基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件

1、2 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié) DNA連接酶第三節(jié) DNA聚合酶第四節(jié) DNA修飾酶第五節(jié) 核酸外切酶第六節(jié) 單鏈核酸內(nèi)切酶12 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶1一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。 （Restriction endonuclease）2一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 是一類2. 性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。形成5-P和3-OH末端 自我保護(hù)作用3. 功能細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1. 來源3

2、2. 性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切44細(xì)菌自身DNA的堿基被甲基化酶甲基化(修飾) ，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割而保護(hù)。（2）修飾（Modification） Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase)GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase)CCAGG或CCTGG序列在第二個(gè)C上C5位置上引入甲基限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA進(jìn)行分解，切成小片斷。（1）限制（Restriction5細(xì)菌自身DNA的堿基被甲基化酶甲基化(修飾) ，不能被自身的（3）限制與修飾系統(tǒng)相關(guān)的三個(gè)基因 hs

3、d R: 編碼限制性內(nèi)切酶 hsd M: 編碼限制性甲基化酶 hsd S: 編碼限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)這類酶能識(shí)別DNA分子上的特定位點(diǎn)，并將雙鏈DNA切斷這類酶使DNA分子特定位點(diǎn)上的堿基甲基化，即起修飾 DNA的作用。作用是協(xié)同上述兩種酶識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)。6（3）限制與修飾系統(tǒng)相關(guān)的三個(gè)基因 hsd R: 編碼限制1973年H.O Smith和D. Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：二、限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母大寫種名的前兩個(gè)字母小寫由3個(gè)字母形成的略語表示寄主菌的物種名，組成酶的基本名稱。大腸桿菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血

4、菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示71973年H.O Smith和D. Nathans提議的命名4. 如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個(gè)字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則用一個(gè)大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如 Hind ：d菌株 EcoR ：抗藥性R質(zhì)粒 84. 如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個(gè)字母5. 如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶的先后次序。 如Hind ：d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)酶6. 所有的限制酶，除以上名稱外還要冠以系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切酶的系統(tǒng)命

5、名為R，甲基化酶為M。如 R.Hind 表示限制性內(nèi)切酶 M.Hind 表示相應(yīng)的甲基化酶實(shí)際應(yīng)用中，R常被省略。95. 如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬屬名 種名 株名H i n d III H i n d IIIHaemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名10屬名 種名 目前已發(fā)現(xiàn)600多種限制性內(nèi)切酶，分為三類。三、限制性內(nèi)切酶的類型限制性核酸內(nèi)切酶的分類分類依據(jù)1）依據(jù)識(shí)別序列與切割位點(diǎn)是否一致2）所需輔助因子分為三類：I型酶、II型酶、III型酶11目前已發(fā)現(xiàn)6

6、00多種限制性內(nèi)切酶，分為三類。三、限制性內(nèi)切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌 B株和 K株分離的。（1） 識(shí)別序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1. 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 如 EcoB EcoK未甲基化修飾的特異序列12首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）輔助因子在距離特異性識(shí)別序列上游約10001500 bp處隨機(jī)切開一條單鏈，兩條鏈上的切點(diǎn)相距7075bp，即末端為單鏈。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位點(diǎn)13需A

7、TP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）輔助因子I型酶：限制修飾系統(tǒng)酶異源多聚體，R、M、S分別為限制性內(nèi)切酶、甲基化酶、特異位點(diǎn)識(shí)別的活性。識(shí)別序列全甲基化-不識(shí)別識(shí)別序列半甲基化-甲基化作用識(shí)別序列未甲基化-限制性內(nèi)切酶作用識(shí)別序列與切割位點(diǎn)不一致，且切割位點(diǎn)隨機(jī)不定ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）14I型酶：限制修飾系統(tǒng)酶異源多聚體，R、M、S分別為限制性內(nèi)切2. 型限制性內(nèi)切酶 識(shí)別序列與切割位點(diǎn)不相一致切割位點(diǎn)相對固定反應(yīng)需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG152. 型限制

8、性內(nèi)切酶 識(shí)別序列與切割位點(diǎn)不相一致在基因工程識(shí)別雙鏈DNA分子中4 - 8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割（一致）序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)2. 類限制性內(nèi)切酶的基本特性 5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的識(shí)別序列EcoR I的切割位點(diǎn)16識(shí)別雙鏈DNA分子中4 - 8對堿基的特定序列2. 類限制EcoRI等產(chǎn)生的5-粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 退火 4-7 5 G-

9、C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 517EcoRI等產(chǎn)生的5-粘性末端5 G-C-T-G-A稀有切割限制酶（rare cutter）可以識(shí)別6個(gè)以上的核苷酸序列的少數(shù)的限制內(nèi)切酶。如Not I （GCGGCCGC）某些限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列中，某一個(gè)或兩個(gè)堿基并非嚴(yán)格專一。如Hind 可識(shí)別4種核苷酸序列： Y: C或T R: A 或GGTYRAC -35-18稀有切割限制酶（rare cutter）可

10、以識(shí)別6個(gè)以上的核EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 產(chǎn)生粘性末端EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 產(chǎn)生平齊末端（2）切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA，形成粘性末端（sticky end）或平齊末端（blunt end）。如：識(shí)別位點(diǎn)處19EcoR I 5-GAATTC-3 EcoR V 含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：GAATTC CTTAA GG AATTCCTTAAG5-33-55-33-51 粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 5端凸出（如EcoR I切點(diǎn)）20

11、含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：GAATTC CTTACTGCAG GACGTC5-33-55-33-5CTGCA G G ACGTC） 3端凸出（如Pst I切點(diǎn)）21CTGCAG GACGTC5-33-55-3i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個(gè)平齊末端容易得多。2 粘性末端的意義 連接便利22i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）B 末端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。A 末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行

12、32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。 末端標(biāo)記 補(bǔ)平成平齊末端23B 末端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如dA和3 平齊末端（blunt end）在識(shí)別序列的對稱軸上同時(shí)切割5-GATATC -33-5CTATAG 如EcoR V243 平齊末端（blunt end）在識(shí)別序列的對稱軸上同4 平齊末端的特點(diǎn)連接困難，連接效率低，只有粘性末端連接效率的1%，這種連接常出現(xiàn)多聯(lián)體連接。粘性末端與平齊末端連接的處理方法）添補(bǔ)法： 利用DNA聚合酶 (klenow fragment）將堿基添補(bǔ)到目的基因的粘性末端上。）削除(平)法 利用S1和Bal31等核酸酶將目的基因

13、粘性末端的單鏈突出部分削去，使其成為平齊末端254 平齊末端的特點(diǎn)連接困難，連接效率低，只有粘性末端連接不同來源的酶，識(shí)別相同的序列，切割方式相同或不同。識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同如Hind 和Hsu IHind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-55 同裂酶（Isoschizomer) 完全同裂酶：26不同來源的酶，識(shí)別相同的序列，切割方式相同或不同。識(shí)別位點(diǎn)和Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如Xma I 和 Sma I。 不完全同裂

14、酶：27Xma I 5-CCCGGG -3 識(shí)別位點(diǎn)相識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5BamH IBcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；Y代表嘧啶。6 同尾酶(Isocaudamers）28識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bg5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識(shí)別。5-G3-

15、CCTAGGATCT-3 A-5BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5BamH IBgl Sau 3A295-GATC-3 Sau 3A同尾酶的粘性末端互限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（*）活性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。 7 限制酶的酶活性 星號（*）活性30限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pHEcoR I和BamH I等都有*活性。在低鹽、高pH（8）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAAT

16、TCEcoR I：使用的時(shí)候要特別注意！731EcoR I和BamH I等都有*活性。在低鹽、高pH（8 誘發(fā)星號（*）活性的原因）高甘油含量）內(nèi)切酶用量過大）低離子強(qiáng)度）高pH）含有機(jī)溶劑，如乙醇）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二價(jià)陽離子的存在酶量不宜過多，盡量遵循生產(chǎn)商推薦的反應(yīng)條件32 誘發(fā)星號（*）活性的原因）高甘油含量酶量不宜過多，盡量在離它的不對稱識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。移動(dòng)切割（shifted cleavage):GACGCNNNNN Hga ICTGCGNNNNNNNNNN538s型限制性內(nèi)切酶33在離它的不對稱識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。

17、移動(dòng)切（3）型限制性內(nèi)切酶不具有甲基化功能型酶的甲基化修飾活性由相應(yīng)的甲基化酶承擔(dān)。它們識(shí)別相同的DNA序列，但功能不同。如 EcoR I限制性內(nèi)切酶和EcoR I甲基化酶前者：5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5后者：5-GAA*TTC-3 3-CTT*AAG-5作用的位點(diǎn)也不相同34（3）型限制性內(nèi)切酶不具有甲基化功能型酶的甲基化修飾活性（4） II型限制性內(nèi)切酶對單鏈DNA的切割定義為切割雙鏈DNA，但有一些還可以特異識(shí)別并切割單鏈DNA的相應(yīng)位點(diǎn)，只是切割效率比較低如：Hha切割單鏈DNA比切割雙鏈DNA效率低5035（4） II型限制性內(nèi)切酶對單鏈DNA的切割定義為切割雙鏈D核

18、酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性特性 類內(nèi)切酶類內(nèi)切酶類內(nèi)切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、 Mg2+和SAMMg2+ATP、 Mg2+和SAM寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC 回文序列（ s型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG36核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性特性 類內(nèi)切酶切割位點(diǎn)在距離識(shí)別位點(diǎn)至少1000bp處隨機(jī)切開一條單鏈位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近距寄主特異性位點(diǎn)3端2426bp處酶催轉(zhuǎn)換不能

19、能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別未甲基化的序列進(jìn)行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用用處不大37切割位點(diǎn)在距離識(shí)別位點(diǎn)至少1000位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近四、限制性內(nèi)切酶酶解反應(yīng)條件1. 標(biāo)準(zhǔn)酶解體系的建立 一個(gè)單位（U）的限制性內(nèi)切酶定義： 在合適的溫度和緩沖液中，在20l的反應(yīng)體系中，1h完全酶解1g-DNA所需要的酶量。推薦：稍過量的酶（2-5倍）和較長的反應(yīng)時(shí)間38四、限制性內(nèi)切酶酶解反應(yīng)條件1. 標(biāo)準(zhǔn)酶解體系的建立 2. 酶解過程 配酶解體系 混勻 反應(yīng)終止 酶解結(jié)果鑒定392. 酶解過程 配酶解體

20、系39 酶解體系一般20l，保證酶液體積不超過反應(yīng)總體積的10%前提下，盡量降低反應(yīng)總體積。加樣順序一般是：ddH2O buffer DNA 酶 40 酶解體系一般20l，保證酶液體積不超過反應(yīng)總體積的10大部分II 型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0 - 150 mMDTT1 mM0 - 50 mM 低鹽酶100 mM 中鹽酶150 mM 高鹽酶Volume20 - 100 mlT T37 1 - 1.5 hr41大部分II 型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl 混勻移液槍吹打或手指輕彈管壁若底物分子很大（如基因

21、組DNA），應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩?；靹蚝笪⒘扛咚匐x心機(jī)進(jìn)行短暫離心，使管壁液體全部下沉。42 混勻移液槍吹打或手指輕彈管壁若底物分子很大（如基因組DN反應(yīng)終止三種方法：）加乙二胺四乙酸（EDTA）至終濃度 10mmol/L; 加十二烷基硫酸鈉（SDS） 至終濃度0.1%(W/V)）65加熱20min或者70加熱10min）酚/氯仿抽提43反應(yīng)終止三種方法：）加乙二胺四乙酸（EDTA）至終濃度 酶解結(jié)果鑒定快速進(jìn)行微型瓊脂糖凝膠電泳觀察然后決定是否終止反應(yīng)44 酶解結(jié)果鑒定快速進(jìn)行微型瓊脂糖凝膠電泳44酶切后發(fā)現(xiàn)除了目的DNA條帶外，還有其它條帶酶存在“星號”活性，造成非特異性切割；不正確的操作，導(dǎo)致

22、其它內(nèi)切酶污染；底物DNA中可能存在其它DNA污染。電泳后電泳條帶擴(kuò)散，電泳條帶移動(dòng)距離異常 底物DNA不純；內(nèi)切酶不純；酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結(jié)合在一起使電泳條帶移動(dòng)距離異常45酶切后發(fā)現(xiàn)除了目的DNA條帶外，還有其它條帶酶存在“星號”活3. 限制性內(nèi)切酶對DNA分子的消化 1986年J.A. McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)型限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。CTTAAGGAATTC（1）內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合模式 463. 限制性內(nèi)切酶對DNA分子的消化 1986年J.A內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開12341234（2） 完全消化47內(nèi)切酶在DNA上的所有

23、識(shí)別位點(diǎn)都被切開12341234（2）只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度、增大反應(yīng)體積或減少酶量可達(dá)到局部消化的目的。123414（3） 局部消化48只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度、（4） 幾種常用限制酶識(shí)別位點(diǎn)49（4） 幾種常用限制酶識(shí)別位點(diǎn)4950504. 限制性內(nèi)切酶酶解反應(yīng)中的注意事項(xiàng) 大多數(shù)廠家供應(yīng)的限制內(nèi)切酶為濃縮液1U的酶液足以在1h內(nèi)消化10g DNA，酶和底物比例2-10U/ug DNA,避免使用過高的酶濃度 濃縮液使用前可用1限制酶緩沖液稀釋 限制性內(nèi)切酶在含50%的甘油的緩沖液 中，于-20穩(wěn)定保存514. 限制性內(nèi)切

24、酶酶解反應(yīng)中的注意事項(xiàng) 大多數(shù)廠家 酶分裝成小份，避免反復(fù)凍融 反應(yīng)中盡可能少加水，使反應(yīng)體積減到最低 通常增加反應(yīng)時(shí)間，可降低酶量52 酶分裝成小份，避免反復(fù)凍融 反應(yīng)中盡可能少加水，使反應(yīng)DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。1. DNA的純度 五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素純化DNA加大酶的用量，1ugDNA用10U酶延長保溫時(shí)間擴(kuò)大反應(yīng)體積（ 20l）一般采取53DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都需要合適的底物：底物（DNA）純度要高.不能含有RNA和蛋白質(zhì);也不能含有過高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他

25、有機(jī)試劑。DNA的濃度不宜過高，高濃度的DNA會(huì)使溶液的粘度增加從而抑制酶分子的擴(kuò)散導(dǎo)致酶切反應(yīng)不徹底。常為50ul內(nèi)含1ug DNA。54需要合適的底物：底物（DNA）純度要高.不能含有RNA和蛋白大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2. DNA的甲基化程度 DNA腺嘌呤甲基化酶（DNA adenine methylas ,dam) （修飾GATC中的A）；DNA胞嘧啶甲基化酶（DNA cytosine ethylas ,dcm)（修飾CCA/TGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木辍?5大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2. DNA的甲基化程度不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫

26、度不同。大多數(shù)是37 oC，少數(shù)要求40-65 oC。每微克DNA用15單位的酶，保溫12小時(shí)。 酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApa IBcl IMae IITaq I30505065Apy IBstE IIMae III306055Ban IMae ISma I5045253. 溫度 56不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 oC，少是影響限制酶活性的重要因素4. 緩沖液(Buffer) （1）緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強(qiáng)度Tris-HCl： 維持pH,大多數(shù)為7-7.6二硫蘇糖醇（DTT）： 防止酶氧化,保持酶穩(wěn)定性牛血清

27、白蛋白（BSA）等：中性蛋白質(zhì),防止酶在低 濃度的蛋白質(zhì)溶液中變性商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液57是影響限制酶活性的重要因素4. 緩沖液(Buffer) （2）兩種或兩種以上的酶切割DNA樣品 在相同的緩沖液中反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行 若需要不同的緩沖液,采用3種方法)先用要求低離子強(qiáng)度的酶切割（低鹽酶）,再加NaCl調(diào)節(jié) 離子強(qiáng)度,并用第二種酶切割（高鹽酶）；)先用一種酶切割,然后用2.5倍體積的乙醇沉淀酶解產(chǎn)物, 再重懸于另一種緩沖液中進(jìn)行第二種酶切割；)使用所有限制性酶的通用buffer,如KGB(谷氨酸鉀 buffer),經(jīng)適當(dāng)稀釋可達(dá)到各種限制性酶要求的buffer條件。58（2）兩種或兩

28、種以上的酶切割DNA樣品 在相同的緩沖液中反練習(xí)題何為限制性內(nèi)切酶？有哪些類型，各有什么作用和特點(diǎn)什么是限制性內(nèi)切酶的星號活性？受哪些因素影響？限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是 【 】 修復(fù)自身的遺傳缺陷 促進(jìn)自身的基因重組 強(qiáng)化自身的核酸代謝 提高自身的防御能力 補(bǔ)充自身的核苷酸消耗 59練習(xí)題何為限制性內(nèi)切酶？有哪些類型，各有什么作用和特點(diǎn)59從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié) DNA 連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口60從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接DNA連接酶:一種能夠

29、催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶1967年，世界上數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶。 61DNA連接酶:一種能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的（1）大腸桿菌連接酶1. 兩種共價(jià)連接DNA限制片段的DNA連接酶只能連接粘性末端，背景低，準(zhǔn)確性高二、DNA ligase的特點(diǎn)（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端；還能連接齊平末端62（1）大腸桿菌連接酶1. 兩種共價(jià)連接DNA限制片段的DNA（1）必須是兩條雙鏈DNA（2）DNA3端有游離的-OH， 5端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：

30、 NAD+2. 連接條件63（1）必須是兩條雙鏈DNA（2）DNA3端有游離的-OH，（4）DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50 - 100 mM，pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1 mMDTT5 mMVolume10 - 20 mlT T 4 - 15 ， 4 - 16 hr 1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15 反應(yīng) 1 小時(shí)，完全連接 1 mg l-DNA（Hind 片段）所需的酶量。64（4）DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50 - 1001. ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應(yīng)的機(jī)理2. AMP與連接酶形成共價(jià)“連接酶-AMP

31、”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi （NMN） 。3. AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi651. ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應(yīng)的機(jī)理4. AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一 條鏈的5端 P 上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP664. AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一-OH5. 3-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，釋放出AMP。675. 3-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，釋放出A連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。四、連接反應(yīng)

32、的溫度1. 最佳溫度但在37下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2. 實(shí)用溫度所以一般采用 416C68連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。四、連接反應(yīng)的溫度1. 最佳增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少同一個(gè)分子末端自我連接的現(xiàn)象。1. DNA末端的濃度五、影響連接反應(yīng)的因素1020倍2. 插入片段與載體的濃度比例 兩種構(gòu)型：線狀分子和環(huán)狀分子與DNA濃度及DNA分子長度相關(guān)69增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少同一個(gè)分子末端自我連接的現(xiàn)3. 反應(yīng)溫度黏性末端：1216平頭末端：10204. ATP濃度一般，ATP最適的終濃度為0.5mmol/L.ATP濃度高至5mmol/L，影響平頭末端的連接ATP濃度高至

33、7.5mmol/L，抑制粘性末端及平頭末端的連接。703. 反應(yīng)溫度黏性末端：12164. ATP濃度一般，A六、DNA連接的反應(yīng)體系酶切純化后的DNA片斷連接緩沖液DNA連接酶71六、DNA連接的反應(yīng)體系酶切純化后的DNA片斷71從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多。七、平頭雙鏈DNA片段的連接操作72從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接） 加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì) 加入10% PEG8000，促進(jìn)大分子之間

34、的有效作用 加入單價(jià)陽離子（NaCl），最終濃度150-200 mM提高平頭末端連接效率的方法包括：73加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接） 加大平頭末端底物第三節(jié) DNA聚合酶DNA聚合酶（DNA polymerase)能在引物和模板的存在下，把脫氧核糖多核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3OH末端，催化核苷酸的聚合作用.74第三節(jié) DNA聚合酶DNA聚合酶（DNA polymera一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2. Klenow fragment3. T7 DNA聚合酶4. T4 DNA聚合酶5. 修飾過的T7 DNA聚合酶6. 逆轉(zhuǎn)錄酶7.Taq DNA聚

35、合酶75一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶751. 共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3OH端2. 主要區(qū)別T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。761. 共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3OH端2. DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低無中低T4 DNA聚合酶高無中低T7 DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7 DNA聚合酶低無快高遺傳修飾

36、T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中Taq DNA聚合酶無有快高3. 常用DNA聚合酶的特性比較77DNA聚合酶35外53外切酶活性聚合速率持續(xù)能力三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1. 大腸桿菌DNA聚合酶 主要用來制備帶放射性標(biāo)記的DNA探針（32P標(biāo)記）。（1）大腸桿菌DNA聚合酶的性質(zhì)一條單鏈多肽53外切酶活性位于N端用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的53外切酶活性部分,就成為Klenow fragment。78三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1. 大腸桿菌DNA聚合酶 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 帶有3-OH游離端的引物 DNA模板（2

37、）DNA聚合酶I（Pol I）的反應(yīng)條件-OH53dNTPs79 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP標(biāo)記 核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補(bǔ)的待測序列雜交80標(biāo)記 核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異標(biāo)記已知序列的核酸片斷 探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5381標(biāo)記已知序列的核酸片斷 探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片 DNA聚合酶I 對探針序列的標(biāo)記切口平移法(nick translation )：放射性同位

38、素標(biāo)記：當(dāng)存在dNTP時(shí)，DNA聚合酶 I 同時(shí)具備53外切酶活性和53的聚合酶活性。82 DNA聚合酶I 對探針序列的標(biāo)記切口平移法(nick t53外切酶活性從DNA缺口的下一段DNA5端除去一個(gè)核苷酸后，聚合酶活性就會(huì)在缺口的上一段DNA的3一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。缺口缺口553353538353外切酶活性從DNA缺口的下一段DNA5端除去一個(gè)純化的DNA片斷DNase I制造單鏈缺口DNA Pol I進(jìn)行切口轉(zhuǎn)移一種-32P-dNTP和dNTPs555555553333333332P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標(biāo)記84純化的DNA片斷DNase I制造單鏈缺口DNA Pol

39、I2. Klenow fragment具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。（1）Klenow fragment的性質(zhì)DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草桿菌蛋白酶852. Klenow fragment具有53聚合酶活性 3端補(bǔ)平55klenow DNA 3末端標(biāo)記補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3隱蔽端。在3隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow（2）主要用途86 3端補(bǔ)平55klenow DNA 3末端標(biāo)記補(bǔ)3隱蔽末端的DNA片斷Klenow fragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種 -32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA限制性內(nèi)

40、切酶切5-G33-CTTAA55-GAA33-CTTAA55-GAATT33-CTTAA55-G33-CCTAG55-GG33-CCTAG55-GGATC33-CCTAG5EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h873隱蔽末端的DNA片斷Klenow fragment補(bǔ)平根 cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow533553引物88 cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA（1） T4 DNA聚合酶的性質(zhì)3. T4 DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化，由噬菌體基因43編碼。有53聚合酶活

41、性和35外切酶活性（降解單鏈更快）。 來源 酶活性89（1） T4 DNA聚合酶的性質(zhì)3. T4 DNA聚合酶從T 特點(diǎn)A 當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4 DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隱蔽端。B 如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。C 在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。90 特點(diǎn)A 當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4 DNA聚合酶行使3555335533T4 DNA聚合酶無dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs559155335533T4 DNA聚合酶無dNTP（2） T4 DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法或置換合成法）用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隱

42、蔽端、5隱蔽端）制造出3隱蔽端。再利用它的53聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的dNTP。 補(bǔ)平隱蔽末端 DNA 3末端標(biāo)記92（2） T4 DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法或置換合酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶（35外切） DNA酶切片斷T4 DNA聚合酶（53聚合）55335533553355335533內(nèi)切酶切無dNTPs93酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPsa. 放射性標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：制作簡單高比放射性放射自顯影效果好優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：半衰期短（32P只有14.3天）不易保存對人體有害要求在專門實(shí)驗(yàn)室操作94a. 放射性標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：制作簡單優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：半衰期短（32b. 非放射性標(biāo)記i）生物素標(biāo)記生物素（biotin），又稱維生素H、輔酶R可以與dNTP?；Y(jié)合成為biotin -1,6-dUTP、 biotin -1,4-dA