月東造就基（ Lauryl su

4、lfate tryptose broth,稱 LST)1倍濃度LST造就基含有下列成份:胰化蛋白月東（Tryptose ）乳糖(Lactose )氯化鈉（NaCl） 磷酸氫二鉀（KHPO）磷酸二氫鉀（KHIPQ） 硫酸月桂酸鈉（Sodium lauryl sulfate ）試劑水1L配成2倍濃度（取71.2 g LST造就基粉末溶于1 L試劑水）， 完整消融后，分取10 mL注入裝有倒置發(fā)酵管之試管內(nèi)，經(jīng)121c滅菌 15分鐘，冷卻后備用，滅菌后造就基之pH值應(yīng)在.滅菌后造就基若未 當(dāng)日應(yīng)用，應(yīng)保管在4 士 2 C ,保管刻日為14天.可根據(jù)磨練需求量 依配方配制造就基.2 .煌綠乳糖膽汁造就

5、基（Brilliant green lactose bile broth,簡稱BGLB1公升的BGLB造就基中含有下列成份：蛋白月東（Peptone）孚L糖（Lactose ）牛膽粉（Oxgall Powder ）Brilliant Green煌綠色試劑（ 試劑水1LBrilliant Green取40 g BGLB造就基粉末溶于1 L試劑水，完整消融后，分取5 至10 mL注入裝有倒置發(fā)酵管之試管內(nèi)，經(jīng)121c滅菌15分鐘，冷卻 后備用，其pH值應(yīng)在.滅菌后造就基若未當(dāng)日應(yīng)用，應(yīng)保管在4 士 2 C,保管刻日為14天.可根據(jù)磨練需求量，依配方配制造就基.（三）無菌稀釋液,磷酸二氫鉀儲備溶液取

6、3.4 g磷酸二氫鉀（KHPO）溶于50 mL的試劑水中，俟完整 消融后，以1.0 N NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值為，然后加試劑水至100 mL, 滅菌（過濾滅菌或121 C高溫高壓滅菌15分鐘）后儲存于冰箱中備 用.4 2 C下保管刻日為3個月.氯化鎂儲備溶液取8.1 g氯化鎂（MgC2? 6HzO）,先溶于少量試劑水，俟完整消 融后，再加試劑水至全量為 100 mL,滅菌（過濾滅菌或121 C高溫高壓 滅菌15分鐘）后，儲存于冰箱中備用.4 2 C下保管刻日為3個月.無菌稀釋液分離取10 mL氯化鎂儲備溶液和 2.5 mL磷酸二氫鉀儲備溶液再參加試劑水至2,000 mL,混搖平均后，分裝于稀

7、釋瓶中，經(jīng)121c滅菌15分鐘，作為無菌稀釋液備用.如欲用于水樣稀釋，分裝之無菌稀釋液滅菌后體積須為90 土 2.0 mL.4 土 2 C下保管刻日為3個月.六.采樣與保管（一）盛裝水樣磨練微生物之容器，應(yīng)應(yīng)用干凈并經(jīng)滅菌之玻璃瓶或無菌塑 料容器或市售無菌采樣袋，且于采樣時應(yīng)防止受到污染.水樣若含有余氯 時，無菌容器中應(yīng)參加適量之無菌硫代硫酸鈉（采納加氯之廢水時，每100 mL水樣中參加0.1 mL.10%硫代硫酸鈉可還原 15 mg/L余氯.采納含 氯之飲用水水樣時，每100 mL之水樣如參加0.1 mL之3喻代硫酸鈉， 可中和之余氯量約為 5 mg / L.）.（二）采樣前應(yīng)干凈手部，再行

8、采水樣，所采水樣應(yīng)具有代表性.（三）輸送時水樣溫度應(yīng)保持在小于10 C且不得凍結(jié)，而實驗室內(nèi)保管溫度應(yīng)保持在4 2 C .（四）水樣應(yīng)于采樣后24小時內(nèi)完成推定實驗之水樣添加步調(diào)（七 .步調(diào) （一）4 .）,并置入造就箱中造就.（五）水樣量須以能做完所需磨練為度 ，但不得少于120 mL.七.步調(diào)實驗分兩階段進行.起首進行推定實驗，若推定實驗成果為陽性反響， 則持續(xù)進行第二階段之肯定實驗，如成果仍是陽性反響則顯示有大腸桿菌 群消失.各實驗步調(diào)如下述：（一）推定實驗.慎選發(fā)酵管中沒有氣泡且未污染之10 mL.2倍濃度LST試管.水樣在進行檢測或稀釋之前必須激烈搖擺25次以上，以使樣品充分混搖平均

9、.視水樣中微生物可能濃度規(guī)模進行水樣稀釋步調(diào)，應(yīng)用無菌吸管汲取10 mL水樣至90 mL無菌稀釋液中，形成10倍稀釋度水樣，混雜平均， 爾后自10倍稀釋度水樣以雷同操縱方法進行一系列恰當(dāng)之100.1000.10000倍等稀釋水樣，進行稀釋步調(diào)時，均需改換無菌稀釋 吸管，水樣稀釋步調(diào)如圖一所示（注 1）.以無菌吸管分離取各稀釋度10 mL水樣至內(nèi)含10 mL 2倍濃度的LST試管中，每一稀釋度各作5支，當(dāng)心混雜平均，混雜后發(fā)酵管內(nèi)不成產(chǎn) 朝氣泡.在35 土 1 C造就箱中造就 48 3小時,不雅察并記載發(fā)酵情況，如 有氣體產(chǎn)生則推定實驗為陽性反響，若無氣體產(chǎn)生則推定實驗為陰性 反響，但若造就液呈

10、混濁狀況，雖無產(chǎn)氣，亦應(yīng)進行肯定實驗（二）肯定實驗若推定實驗之發(fā)酵管中有氣體或混濁產(chǎn)生時,則應(yīng)用BGLEtt行肯定實驗：.慎選發(fā)酵管中沒有氣泡且未污染之BGLB式管.應(yīng)用無菌接種環(huán)自產(chǎn)朝氣體以及混濁之LST造就基試管中，接種一圈造就液至BGLBit就基t管中.在35 土 1 C造就箱中造就 48 3小時.在48 土 3小時內(nèi),BGLB造就基試管如有氣體產(chǎn)生，則肯定實驗為陽 性反響.八.成果處理（一）經(jīng)肯定實驗確認 BGLB式管為陽Ti反響后，應(yīng)以100 mL水中最大可能 數(shù)（MPN/100 mD盤算及記載.5支發(fā)酵管持續(xù)三種稀釋度之MP阿查表一.（二）表一所示接種之水樣量為 10 mL.1.0

11、 mL及0.1 mL,若所用之稀釋度 有三種以上時，采取最具意義之三種稀釋度，查表后再盤算100 mL水中 大腸桿菌群最大可能數(shù).稀釋度之拔取方法如下： TOC o 1-5 h z .先拔取5管均呈陽性反響的最高稀釋度（此時稀釋度較低之各組試管 必須全體呈陽性反響），再拔取下兩個稀釋度（如表二水樣別a）.假如稀釋度最低的一組并不是5管均呈陽性反響，則拔取稀釋度最低的一組，再拔取下兩個稀釋度（如表二水樣別b.c ）.假如根據(jù)上述原則（1.及2 .）拔取3個稀釋度后，下一稀釋度試管組仍有陽性反響試管，則舍棄本來3組中稀釋度最低的一組，納入下一 稀釋度的數(shù)據(jù)（如表二水樣別d）.假如根據(jù)上述原則（1.

12、至3 .）拔取3個稀釋度后，更高稀釋度之試管組仍有陽性反響試管，則把更高稀釋度之陽性反響試管數(shù)加至本來 3組中稀釋度最高的一組（如表二水樣別e）.（三）100 mL水中大腸桿菌群最大可能數(shù)（MPN/100 mD之盤算公式如下：成果小于100時，以整數(shù)暗示（小數(shù)字數(shù)四舍五入），菌落數(shù)大于100以上時，只取兩位有用數(shù)字：例如 110以1.1 X 10 2暗示,16,000 以1.6 X 10 4暗示.（四）檢測記載須注明采樣時光.造就肇端及終了時光.造就基名稱.造就溫 度及各稀釋度的數(shù)據(jù)等相干數(shù)據(jù).九.質(zhì)量治理（一）微生物采樣人員及檢測人員應(yīng)具備微生物根本練習(xí)及常識（二）每批次采樣時應(yīng)進交輸送空白

13、.（三）每批次或每10個水樣需進行試劑空白實驗.（四）新購入之造就基，每批號均須以大腸桿菌群陽性掌握菌株（如 E.coli.Enterobacter aerogenes.Citrobacter freundii） 進行測試，以確保數(shù)據(jù)質(zhì)量.（五）若一季時代水樣均未檢出大腸桿菌群，則須以大腸桿菌群菌株進行造就基測試，以確保數(shù)據(jù)質(zhì)量.（六）本辦法造就所得之細菌可能具有沾染性，檢測后之造就基及器皿應(yīng)經(jīng) 高溫高壓滅菌處理.十.周詳度及精確度略十一.參考數(shù)據(jù)（一）APHA. 2005. Standard Methods for the Examination of Waterand Wastewater

14、, 21st Edition, Section 9221. American PublicHealth Association, Washington, D.C.(二)Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological CultureMedia. 2003. BD Diagnostic Systems.注1:水樣如須稀釋，建議于稀釋后30分鐘內(nèi)完成檢測步調(diào)，以免造成細菌 逝世亡或增生，影響實驗成果.圖一水樣稀釋步調(diào)表一三持續(xù)稀釋度(10 mL.1 mL.0.1 mL )五試管反復(fù)測試時，陽性成果組合之MPW旨數(shù)及95%言任區(qū)間陽性反響組合MPN/100 mL95%信任區(qū)