五 核酸雜交 w課件

1、核酸分子雜交技術(shù) 遺傳學與分子生物學系 李信民 53720094431 核酸分子雜交（nucleic acid hybridization） 指具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。 不同來源的DNA或RNA單鏈在一定條件下重新組成的新的雙鏈分子雜交分子。 2第一節(jié) 核酸雜交的基本理論一、變性與復性 3 DNA的變性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵斷裂，使規(guī)則有序的雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則無序的單鏈線團樣結(jié)構(gòu)的過程。4解鏈溫度（融解溫度，Tm）(melting temperature)：使50%的DNA發(fā)生變性時的環(huán)境

2、溫度。DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈是在一個相當窄的溫度內(nèi)完成的。5DNA的復性（renaturation)： 在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可再恢復成天然的雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，此過程稱為退火(annealing)。7減色效應(yīng)：變性DNA復性后對260nm紫外光吸收減少的現(xiàn)象。82. 影響復性的因素 序列簡單的分子復性快，如poly(dT)和poly(dA)識別快 DNA片段愈大，擴散速度愈低，復性慢 離子強度有利于復性 DNA濃度復性 Tm值的估算 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% 10核酸雜交：不同來源的兩條核酸單鏈由于具有互補序列，

3、在一起復性時，互補序列配對，形成雜化分子。+1112二、影響雜交的因素 1. 核酸分子的濃度和長度 2. 溫度：比Tm低2530較適宜3. 離子強度：離子強度雜交反應(yīng)率 14 4. 雜交液中的甲酰胺 甲酰胺能降低核酸雜交的Tm，含30%50%甲酰胺的雜交溶液溫度能降低到3042。 使用甲酰胺的優(yōu)點： 低溫下探針更穩(wěn)定； 能更好地保留非共價結(jié)合的核酸。15第二節(jié) 核酸探針 一、探針的選擇原則 1. 高度的特異性 2. 制備探針的難易性和檢測手段的靈敏性 二、探針的種類 171. 基因組DNA探針從基因組DNA文庫中選取某一基因片段 與載體連接（質(zhì)粒、噬菌體） 克隆(PCR擴增)酶切優(yōu)點：無性繁殖

4、、制備方法簡單；不易降解（與RNA比較）；標記方法成熟。 182. cDNA探針（complementary DNA） S1核酸酶切平兩端優(yōu)點：不含內(nèi)含子及高度重復序列但不易獲得 載體連接克隆通過逆轉(zhuǎn)錄雙鏈cDNA加接頭限制酶 粘性末端193. RNA探針：檢測DNA和mRNA 優(yōu)點：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性 雜交較少,未雜交探針可用RNase 降解，減少本底的干擾。 缺點：易降解，標記方法復雜 204. 寡核苷酸探針 優(yōu)點：可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列； 探針短,序列復雜性低,分子量小，因此雜交時間短;長 度只有1050b，該識別序列內(nèi)1個堿基的變化可明顯降低雜交Tm值。 可大量合成，價格低

5、，能夠用酶學或化學方法進行非放射性標記。 21三、探針設(shè)計原則： 長度：1050b 堿基成分:G+C含量為40%60% 探針分子內(nèi)無互補序列。 避免同一堿基重復出現(xiàn)。 一旦選定某一序列后，尚需與已知的各種基因序列進行同源性比較，與非靶區(qū)域的同源性不應(yīng)超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基同源。222. 特性： 檢測特異性強；靈敏度高；對酶促反應(yīng)無任何影響，也不影響堿基配對的特異性和穩(wěn)定性；易造成放射性污染；半衰期短的同位素應(yīng)用受到限制，隨用隨標記，立即使用，不能長時間存放。243. 探針標記的方法 缺口平移法（nick刻痕 translation移動）實質(zhì)：用-32PdNTP取代原來DNA鏈中不帶

6、同位素的同種核苷酸，生成的兩條鏈均被同位素標記。25隨機引物法（random priming）人工合成的68個核苷酸長的各種不同排列順序的混合物，它們可以隨機地互補到DNA探針的某一處，作為引物，在Klenow片段作用下，合成與探針DNA互補的DNA鏈，當在反應(yīng)液中加入-32PdATP時，即可形成放射性同位素標記的DNA探針，但探針DNA序列是長短不等的。優(yōu)點：比活度高，結(jié)果穩(wěn)定2728用T4多核苷酸激酶標記DNA5末端 5-pCpGpApCpG-3 堿性磷酸酶(AKP） 5-HOCpGpApCpG-3 -32PATPT4噬菌體多核苷酸激酶（PNK） 5-32PCpGpApCpG-3 29Kl

7、enow片段快速標記DNA探針末端 用枯草桿菌蛋白酶切割可得兩條多肽鏈 N C53外切酶 35外切酶 53聚合酶 小片段(36000) Klenow片段（67000） 3CTTAAG55GAATTC3EcoR 5G AATTC3 3CTTAA G5 Klenow, dNTP,-32PdATP 5GAATT AATTC3 3CTTAA TTAAG5 30（二）常用的非放射性標記 方法：1.酶標記法 2.化學標記法優(yōu)點：無環(huán)境污染，可較長時間貯存要求：標記物應(yīng)具有耐熱、對組織細胞無特異親和性、分子量小，對探針雜交無影響或影響甚小，不影響DNA三維空間構(gòu)象的形成。常用的標記物：生物素（biotin）

8、、地高辛（digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、補骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）311. 生物素標記核酸探針Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。2. 地高辛（Dig）標記核酸探針32333435第三節(jié) 核酸分子雜交技術(shù) 一、類型：根據(jù)反應(yīng)環(huán)境分為1.固相雜交：將需要雜交的一條核酸鏈先固定 在固體支持物上，另一條核酸 鏈游離在液體中。2.液相雜交：參與反應(yīng)的兩條核酸鏈都游 離在液體中。36二、固體支持物種類硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠、微孔板等。選擇原則： 具

9、有較強的結(jié)合核酸的能力； 與核酸的結(jié)合比較穩(wěn)定 盡量少的非特異性吸附37三、常用固相雜交類型Southern印跡雜交、Northern印跡雜、菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、組織原位雜交、夾心雜交等。3839純化的待測DNA樣品 瓊脂糖凝膠電泳分離酶切DNA片段 凝膠上變性DNA中和 DNA轉(zhuǎn)印至NC膜 預雜交 限制性內(nèi)切酶酶切后（EDTA，65滅活限制酶） 變性液（堿變性） Tris緩沖液 高鹽下 烘干、固定 雜交 放射自顯影 結(jié)果分析 1. Southern 印跡雜交主要步驟：40電泳+虹吸 最快幾秒鐘即可完成41southern印跡載體凝膠吸水紙緩沖液濾紙固定到載體422. Northern印跡雜交 是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到NC膜上的方法。與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western blotting。3. 斑點雜交（dot blot ）(線狀圓形)434.原位雜交（in situ hybridization雜化） 直接用探針與細胞或組織切片中的核酸雜交。應(yīng)用：1）觀察基因在組織中的表達 2）確定基因在染色體中的定位445. 菌落原位雜交（colony situ hybridiz