生物制藥工藝學(xué)10離子交換2011課件

1、第十章 離子交換法第一節(jié)離子交換層析基本原理第二節(jié)離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)與分類第三節(jié)離子交換動(dòng)力學(xué)第四節(jié)離子交換樹脂的性能 第五節(jié)離子交換的選擇性第六節(jié)離子交換操作方法第七節(jié) 離子交換劑第八節(jié)離子交換層析的應(yīng)用第九節(jié) 實(shí)例離子交換柱2離子交換反應(yīng)釜離子交換(ion exchange) 概念：利用離子交換樹脂作為吸附劑，將溶液中的待分離組分，依據(jù)其電荷差異，依靠庫侖力吸附在樹脂上，然后利用合適的洗脫劑將吸附質(zhì)從樹脂上洗脫下來，達(dá)到分離的目的。第一節(jié) 離子交換層析基本原理。 離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離

2、子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。+-anion exchange beadEquilibrationSample applicationand wash-+-Regeneration-+Sampleapplicationand washElutionEquilibrationRegeneration-+-第二節(jié) 離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)與分類功能基團(tuán):與載體共價(jià)結(jié)合的固定的活性基團(tuán)平衡離子:與功能基團(tuán)以離子鍵聯(lián)結(jié)的可移動(dòng)的活性離子不溶性載體:惰性的高分子固定骨架離子交換樹脂由三部分構(gòu)成 平衡離子帶正電荷的為陽離子交換樹脂，平衡離子為負(fù)離子者稱陰離子交換樹脂。具有三維空間立體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)骨架離子交換劑不溶性載體:

3、惰性的高分子固定骨架功能基團(tuán):與載體共價(jià)結(jié)合的固定的活性基團(tuán)平衡離子:與功能基團(tuán)以離子鍵聯(lián)結(jié)可移動(dòng)的活性離子平衡離子決定樹脂正負(fù)在介質(zhì)中帶正電的物質(zhì)用陽離子交換劑；帶負(fù)電物質(zhì)用陰離子交換劑。離子交換介質(zhì)的選擇原則+-等電點(diǎn)吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換劑pH pI（-） 蛋白質(zhì)凈電荷 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10pHpH大于等電點(diǎn)時(shí)，物質(zhì)帶負(fù)電荷，可以與陰離子交換劑進(jìn)行交換；pH小于等電點(diǎn)時(shí)，物質(zhì)帶正電荷，可以與陽離子交換劑進(jìn)行交換。 蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及氨基酸、核苷酸離子化曲線來選擇一、離子交換樹脂的分類陽離子樹脂的分類弱酸性樹脂：羧酸型樹脂和酚型樹脂（COOH

4、, ） ，在酸性環(huán)境中解離度受到抑制。中酸性樹脂：磷酸型樹脂（PO3H2 ）強(qiáng)酸型樹脂：功能基團(tuán)為磺酸根(SO3H)及甲基磺酸根(CH2SO3H)，有好的解離能力。 。陰離子樹脂的分類中強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂：兼有以上兩類活性基團(tuán)。 弱堿型陰離子交換樹脂：活性基團(tuán)為伯、仲、叔胺基。在堿性環(huán)境中解離度受到抑制。強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂：季胺- N+R3離子交換樹脂的命名：強(qiáng)酸類 1100號(hào)；弱酸類 101200；強(qiáng)堿類201300；弱堿類301400；中強(qiáng)酸類401500國內(nèi)常用樹脂命名：724；732；717國內(nèi)外離子交換樹脂相應(yīng)牌號(hào)對照704 = 3112717 = 2017732 = 00177

5、11 = 2014703 = D311HD42 = 001Amberlite IR系列Zerolit 系列 神膠系列常用離子交換樹脂特性表 28強(qiáng)酸性樹脂離子交換樹脂的性能 30第 三節(jié) 離子交換動(dòng)力學(xué)1、A+從溶液擴(kuò)散到樹脂表面，因要通過水膜，稱作膜擴(kuò)散。2、A+從樹脂顆粒表面擴(kuò)散到交換中心稱粒子擴(kuò)散。“慢”3、離子A+與平衡離子B-交換，相當(dāng)于與樹脂發(fā)生復(fù)分解反應(yīng)，速度極快；4、B+從交換中心擴(kuò)散到粒子表面；“慢”5、B+再擴(kuò)散到溶液中。 其中4、5為1、2的逆過程。1、樹脂粒度 樹脂粒度大交換速度慢。2、攪拌速度 攪拌速度能影響膜擴(kuò)散速度，與交換速度呈正相關(guān)。攪拌速度增大到一定程度后影響

6、漸小。3、樹脂交聯(lián)度 交聯(lián)度大則樹脂孔徑小，離子運(yùn)動(dòng)阻力大，交換速度低。4、溫度 交換體系溫度高時(shí)由于離子擴(kuò)散加快，交換速度也加快，但必須考慮到生化物質(zhì)對溫度的穩(wěn)定性。離子交換速度的影響因素5、離子半徑和離子價(jià) 離子水合半徑增大，交換 速度下降，大分子在樹脂中的擴(kuò)散速度特別慢。6、離子濃度 交換體系如為稀溶液，交換速度隨離子濃度的上升而加快。但達(dá)到一定濃度后，交換速度不再隨濃度上升。1、交換容量盡可能大，經(jīng)濟(jì)、高效。2、有良好的交換選擇性 。3、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。經(jīng)酸、堿、鹽及有機(jī)溶劑作用不發(fā)生理化性質(zhì)改變和分解。4、化學(xué)動(dòng)力學(xué)性能好。交換速度快，可逆性好，易平衡、洗脫、再生；交換速率高，便于反復(fù)

7、用。5、物理性能好。顆粒大小合適，粒度均勻，比重適宜，且有一定的強(qiáng)度，這樣不但有利于操作，交換效果也較好。第四節(jié) 離子交換樹脂的性能離子交換樹脂的基本要求1、功能基團(tuán)性質(zhì)和數(shù)目，其數(shù)目是其交換容量的基礎(chǔ)。2、樹脂的交聯(lián)度。3、樹脂骨架和平衡離子。樹脂性能的影響因素1、含水量 含水量實(shí)質(zhì)上是顆粒內(nèi)部網(wǎng)格上存在的溶漲水。樹脂含水量的測定能間接測定樹脂的交聯(lián)度。測定方法：干燥法通過樹脂在105下烘干前后的重量加以計(jì)算求得。 離心法是將樹脂在400g離心力作用下離心30分鐘甩去溶漲水。主要理化常數(shù)的測定2、膨脹度 取一定量風(fēng)干樹脂放入量筒，加水或緩沖液振搖24h，測量前后體積之變化即可求得樹脂在該介質(zhì)

8、中的膨脹系數(shù)K膨脹。 K膨脹系數(shù)與交聯(lián)度的關(guān)系；1.硫酸基樹脂(H型)；2.硫酸基樹脂(Na型)；3.羧基樹脂(H型)；4.弱堿樹脂(Cl型)3、交換容量及測定方法陽離子交換樹脂（氫型）的測定方法：一定量樹脂中加入NaOH溶液，一天或數(shù)天后測定NaOH剩余量，從消耗的堿量求交換容量。陰離子交換樹脂（氯型）的測定方法：一定量樹脂裝柱，用過量Na2SO4溶液進(jìn)行離子交換，測定流出液中氯離子總量，求交換容量。 交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進(jìn)行交換的能力。交換容量是樹脂最重要的特征參數(shù)，單位是meq/g樹脂。還有一種體積交換容量即meq/ml濕樹脂離子的化合價(jià)

9、與水合半徑的影響 一般而言，電荷效應(yīng)越強(qiáng)的離子與樹脂的親和力越大，決定電荷效應(yīng)的主要因素是價(jià)電數(shù)和離子半徑。對同價(jià)陽離子來說，往往原子序數(shù)增大，水合離子半徑減小。 H+=Li+Na+K+=NH4+ Rb+ Cs+ Ti+. Mg2+=Zn2+ Cu2+Ni2+Co2+Ca2+. Ac-F-OH-HCOO-Cl-SCN-Br-. 第五節(jié) 離子交換的選擇性1、溶液的pH 對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性樹脂，溶液pH決定它帶何種電荷及電荷量，從而可知它是否被樹脂吸附或吸附的強(qiáng)弱。 對弱酸、弱堿性樹脂，溶液pH是影響樹脂解離程度和吸附能力的重要因素；還應(yīng)特別注意，過強(qiáng)的吸附及劇烈的洗脫條件會(huì)增加變性失活的機(jī)會(huì)。交換環(huán)

10、境的影響2、離子強(qiáng)度 一般在保證目的蛋白質(zhì)的溶解度和溶液緩沖能力的前提下，盡可能采用低離子強(qiáng)度。 高的離子濃度必與目的物離子進(jìn)行競爭，減少有效交換容量離子的存在會(huì)增加蛋白質(zhì)以及樹脂活性基團(tuán)的水合作用，降低吸附選擇性和交換速度， 水合離子半徑：半徑越小，親和力越大；離子化合價(jià)：高價(jià)離子易于被吸附；有機(jī)溶劑：不利于吸附；樹脂與粒子間的輔助力：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等輔助力；3.其他影響第六節(jié) 離子交換操作方法 一、樹脂的選擇當(dāng)目的物具有較強(qiáng)堿性和酸性時(shí)，宜選用弱酸性弱堿性的樹脂目的物是弱酸性或弱堿性的小分子物質(zhì)時(shí)，宜選用強(qiáng)酸強(qiáng)堿樹脂（氨基酸的分離）。蛋白質(zhì)、酶和其它生物大分子的分離多采用

11、弱堿或弱酸性樹脂，減少生物大分子的變性，利于洗脫，提高選擇性。 43 二、樹脂的處理和再生1、外觀特征：透明或半透明；顆粒圓整，粒度均勻，強(qiáng)度。2、樹脂的預(yù)處理（1）物理處理：去雜，過篩。（2）化學(xué)處理：用8-10倍的1mol/L 鹽酸或氫氧化鈉溶液交替浸泡。 44氨基酸分離前樹脂的處理樹脂的再生 樹脂再生：使用過的樹脂重新獲得使用性能的處理過程。 再生過程：（1）去雜，大量水沖洗，除去物理吸附的雜質(zhì)；（2）用酸、堿處理除去與功能基團(tuán)結(jié)合的雜質(zhì)； (3) 轉(zhuǎn)型。46 1、適量水浸泡，漂洗，使之充分溶漲； 2、數(shù)十倍的0.5mol/L氫氧化鈉液反復(fù)浸泡 0.5-1h，每次換液皆須用水洗至近中性；

12、 3、按交換的需要用平衡離子處理； 4、最后以交換用緩沖夜平衡備用。離子交換纖維素的再生：轉(zhuǎn)型和毒化 樹脂轉(zhuǎn)型：按照使用要求人為地賦與平衡離子的過程。對于弱酸或弱堿性樹脂須用堿(NaOH)或酸(HCl）轉(zhuǎn)型。樹脂毒化：是指樹脂失去交換性能后不能再用一般的再生手段重獲交換能力的現(xiàn)象。如大分子有機(jī)物或沉淀物嚴(yán)重堵塞孔隙，活性基團(tuán)脫落，生成不可逆化合物等。不同類型樹脂的處理和轉(zhuǎn)型49三、基本操作方法交換吸附：靜態(tài)交換 動(dòng)態(tài)交換；洗脫方式：分靜態(tài)洗脫及動(dòng)態(tài)洗脫兩種，pH及離子強(qiáng)度改變；洗脫液：酸、堿、鹽。酸、堿洗脫液旨在改變吸附物的電荷或改變樹脂吸附基團(tuán)的解離狀態(tài)，以消除靜電結(jié)合力，迫使目的物被釋放出

13、來；鹽類洗脫液是通過高濃度的同種電荷的離子與目的物競爭樹脂上的活性基團(tuán)，使吸附物解離。 1、大孔樹脂 稱大網(wǎng)格樹脂。該類樹脂制造時(shí)先在聚合物原料中加進(jìn)一些不參加反應(yīng)的填充劑（致孔劑）。樹脂成形后再將其除去，這樣在樹脂顆粒內(nèi)部形成了相當(dāng)大的孔隙。2、均孔樹脂 主要是陰離子交換樹脂。均孔型樹脂也是凝膠型樹脂。骨架的交聯(lián)度比較均勻。該類樹脂代號(hào)為IP或IR。 第七節(jié) 離子交換劑二、多糖基離子交換劑 采用生物來源穩(wěn)定的高聚物多糖作載體時(shí)才能滿足分離生物大分子的全部要求。 根據(jù)載體多糖種類的不同，多糖基離子交換劑可分為離子交換纖維素和葡聚糖離子交換劑兩大類。在介質(zhì)中帶正電的物質(zhì)用陽離子交換劑；在介質(zhì)中帶

14、負(fù)電物質(zhì)用陰離子交換劑。 實(shí)驗(yàn)室中最常用的交換劑有：DEAE-C、CM-C、 或DEAE-Sephadex，CM-Sephadex1、離子交換纖維素常用的離子交換纖維素有甲基磺酸纖維素、羧甲基纖維素(CMC)、二乙基氨基乙基纖維素(DEAE) 葡聚糖凝膠離子交換劑是將活性交換基團(tuán)連接于葡聚糖凝膠上制成的各種交換劑，所以兼有分子篩的作用。特點(diǎn)： 1）對生物大分子的變化性作用小。2）具有離子交換和分子篩的雙重作用，對生物分子有很高的分辯率。3）多用于蛋白質(zhì)、多肽類生化藥物的分離。2、葡聚糖凝膠離子及瓊脂糖凝膠離子交換劑第八節(jié) 離子交換層析的應(yīng)用1.水處理；2.分離純化小分子物質(zhì)；3.分離純化生物大

15、分子物質(zhì)。常用于蛋白質(zhì)提取分離的離子交換劑要求：良好的親水性、具有較大的均勻網(wǎng)格結(jié)構(gòu)、粒度越小分辨率越高種類：多糖類 離子交換纖維素 交聯(lián)葡聚糖 交聯(lián)瓊脂糖 聚乙烯醇類 Mono系列 Amersham Pharmacia 第九節(jié) 實(shí)例 分離尿激酶的路線調(diào)pH5.8-6.0，加724樹脂攪拌吸附，靜置后虹吸。以2NH4OH含M Nacl溶液洗脫兩次，合并洗脫液。男性尿上清（棄去）迅速降溫至10攝氏度以下，調(diào)pH9.0，靜置后虹吸。沉淀（棄去）上清樹脂（吸附尿激酶）上清（棄去）以0.05MpH6.4磷酸鈉緩沖液洗凈一次，以0.10MpH6.4磷酸鈉緩沖液再洗凈一次，虹吸。上清（棄去）樹脂（吸附尿激酶）洗脫液樹脂（再生）加固體硫酸銨使其達(dá)0.60飽和度。調(diào)pH3.0,在0-2攝氏度沉淀6-7小時(shí)，紙漿過濾。沉淀（尿激酶粗品）粗制路線精制路線（一）調(diào)pH6.4，經(jīng)DEAE纖維素柱排它層析。加43的硫酸銨在0-2攝氏度沉淀過濾。尿激酶粗品濾餅以溶解液溶解后，紙漿過濾。不溶物（棄去）濾液柱吸附部分（棄去）流出液沉淀濾液（棄去）溶于（pH9.2)0.01M甘氨酸緩沖液中，并對此緩沖液透