56 氨基酸、蛋白質(zhì)的性質(zhì)

5.6氨基酸、蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜さ鞍踪|(zhì)的化學(xué)性質(zhì)。掌握蛋白質(zhì)的鑒別方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是含氮的復(fù)雜生物高分子，是由各種L構(gòu)型的a氨基酸通過(guò)肽鍵相連而成的多聚物，并且具有穩(wěn)定的構(gòu)象。在酸、堿或酶的作用下，單純蛋白質(zhì)發(fā)生水解，其最終產(chǎn)物是a氨基酸。呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)中的某些氨基酸的特殊基團(tuán)可以與特定的化學(xué)試劑作用呈現(xiàn)出各種顏色，這種呈色反應(yīng)可以作為蛋白質(zhì)或氨基酸的定性檢驗(yàn)和定量測(cè)定的依據(jù)。茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)是蛋白質(zhì)中的a氨基酸與茚三酮水合物在溶液中共熱生成藍(lán)紫色化合物羅曼紫(Ruhemann^spurple)的反應(yīng)。UH |該反應(yīng)非常靈敏，是所有a氨基酸共有的特征性反應(yīng)。可根據(jù)a氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成化合物的顏色深淺程度以及釋放出C02的體積定量測(cè)定氨基酸。米倫反應(yīng)米倫(millon)反應(yīng)也是蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)之一。該反應(yīng)是米倫試劑與含酚羥基蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)，可用于鑒別蛋白質(zhì)中酪氨酸的存在。蛋白黃反應(yīng)蛋白質(zhì)分子中若含有苯環(huán)，則遇濃硝酸加熱變黃，此反應(yīng)稱為蛋白質(zhì)的蛋白黃反應(yīng)，用于鑒別蛋白質(zhì)中苯環(huán)的存在。除以上各顏色反應(yīng)外還有縮二脲反應(yīng)、亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)等。表31為常用的蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)。表31蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)反應(yīng)名稱 試劑(成分) 顏色 鑒別基團(tuán)縮二脲反應(yīng) 強(qiáng)堿、稀硫酸銅溶液紫色或紫紅色 多個(gè)肽鍵茚三酮反應(yīng) 稀茚三酮溶液 藍(lán)紫色 氨基

蛋白黃反應(yīng)濃硝酸深黃色或橙紅色苯環(huán)米倫反應(yīng) 汞或亞汞的硝酸鹽、亞硝酸鹽 紅色酚羥基亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)亞硝酰鐵氰化鈉溶液 紅色巰基蛋白黃反應(yīng)濃硝酸深黃色或橙紅色苯環(huán)米倫反應(yīng) 汞或亞汞的硝酸鹽、亞硝酸鹽 紅色酚羥基亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)亞硝酰鐵氰化鈉溶液 紅色巰基沉淀反應(yīng)蛋白質(zhì)分子末端具有游離的a—NH3+和a—C00-,因此，蛋白質(zhì)和氨基酸一樣，也具有兩性解離和等電點(diǎn)的性質(zhì)。在等電狀態(tài)下，蛋白質(zhì)顆粒容易聚集而析出沉淀；在非等電狀態(tài)時(shí)，蛋白質(zhì)分子表面總帶有一定的同性電荷，由于電荷之間的相互排斥作用阻止蛋白質(zhì)分子凝聚。蛋白質(zhì)是高分子化合物，具有溶膠的一些性質(zhì)，蛋白質(zhì)分子表面帶有許多極性基團(tuán)，可與水結(jié)合，并使水分子在其表面定向排列形成一層水化膜，這使蛋白質(zhì)顆粒均勻分散在水中難以聚集沉淀。以上兩因素維持著蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定，破壞這兩種因素則可使蛋白質(zhì)沉淀。中性鹽沉淀蛋白質(zhì)將高濃度的中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液中，鹽離子的水化能力強(qiáng)而奪去蛋白質(zhì)的水分，破壞了蛋白質(zhì)分子表面的水化膜，產(chǎn)生沉淀，即發(fā)生鹽析。利用各種蛋白質(zhì)沉淀所需中性鹽濃度不同，可將蛋白質(zhì)分階段沉淀，此操作過(guò)程被稱為分段鹽析(fractionalsaltingout)。有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)利用乙醇、丙酮和甲醇等一些極性較大的有機(jī)溶劑與水之間具有親和力，破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜而使蛋白質(zhì)沉淀。重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)某些重金屬離子如Ag+，Hg2+，Cu2+和Pb2+等(用M+表示)可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)顆粒結(jié)合，形成不溶性鹽而沉淀。反應(yīng)式為：lJ1M--lJI(XX) (XX)M有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)苦味酸、鞣酸、鎢酸、三氯乙酸、磺基水楊酸等(用X—表示)可與帶正電荷的蛋白質(zhì)顆粒結(jié)合，形成不溶性鹽而沉淀。反應(yīng)式為：Nil；X］七、 IX—-P、I(IK)H (IX)M三、實(shí)驗(yàn)用品試管12支，250ml燒杯1只，離心管3支，離心機(jī)1臺(tái)，玻璃棒1根。蛋白質(zhì)溶液，0.01mol/L茚三酮溶液，0.01mol/L苯酚溶液，米倫試劑，濃L硫酸銅溶液，飽和硫酸銨溶液，無(wú)水乙醇，2.74mol/L鹽酸溶液，0.61mol/L三氯乙酸溶液，0.11mol/L氯化汞溶液，0.18mol/L硝酸銀溶液，苦味酸，硫酸銨粉末。四、實(shí)驗(yàn)操作1.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)縮二脲反應(yīng)取1支試管，加入5滴蛋白質(zhì)溶液和1.25mol/L氫氧化鈉溶液4滴，搖勻后加入O.20mol/L硫酸銅溶液1?2滴，振蕩。觀察試管中溶液顏色變化。茚三酮反應(yīng)在1支試管中加入蛋白質(zhì)溶液10滴，0.01mol/L茚三酮溶液3滴，置沸水浴中加熱，5?10min，觀察溶液顏色有何變化。蛋白黃反應(yīng)取2支試管，分別加入0.01mol/L苯酚溶液5滴和蛋白質(zhì)溶液5滴，然后各加2滴濃硝酸，注意在盛有蛋白質(zhì)溶液的試管中是否有白色沉淀生成。再將2支試管置沸水浴中加熱，觀察各試管有何現(xiàn)象發(fā)生。米倫反應(yīng)取試管2支，分別加入0.01mol/L苯酚溶液3滴和蛋白質(zhì)溶液3滴，然后各加米倫試劑［1】3滴。此時(shí)，2支試管中有何現(xiàn)象？再將2試管置沸水浴中加熱，注意觀察有何變化。醋酸鉛反應(yīng)［2】在1支試管中加入0.075mol/L醋酸鉛溶液1滴，然后滴加1.25mol/L氫氧化鈉溶液2滴，搖勻。再加入蛋白質(zhì)溶液4滴，振蕩后將試管置沸水浴中加熱2?3min。注意觀察在整個(gè)操作過(guò)程中溶液發(fā)生怎樣的變化。蛋白質(zhì)沉淀⑶中性鹽沉淀蛋白質(zhì)在1支離心管中加入蛋白質(zhì)溶液和飽和硫酸銨溶液各2ml?；旌虾箪o置10min，球蛋白［4】沉淀析出。離心后，將上層清液用毛細(xì)吸管小心吸出，并移至另一離心管中，慢慢分次加入硫酸銨粉末。注意，每加一次，都要用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁钡椒勰┎辉偃芙鉃橹?。靜置10min后，即可見(jiàn)清蛋白沉淀析出，離心后，棄去上層清液。向上述2支有沉淀的離心管中加入2ml蒸餾水，并用玻璃棒攪拌，仔細(xì)觀察沉淀的變化。乙醇沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入無(wú)水乙醇10滴，沿試管壁加入蛋白質(zhì)溶液5滴。靜置，觀察溶液中是否出現(xiàn)渾濁［5】。三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)在1支試管中加入蛋白質(zhì)溶液5滴，再加入2滴0.61mol/L三氯乙酸溶液。有何現(xiàn)象發(fā)生？重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)在4支試管中各加入蛋白質(zhì)溶液5滴，然后再分別加入3滴鉛溶液、0.20mol/L硫酸銅溶液，觀察各試管有何現(xiàn)象發(fā)生。加熱沉淀蛋白質(zhì)3】在l支試管中加入蛋白質(zhì)溶液2ml,置沸水浴中加熱5min,觀察有何現(xiàn)象發(fā)生。注釋?zhuān)?］ 米倫試劑是汞或亞汞的硝酸鹽和亞硝酸鹽，能與酚類(lèi)化合物產(chǎn)生顏色反應(yīng)。［2］ 在含有胱氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)溶液中加入強(qiáng)堿，堿分解胱氨酸或半胱氨酸殘基產(chǎn)生硫離子。醋酸鉛反應(yīng)是硫離子與醋酸鉛溶液的反應(yīng)。［3］ 若改變或破壞蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)而使蛋白質(zhì)沉淀，則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性喪失以及理化性質(zhì)改變，即蛋白質(zhì)變性。生物堿試劑或某些酸及重金屬離子會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，有機(jī)溶劑若使用不當(dāng)也會(huì)使蛋白質(zhì)變性，而高濃度的中性鹽不會(huì)使蛋白質(zhì)變性。［4］ 蛋白質(zhì)按形狀不同分為纖維狀蛋白質(zhì)和球狀蛋白質(zhì)兩大類(lèi)。纖維狀蛋白質(zhì)分子形狀類(lèi)似細(xì)棒狀纖維，如皮膚、毛發(fā)、指甲中的角蛋白。球狀蛋白質(zhì)分子類(lèi)似于球狀或橢圓狀，在水中溶解度較大，如血紅蛋白、肌紅蛋白等。［5］ 有機(jī)溶劑用量較少或濃度不大時(shí)，現(xiàn)象不太明顯，此時(shí)可另取一支試管作空白對(duì)照。［6］ 氯化汞有毒，使用時(shí)應(yīng)注意。［7］ 幾乎所有的蛋白質(zhì)在加熱時(shí)都凝固，只是不同蛋白質(zhì)凝固所需溫度不同。在受熱凝固時(shí)蛋白質(zhì)變性，在臨床上利用該性質(zhì)可檢驗(yàn)?zāi)虻鞍住Ｋ伎碱}在本實(shí)驗(yàn)中有兩次蛋白質(zhì)與醋酸鉛溶液的反應(yīng)，