細(xì)菌的常用生化試驗課件

細(xì)菌的常用(chánɡyònɡ)生化試驗細(xì)菌(xìjūn)室第一頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗23種細(xì)菌鑒定常用(chánɡyònɡ)生化試驗

1.碳水化合物的代謝試驗（1）糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗（2）氧化一發(fā)酵試驗（O／F試驗）（3）β-半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）（4）七葉苷水解試驗（5）甲基紅試驗（6）V-P試驗2.蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗（1）明膠液化試驗（2）吲哚（靛基質(zhì)）試驗（3）硫化氫試驗

）尿素分解試驗（5）苯丙氨酸脫氨酶試驗（6）氨基酸脫羧酶試驗3.碳源和氮源利用試驗（1）枸櫞酸鹽利用試驗（2）丙二酸鹽利用試驗4.各種酶類試驗（1）氧化酶試驗（2）過氧化氫酶試驗（觸酶試驗）（3）硝酸鹽還原(huányuán)試驗（4）脂酶試驗（5）卵磷脂酶試驗（6）DNA酶試驗（7）凝固酶試驗（8）CAMP試驗第二頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗一、碳水化合物的代謝(dàixiè)試驗原理由于細(xì)菌各自具有不同的酶系統(tǒng)，對糖的分解能力不同，有的能分解某些(mǒuxiē)糖產(chǎn)生酸和氣體，有的雖能分解糖產(chǎn)生酸，但不產(chǎn)生氣體，有的則不分解糖。據(jù)此可對分解產(chǎn)物進(jìn)行檢測從而鑒別細(xì)菌。具體試驗有：①糖類發(fā)酵試驗；②葡萄糖代謝類型鑒別試驗；③七葉苷水解試驗；④淀粉水解試驗；⑤甲基紅試驗；⑥V-P試驗；⑦β-半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）。第三頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗1.糖（醇、苷）類發(fā)酵(fājiào)試驗原理：由于各種細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖（醇、苷）類的酶，故分解糖類的能力各不相同，細(xì)菌分解糖類后的終末產(chǎn)物亦不一致，有的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，有的僅產(chǎn)酸，故可利用此特點以鑒別細(xì)菌。方法：將分離的純種細(xì)菌，以無菌操作接種到糖（醇、苷）類發(fā)酵培養(yǎng)(péiyǎng)基中，置培養(yǎng)(péiyǎng)箱中培養(yǎng)(péiyǎng)數(shù)小時至兩周后，觀察結(jié)果。結(jié)果：若能分解培養(yǎng)基中的糖（醇、苷）類產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)。若產(chǎn)氣可使液體培養(yǎng)基中倒管內(nèi)或半固體培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)氣泡，固體培養(yǎng)基內(nèi)有裂隙等現(xiàn)象。若不分解，培養(yǎng)基中除有細(xì)菌生長外，無任何其他變化。應(yīng)用：是鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗，特別對腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要。第四頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗2.氧化-發(fā)酵(fājiào)試驗（0/F試驗）原理：不同細(xì)菌對不同的糖分解能力及代謝產(chǎn)物不同，這種能力因是否有氧氣的存在而異，有氧條件下稱為氧化，無氧條件下稱為發(fā)酵。方法：將待檢菌同時穿刺(chuāncì)接種兩支HL培養(yǎng)基，其中一支培養(yǎng)基滴加無菌的液體石蠟（或其他礦物油），高度不少于lcm。將培養(yǎng)基于35℃培養(yǎng)48h或更長。結(jié)果：應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別，前者是發(fā)酵型，后者是氧化型。發(fā)酵(fājiào)型（產(chǎn)酸）氧化型產(chǎn)堿型第五頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗3.β-半乳糖苷酶試驗(shìyàn)（ONPG試驗(shìyàn)）原理

細(xì)菌分解乳糖依靠兩種酶的作用，一種是β—半乳糖苷透性酶，它位于細(xì)胞膜上，可運送乳糖分子滲入(shènrù)細(xì)胞。另一種為β-半乳糖苷酶，亦稱乳糖酶，位于細(xì)胞內(nèi)，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述兩種酶的細(xì)菌，能在24—48h發(fā)酵乳糖，而缺乏這兩種酶的細(xì)菌，不能分解乳糖。方法：從克氏雙糖鐵培養(yǎng)基上取菌，于0.25ml無菌生理鹽水中制成菌懸液，加入一滴甲苯并充分振搖，使酶釋放。將試管置37℃水浴5min，加入0.25mlONPG試劑，水浴20min～3h觀察結(jié)果。結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng)，一般在20～30min內(nèi)顯色。應(yīng)用：迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗為陽性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本實驗主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。第六頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗4.七葉苷水解(shuǐjiě)試驗原理方法：將待檢菌接種于七葉苷培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)楹谏珵殛栃裕蛔兩邽殛幮?。?yīng)用：主要(zhǔyào)用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性。第七頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗5.甲基紅試驗(shìyàn)原理：腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸(rǔsuān)，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。方法：將待檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～4d，于培養(yǎng)基內(nèi)加入甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果。結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽性；橘紅色為弱陽性；黃色為陰性。應(yīng)用：主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。腸桿菌科中沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬等為陽性，而腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬則為陰性。第八頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗6.V-P試驗(shìyàn)原理方法：將待檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)48h后加入甲液（6%α-萘酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液），振搖。結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性；如無紅色出現(xiàn)且于35℃4h后仍如故者即為陰性。應(yīng)用(yìngyòng)：本試驗常與甲基紅試驗一起使用，因為前者陽性的細(xì)菌，后者通常為陰性。第九頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝(dàixiè)試驗原理：不同種類的細(xì)菌分解蛋白質(zhì)的能力(nénglì)不同。細(xì)菌對蛋白質(zhì)的分解，一般先由胞外酶將復(fù)雜的蛋白質(zhì)分解為短肽（或氨基酸），滲入菌體內(nèi)，然后再由胞內(nèi)酶將肽類分解為氨基酸。具體試驗有：①明膠液化試驗；②吲哚試驗（靛基質(zhì)試驗）；③硫化氫試驗；④尿素酶試驗；⑤苯丙氨酸脫氨酶試驗；⑥氨基酸脫羧酶試驗。第十頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗1.明膠液化試驗(shìyàn)原理方法：將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于22℃培養(yǎng)7d，逐日觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒別，如沙雷菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、陰溝桿菌等可液化明膠，而其他細(xì)菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱(cuìruò)類桿菌等也能液化明膠。另外多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。第十一頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗

2.吲哚(yǐnduǒ)（靛基質(zhì)）試驗原理方法：將待檢菌接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)24～48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑。結(jié)果(jiēguǒ)：于兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。第十二頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗3.硫化氫試驗(shìyàn)原理方法：將待檢菌穿刺(chuāncì)接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮?。?yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。如沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬細(xì)菌，絕大多數(shù)硫化氫陽性，其他菌屬陰性。沙門菌屬中也有硫化氫陰性菌種。第十三頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗4.尿素(niàosù)分解試驗原理方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)l8～24h觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮?。?yīng)用：主要(zhǔyào)用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽性。另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性第十四頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗5.苯丙氨酸脫氨酶試驗(shìyàn)原理方法：將被檢菌濃厚接種于苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于35℃培養(yǎng)l8～24h，滴加10%三氯化鐵試劑3～4滴，自斜面上方流下。結(jié)果：出現(xiàn)綠色為陽性。應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長反應(yīng)時問會引起褪色。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定(jiàndìng)。變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和摩根菌屬細(xì)菌均為陽性，腸桿菌種中其他細(xì)菌均為陰性。第十五頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗6.氨基酸脫羧酶試驗(shìyàn)原理方法：將被檢菌分別接種于賴氨酸（或鳥氨酸或精氨酸）培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基中，并加入無菌液體石蠟或礦物油，于35℃培養(yǎng)l～4d，每日觀察結(jié)果。結(jié)果：對照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色（指示劑為溴甲酚紫）為陽性，若測定管呈黃色為陰性。若對照管呈現(xiàn)紫色則試驗無意義(yìyì)，不能作出判斷。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。如沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其余沙門菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。第十六頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗第十七頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗三、碳源和氮源利用(lìyòng)試驗1.枸櫞酸鹽利用試驗原理：某些細(xì)菌能以銨鹽為唯一氮源，并且利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽，使培養(yǎng)基變堿性。方法：將被檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)l～4d，每日觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性；應(yīng)用：用于腸桿菌(gǎnjūn)科中菌屬間的鑒定。在腸桿菌科中埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常為陽性。第十八頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗2.丙二酸鹽利用(lìyòng)試驗原理：有的細(xì)菌可利用丙二酸鹽作為唯一碳源，將丙二酸鹽分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。方法：將被檢菌接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性，顏色無變化為陰性。應(yīng)用(yìngyòng)：腸桿菌科中屬間及種的鑒別?？死撞鷮贋殛栃?，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬中有些菌種也呈陽性，其他菌屬均為陰性。第十九頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗四、酶類試驗(shìyàn)1.氧化酶試驗原理：氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。方法：常用方法有三種；菌落法：直接滴加試劑于被檢菌菌落上。濾紙法：取潔凈濾紙一小塊，沾取菌少許，然后加試劑。試劑紙片法：將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。結(jié)果：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈深紫色，為陽性。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照。應(yīng)用：主要用于腸桿菌(gǎnjūn)科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細(xì)菌也呈陽性反應(yīng)。第二十頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗2.過氧化氫(ɡuòyǎnɡhuàqīnɡ)酶試驗（觸酶試驗）原理方法(fāngfǎ)：取槽置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，然后加3%過氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3%過氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。結(jié)果：有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。應(yīng)用：革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，而鏈球菌屬為陰性，故此試驗常用于革蘭陽性球菌的初步分群。注意事項①3%H2O2溶液要新鮮配制。②不宜用血瓊脂平板上生長的菌落，因紅細(xì)胞含有觸酶，可致假陽性反應(yīng)。③取對數(shù)生長期的細(xì)菌。第二十一頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗3.硝酸鹽還原(huányuán)試驗原理：在合成過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其他含氮化合物；在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。能使硝酸鹽還原的細(xì)菌從硝酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其他還原性產(chǎn)物。方法：被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)l～4d。將甲（對氨基苯磺酸0.8g+5mol／L醋酸lOOml）、乙液（α-奈胺0.5g+5mol/L醋酸lOOml）等量混合后（約0.1ml）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果。結(jié)果：出現(xiàn)紅色(hóngsè)為陽性。應(yīng)用：本試驗在細(xì)菌鑒定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮氣。第二十二頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗4.脂酶試驗(shìyàn)原理：有的細(xì)菌產(chǎn)生脂酶，可分解脂肪成游離的脂肪酸。從而使培養(yǎng)基中與脂肪結(jié)合形成無色化合物的維多利亞藍(lán)釋放出來，呈現(xiàn)深藍(lán)色。方法：將被檢菌接種于脂酶培養(yǎng)基（含維多利亞藍(lán)）中，于37℃培養(yǎng)24h結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色為陽性，陰性為粉紅色或無色。應(yīng)用：主要用于厭氧菌的鑒別。類桿菌屬中的中間(zhōngjiān)類桿菌產(chǎn)生脂酶，其他類桿菌則陰性；芽胞梭菌屬中產(chǎn)芽胞梭菌、肉毒梭菌和諾維梭菌也有此酶，而其他梭菌陰性。第二十三頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗5.卵磷脂酶試驗(shìyàn)原理：有的細(xì)菌產(chǎn)生卵磷脂酶（α-毒素），在鈣離子存在時，此酶可迅速(xùnsù)分解卵磷脂，生成渾濁沉淀狀的甘油酯和水溶性磷酸膽堿。方法：將被檢菌劃線接種或點種于卵黃瓊脂平板上，于35℃培養(yǎng)3～6h。結(jié)果：若3h后在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)，即為陽性，6h后混濁環(huán)可擴(kuò)展至5～6mm。應(yīng)用：主要用于厭氧菌的鑒定。產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾維梭菌產(chǎn)生此酶，其他梭菌為陰性。第二十四頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗6.DNA酶試驗(shìyàn)原理：某些細(xì)菌產(chǎn)生DNA酶，可使長鏈DNA水解成寡核苷酸鏈。因為長鏈DNA可被酸沉淀，寡核苷酸鏈則溶于酸，所以當(dāng)在菌落平板上加入酸后，會在菌落周圍(zhōuwéi)出現(xiàn)透明環(huán)。方法：將被檢菌點種于0.2%DNA瓊脂平板上，于35℃培養(yǎng)l8～24h，然后用lmol/L鹽酸覆蓋平板，觀察結(jié)果。結(jié)果：在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽性，無透明環(huán)為陰性。應(yīng)用：在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶，故本試驗可用于細(xì)菌的鑒別。第二十五頁，共二十九頁。細(xì)菌的常用生化試驗7.凝固(nínggù)酶試驗原理方法：1）玻片法：取兔血漿和鹽水各一滴，分別置于潔凈的玻片上，挑取被檢菌分別與血漿和鹽水混合。2）試管法：取試管2支，各加0.5ml人或兔血漿，挑取被檢菌和陽性對照菌分別加入血漿中并混勻，于37℃水浴3～4h。結(jié)果：玻片法以血漿中有明顯的顆粒出現(xiàn)而鹽