發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)相關(guān)分析課件

1、發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)相關(guān)分析華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心2007.5.23發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)相關(guān)分析華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容1.重要參數(shù)介紹2.多參數(shù)相關(guān)性分析3.發(fā)酵培養(yǎng)基分析與工藝改進(jìn)主要內(nèi)容1.重要參數(shù)介紹1.發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)分類(lèi)直接參數(shù) 通過(guò)傳感器把非電量變化直接轉(zhuǎn)化為電量變 化，實(shí)時(shí)地送計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集。物理參數(shù)、化學(xué)參數(shù)、生物量參數(shù)就地測(cè)量（in line）、在線測(cè)量（on line） 間接參數(shù): 由一些直接參數(shù)計(jì)算得到的各種反映過(guò)程 特性的參數(shù)。 反映菌體代謝活性、反應(yīng)器工程特性、反應(yīng)器操作特性等。手工參數(shù): 取樣后實(shí)驗(yàn)室手工測(cè)量參數(shù)

2、，離線輸入。1.發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)分類(lèi)直接參數(shù) 通過(guò)傳感器把非電量變化直接 直接參數(shù) 物理參數(shù) 化學(xué)參數(shù)成熟不成熟 直接參數(shù) 間接參數(shù) 間接參數(shù)反映菌體的代謝活性參數(shù)：OUR、CER、RQ反映反應(yīng)器工程特性參數(shù)： KLa1耗氧速率OUR排氣氧的濃度表征了進(jìn)氣的氧被微生物利用以后還剩余的氧，因此排氣氧的大小反映了菌生長(zhǎng)的活性，通過(guò)計(jì)算可以求得攝氧率（OUR）。1. 重要間接參數(shù)介紹反映菌體的代謝活性參數(shù)：OUR、CER、RQ1. 重要間接參重要間接參數(shù)介紹 氧消耗速率OUR， mol/Lh Fin 進(jìn)氣流量 mol；Cinertial，Co2, Cco2進(jìn)氣中惰性氣體、氧及二氧化碳的濃度(%體積分?jǐn)?shù)

3、 分別取79.02%、20.95%、0.03%）Pin 進(jìn)氣的絕對(duì)壓強(qiáng)，Pa；h 進(jìn)氣的相對(duì)濕度，；tin 進(jìn)氣的溫度簡(jiǎn)化公式：OUR=F/V(O2inO2out) 重要間接參數(shù)介紹 氧消耗速率OUR， mol/Lh FiOUR下降，表征的是該菌株耗氧能力降低;與此相應(yīng)，伴隨著CER的下降，是菌體活力下降的表現(xiàn)OUR下降，表征的是該菌株耗氧能力降低;與此相應(yīng)，伴隨著CE重要間接參數(shù)介紹體積氧傳遞系數(shù) KLa，1/h KLa = f (P/V, Vs, app)C:整體液相中的溶解氧濃度 mol/lC*:與氣相氧分壓平衡的液相中氧濃度mol/l一般取0.2mmol/L 重要間接參數(shù)介紹體積氧傳遞

4、系數(shù) KLa，1/h KL表示設(shè)備供氧傳遞能力，與輸入的攪拌功率、通氣流量以及培養(yǎng)液的流變特性有關(guān)。表示設(shè)備供氧傳遞能力，與輸入的攪拌功率、通氣流量以及培養(yǎng)液的菌體生長(zhǎng)與Kla、DO的相關(guān)特性發(fā)酵中后期，可以根據(jù)Kla的變化預(yù)測(cè)菌體的的自溶菌體生長(zhǎng)與Kla、DO的相關(guān)特性發(fā)酵中后期，可以根據(jù)Kla的菌體稀化的原因1.發(fā)酵液中提供能量的碳源耗盡，不能維持代謝而進(jìn)行 2.發(fā)酵液活細(xì)胞與死細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，菌體生長(zhǎng)所需的組成材料（氮源）供應(yīng)不足， 調(diào)節(jié)C/N比控制比生長(zhǎng)速率 3.工藝條件影響：高溫、低溶氧等，加速菌體自溶菌體稀化的原因1.發(fā)酵液中提供能量的碳源耗盡，不能維持代謝而臨界氧濃度的發(fā)現(xiàn)所謂臨

5、界氧是指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度。如對(duì)產(chǎn)物而言，便是不影響產(chǎn)物合成所允許的最低濃度所謂臨界氧是指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度。如對(duì)產(chǎn)物而言，便是不影響產(chǎn)物合成所允許的最低濃度紅霉素前期DO濃度的控制？臨界氧濃度的發(fā)現(xiàn)所謂臨界氧是指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度1.1.2 二氧化碳釋放率CER排氣二氧化碳反映了微生物代謝的情況微生物攝入的氧并不是全部變成二氧化碳，有的進(jìn)入代謝中間物分子，進(jìn)入細(xì)胞或產(chǎn)物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有機(jī)物降解后會(huì)產(chǎn)生二氧化碳，使排氣二氧化碳大于消耗的氧。1.1.2 二氧化碳釋放率CER排氣二氧化碳反映了微生物代謝重要間接參數(shù)介紹 二氧化

6、碳釋放速率CER， mol/（Lh） CER：表示單位體積發(fā)酵液?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)釋放的二氧化碳的量簡(jiǎn)化公式：CERF/V(CO2out-CO2in) 重要間接參數(shù)介紹 二氧化碳釋放速率CER， mol/（Lh在非糖限制條件下，特別是在發(fā)酵初期，菌量與CER有一定的線性關(guān)系在非糖限制條件下，特別是在發(fā)酵初期，菌量與CER有2202種子數(shù)據(jù)分析2202種子數(shù)據(jù)分析發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)相關(guān)分析課件轉(zhuǎn)種時(shí)間：離線pH與菌體代謝有較強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系pH下降過(guò)程可作為最佳轉(zhuǎn)種時(shí)間轉(zhuǎn)種時(shí)間：離線pH與菌體代謝有較強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系重要間接參數(shù)介紹呼吸熵 RQ： 表征好氣微生物生理特征的重要參數(shù)重要間接參數(shù)介紹呼吸熵 RQ：呼吸商

7、(RQ)變化的生物學(xué)意義表征不同的代謝途徑 厭氧代謝、耗氧代謝 不同的耗氧代謝途徑間的差異表征不同的基質(zhì)利用情況 基質(zhì)還原性強(qiáng)與弱的差異呼吸商(RQ)變化的生物學(xué)意義表征不同的代謝途徑不同碳源完全氧化時(shí)的RQ值碳源化學(xué)簡(jiǎn)式RQ碳水化合物CnH2nOn1.00烷烴CnH2n+22n/(3n+1)甲醇CH4O0.67甘油C3H8O30.75不同碳源完全氧化時(shí)的RQ值碳源化學(xué)簡(jiǎn)式RQ碳水化合物CnH2RQ值可以反映菌的代謝情況，如酵母培養(yǎng)過(guò)程中RQ = 1, 表示糖代謝走有氧分解代謝途徑，僅供生長(zhǎng)，無(wú)產(chǎn)物形成；RQ 1.1，表示走EMP途徑，生成乙醇；RQ = 0.93,生成檸檬酸；RQ 0.7,

8、表示生成的乙醇被當(dāng)作基質(zhì)再利用RQ值可以反映菌的代謝情況，在實(shí)際生產(chǎn)中測(cè)得的RQ值明顯低于理論值，說(shuō)明過(guò)程中存在著不完全氧化的中間代謝物和葡萄糖以外的碳源。如油的存在(它的不飽和與還原性)使RQ值遠(yuǎn)低于葡萄糖為唯一碳源的RQ值，在0.50.7范圍，并隨葡萄糖與油量之比波動(dòng)。在實(shí)際生產(chǎn)中測(cè)得的RQ值明顯低于理論值，說(shuō)明過(guò)程中存在著不完2. 發(fā)酵過(guò)程參數(shù)相關(guān)分析理化相關(guān) 純屬物質(zhì)理化性質(zhì)變化所引起的參數(shù)相關(guān)生物相關(guān) 生物相關(guān)是指通過(guò)生物細(xì)胞的生命活動(dòng)所引起的參數(shù)之間耦合相關(guān)2. 發(fā)酵過(guò)程參數(shù)相關(guān)分析理化相關(guān)2.1 理化相關(guān)攪拌轉(zhuǎn)速、通氣流量、罐壓力 溶解氧 DO轉(zhuǎn)速，氣泡，氣液接觸表面積，KLa，

9、OTROUR，DO2.1 理化相關(guān)攪拌轉(zhuǎn)速、通氣流量、罐壓力 溶解氧 DO2202采集數(shù)據(jù)溫度與CER、OUR相關(guān)2202采集數(shù)據(jù)溫度與CER、OUR相關(guān)理化相關(guān)的普遍特性理化相關(guān)對(duì)不同細(xì)胞對(duì)象具有普遍性，不因細(xì)胞生理活性的變化呈現(xiàn)不同的特性。理化相關(guān)的普遍特性理化相關(guān)對(duì)不同細(xì)胞對(duì)象具有普遍性，不因細(xì)胞2.2 生物相關(guān)菌體生長(zhǎng)引起的生物相關(guān)特性快速生長(zhǎng)期時(shí)，培養(yǎng)液粘度上升，KLa下降，引起DO水平的變化2.2 生物相關(guān)菌體生長(zhǎng)引起的生物相關(guān)特性發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)相關(guān)分析課件代謝引起的生物相關(guān) 通過(guò)生物細(xì)胞及代謝途徑的不同所引起的活性變化,直接對(duì)控制對(duì)象特性發(fā)生影響。菌體細(xì)胞代謝活性變化而直接引起的

10、某測(cè)定參數(shù)的變化，即為代謝特性參數(shù)相關(guān)。 -代謝強(qiáng)度的變化 -代謝途徑的變化 -引起的基質(zhì)消耗或代謝產(chǎn)物形成的不同 代謝活性變化：環(huán)境條件的線性或動(dòng)力學(xué)因素、細(xì)胞內(nèi)某調(diào)節(jié)因子引起的代謝流遷移、基因水平的信息流。 代謝引起的生物相關(guān) 通過(guò)生物細(xì)胞及代謝途徑的不同所引起生物相關(guān)：OUR與DO的基本相關(guān)特征OURDOrpm加糖DO和OUR之間的動(dòng)力學(xué)特征O2消耗與過(guò)程傳遞的物質(zhì)平衡時(shí)間(h)生物相關(guān)：OUR與DO的基本相關(guān)特征OURDOrpm加糖DO生物相關(guān)：RQ 、CER 、DO 間的相關(guān)RQCERDORQRQRQCERDODODOCgluCglu時(shí)間（h）時(shí)間（h）時(shí)間（h）時(shí)間（h）加碳源加碳

11、源葡萄糖碳源加入,限制性基質(zhì)情況還原性大的碳源好氧發(fā)酵厭氧發(fā)酵生物相關(guān)：RQ 、CER 、DO 間的相關(guān)RQCERDORQ 38小時(shí)DO下降，同時(shí)OUR上升RQ下降，CER變化不大，提示可能菌體利用了還原性更強(qiáng)的物質(zhì)做碳源。77小時(shí)開(kāi)始補(bǔ)糖后，CER,OUR同步上升，DO下降，RQ維持不變，提示此時(shí)碳源處于限制。 38小時(shí)DO下降，同時(shí)OUR上升RQ下降，CER變化不大，63 h, 補(bǔ)糖速率過(guò)快，DO下降、CER上升、RQ上升63 h, 補(bǔ)糖速率過(guò)快，DO下降、CER上升、RQ上升多基質(zhì)利用的參數(shù)相關(guān)變化多基質(zhì)利用的參數(shù)相關(guān)變化相關(guān)性分析：發(fā)酵過(guò)程中加油的作用消泡 釋放CO2(h)EO2ECO

12、2DO作為碳源利用(h)RQOURCERDO改變流變特性(h)OURCERDOKLa加糖加油作為氧載體提高對(duì)氧親和力(h)相關(guān)性分析：發(fā)酵過(guò)程中加油的作用消泡 釋放CO2發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)相關(guān)分析課件3. 發(fā)酵培養(yǎng)基分析3. 發(fā)酵培養(yǎng)基分析玉米漿成分：氨基酸無(wú)機(jī)鹽玉米漿成分：磷酸鹽的調(diào)節(jié)1.磷促進(jìn)初級(jí)代謝，菌體趨向于生長(zhǎng)，胞內(nèi)ATP濃度迅速增加，抑制次級(jí)代謝2.磷酸鹽濃度增加，抑制了6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活力，但促進(jìn)了3-磷酸丙糖的氧化，結(jié)果使HMP途徑受阻，而使糖代謝趨于酵解途經(jīng)， HMP途徑功能：NADPH（還原力）3.磷酸鹽限制抗生素合成途徑中前體物質(zhì)的生成，從而限制紅霉素多酮體的縮合磷酸鹽

13、的調(diào)節(jié)1.磷促進(jìn)初級(jí)代謝，菌體趨向于生長(zhǎng)，胞內(nèi)ATP濃紅霉素生物合成過(guò)程中組分研究 目前市場(chǎng)上對(duì)EA的比例要求在78 %以上。紅霉素生物合成過(guò)程中組分研究 目前市場(chǎng)上對(duì)EA的比例要求在7發(fā)酵初始添加六種氨基酸對(duì)產(chǎn)量與組分影響發(fā)酵初始添加六種氨基酸對(duì)產(chǎn)量與組分影響添加Gly后對(duì)紅霉素產(chǎn)量、組分時(shí)序變化 Fig.5.10 Effect of Gly on the component percent of erythromycin in the fermentation process (1# 0.05, 2#0.15%) 添加Gly后對(duì)紅霉素產(chǎn)量、組分時(shí)序變化 Fig.5.10 50L發(fā)酵罐考察G

14、ly對(duì)紅霉素發(fā)酵的影響 50L發(fā)酵罐考察Gly對(duì)紅霉素發(fā)酵的影響 50L發(fā)酵罐考察Gly對(duì)紅霉素組分影響50L發(fā)酵罐考察Gly對(duì)紅霉素組分影響發(fā)酵工藝改進(jìn)幾點(diǎn)想法1.控制前期菌體比生長(zhǎng)速率調(diào)整發(fā)酵氮源（硫銨、玉米漿、黃豆餅粉比例），后期菌濃維持 發(fā)酵工藝改進(jìn)幾點(diǎn)想法1.控制前期菌體比生長(zhǎng)速率油與淀粉利用代謝流差異MCM：甲基丙二酰CoA變位酶S: 琥珀酰CoA (TCA循環(huán)）油與淀粉利用代謝流差異MCM：甲基丙二酰CoA變位酶2.后期代謝弱化問(wèn)題， 措施：整體代謝途徑考慮，根據(jù)代謝途徑關(guān)鍵酶活性特點(diǎn)，復(fù)合微量元素強(qiáng)化2.后期代謝弱化問(wèn)題，紅霉素代謝曲線65 h后, RQ基本不變，OUR、CER開(kāi)始過(guò)早迅速下降紅霉素代謝曲線65 h后, RQ基本不變，OUR、CER開(kāi)始發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)相關(guān)分析課件紅霉素的生物合成途徑 整體代謝流強(qiáng)化為核心紅霉素的生物合成途徑 整體代謝流強(qiáng)化為核心丙酰CoA與甲基丙二酰CoA的生物合成OUR、CER下降：TCA循環(huán)相關(guān)酶系下降，紅