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文檔簡(jiǎn)介
第三部分外源基因在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控引言表達(dá)調(diào)控的研究?jī)?nèi)容起始密碼邊周序列(initialcode)翻譯增強(qiáng)因子(Ω
)密碼劑量效應(yīng)(codonbias)
啟動(dòng)子活性(promoter)增強(qiáng)子(enhancer)Poly(A)信號(hào)(signal)內(nèi)含子(intron)不穩(wěn)定因子隱含內(nèi)含子序列隱含Poly(A)信號(hào)外源基因在不同水平上的表達(dá)調(diào)控整合狀態(tài)基因活性調(diào)控水平DNA水平RNA水平蛋白質(zhì)水平轉(zhuǎn)錄效率轉(zhuǎn)錄加工mRNA穩(wěn)定性翻譯效率翻譯后修飾蛋白質(zhì)運(yùn)輸整合位置效應(yīng)(positioneffect)拷貝數(shù)影響(copiesnumbers)DNA再分布(DNArearrange)DNA甲基化(DNAmethylation)共抑制和反式失活(cosuppression&trans-inactivity)剪切內(nèi)含子-1葉綠體線粒體核糖基化信號(hào)肽第三部分外源基因在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控一.轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)1.瞬時(shí)表達(dá)
概念過程2.瞬時(shí)表達(dá)的機(jī)理
a.瞬時(shí)表達(dá)是沒有整合的外源基因的表達(dá)
b.瞬時(shí)表達(dá)是一種正常的表達(dá)方式3.外源基因瞬時(shí)表達(dá)的影響因素 (1)質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu) (2)內(nèi)源核酸酶的影響 (3)受體細(xì)胞生理狀態(tài) (4)內(nèi)源GUS酶抑制劑4.外源基因瞬時(shí)表達(dá)的應(yīng)用 (1)在基因轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用
a.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力的檢測(cè)
b.優(yōu)化基因轉(zhuǎn)化條件 (2)植物基因表達(dá)調(diào)控的研究5.外源基因的穩(wěn)定表達(dá) 外源基因在植物細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)的條件
a.時(shí)間長(zhǎng) b.無迅速衰退現(xiàn)象
c.分子雜交證明DNA已經(jīng)整合到植物基因組中
d.能遺傳,并符合分離規(guī)律第三部分外源基因在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控一.轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)二.轉(zhuǎn)化外源基因的同源性和異源性表達(dá)異源性表達(dá)(heterologousexpression)同源性表達(dá)(homologousexpression)
異源性表達(dá)只是基因編碼序列“異源”,而啟動(dòng)子和其它調(diào)控序列必須與植物同源二.轉(zhuǎn)化外源基因的同源性和異源性表達(dá)2.原核生物基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)
原核與真核基因在表達(dá)機(jī)制上有很大的差異,因此細(xì)菌的基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞是不能表達(dá)的。即使采用了植物基因的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),沒有改造的細(xì)菌基因也只能很低水平的表達(dá)。例:Bt.δ-毒蛋白抗蟲基因表達(dá)量?jī)H占植物可溶蛋白總量的0.001%達(dá)不到抗蟲的目的。原因是,mRNA結(jié)構(gòu)中可能隱含有polyA信號(hào)AAUAA序列及內(nèi)含子切割序列等,從而造成mRNA在不適當(dāng)?shù)奈恢蒙蠑嗔讯到?。向植物中引入Bt基因的改造。在不改變氨基酸序列的情況下,改變了20%的堿基序列,提高了GC含量,使其在植物中的表達(dá)由原來的0.001%提高到0.05~0.1%(提高了50-100倍)??瓜x效果明顯提高。向植物中引入Bt基因的改造修飾原則:1.優(yōu)先使用植物偏愛的密碼子2.改變基因的GC含量(36~45%),使之與植物基因GC含量一致3.注意XCG/XCC和XTA/XTT的比值。對(duì)植物而言,該比值低好。Thr,Pro,Ala和Ser密碼子第三位避免用G。4.翻譯起始區(qū)第4個(gè)核苷酸用G,以符合ATGGC的要求。5.去除隱含的poly(A)信號(hào)。如:AATAA,AATGAA,AATAAT,AATATT,GATAAA,GATAAG6.去除隱含的RNA聚合酶II終止序列。CAN1~9AGTNNAA7.清除發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。CUUCGG8.消除隱含的內(nèi)含子剪切序列。AAG.GTAAGT等
10三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響1.高等植物基因的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)2.5’-端表達(dá)調(diào)控序列的基本特征
啟動(dòng)子Promoter
增強(qiáng)子Enhancer
沉默子Silencer
順式作用元件Cis-acting-element
反式作用因子Trans-acting-factor 啟動(dòng)子 確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列
TATAbox–25~-35負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的精確性 CAATbox GCbox–80~-110控制轉(zhuǎn)錄起始頻率
多數(shù)組成型啟動(dòng)子上游有(hexamermotif)TGACTG
可誘導(dǎo)啟動(dòng)子中常有CCACGTGG8核苷酸G-box植物轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處的保守序列:YYYAYYA+1三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響3.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子
增強(qiáng)子的作用是增強(qiáng)RNA的轉(zhuǎn)錄效率,其功能是通過結(jié)合特定的轉(zhuǎn)錄因子或影響DNA的構(gòu)象而實(shí)現(xiàn)的。增強(qiáng)子作用的三個(gè)特點(diǎn): 1.它與啟動(dòng)子的相對(duì)位置和取向無關(guān),具有遠(yuǎn)程效應(yīng) 2.需要特定的蛋白質(zhì)因子的參與 3.有些(如SV40的增強(qiáng)子)能在幾乎所有類型細(xì)胞中發(fā)揮 作用,而大多數(shù)具有相對(duì)的組織特異性目前已分離的大量的啟動(dòng)子(包括增強(qiáng)子)按其作用方式大體可劃分為三類組成型 誘導(dǎo)型 組織特異型三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響3.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(1)組成型啟動(dòng)子
A.CaMV35S啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng)子二.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響3.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(1)組成型啟動(dòng)子
A.CaMV35S啟動(dòng)子
B.NOS啟動(dòng)子組成型,損傷,激素誘導(dǎo)活性,-123--114之間或重疊區(qū)有20ntZ-DNA形成因子可以與bZIP蛋白因子相互作用,誘導(dǎo)活性必需序列.啟動(dòng)子的強(qiáng)度依組織部位及器官位置而變化,老組織中強(qiáng),生殖器官中隨發(fā)育狀態(tài)而不同.在禾本科植物中完全或幾乎無啟動(dòng)子表達(dá)能力.
TGACGTAAGCACATACGTCA-123~114Z-DNA三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響3.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(1)組成型啟動(dòng)子35SP-750TGACGTProtein-leucinezipper(trans-actingfactor)NOSPfgfhcdgfghjkhhjh二.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響3.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(1)組成型啟動(dòng)子
A.CaMV35S啟動(dòng)子
B.NOS啟動(dòng)子C.玉米的Ubiquitin和水稻Actin1啟動(dòng)子同一啟動(dòng)子在不同的受體細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控表達(dá)水平的能力有很大差別,如35S啟動(dòng)子在禾本科中是雙子葉植物的1-10%.NOS啟動(dòng)子在禾本科植物細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有活性根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?往往需要外源基因以不同的強(qiáng)度表達(dá).組成型啟動(dòng)子
不同啟動(dòng)子的相對(duì)強(qiáng)度(2`-Npt-II活性為100,pGVLl150為對(duì)照)嵌合基因結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子來源水稻懸浮系水稻葉煙草葉2`-Npt-IIT-DNA10010010035S-Npt-IICaMV40±4ND28±1Nos-
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