第七章 細(xì)菌和噬菌體的重組和連鎖課件

第七章細(xì)菌和噬菌體的重組和連鎖基本知識細(xì)菌是單細(xì)胞，它的遺傳物質(zhì)是一個大型的環(huán)狀核酸分子，稱之為基因帶，也可稱為染色體。若細(xì)菌喪失產(chǎn)生某種營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸）的能力就稱為營養(yǎng)缺陷型，相對于缺陷型的野生菌株叫原養(yǎng)型。病毒的結(jié)構(gòu)是由蛋白質(zhì)外殼和包裹在中間的一個單一的核酸分子（可稱基因帶或染色體）組成。例如：細(xì)菌的基因組

Onecircularchromosome(4-5Mb)7.1

細(xì)菌的遺傳分析細(xì)菌的雜交以大腸桿菌為例，大腸桿菌K12中兩個菌株A和B，菌株A是供體，含有F因子（F質(zhì)粒），記作F+，菌株B是受體，沒有F因子，記作F-。F因子又稱性因子或致育因子，它是能獨立增殖的環(huán)狀DNA分子。F+細(xì)菌的表面有稱作性傘毛的細(xì)長纖毛。當(dāng)F+細(xì)菌與F-細(xì)菌結(jié)合時，F(xiàn)因子通過性傘毛從F+細(xì)菌轉(zhuǎn)移到F-細(xì)菌，原來的細(xì)菌還仍為F+。不過染色體很少通過結(jié)合而轉(zhuǎn)移到F-細(xì)菌，所以染色體上的基因的重組頻率很低。細(xì)菌接合雜交實驗Lederberg和Tatum1946A＋B－×A－B＋A＋B＋回復(fù)突變or重組？？？細(xì)菌接合雜交實驗Lederberg和Tatum1946A＋B＋C－D－×A－B－C＋D＋A＋B＋C＋D＋

A品系：met－bio－thi＋leu＋thr＋（thi：硫胺素B1）B品系：met＋bio＋thi－leu－thr－

AA+BB

基本培養(yǎng)基

met＋bio

＋

thi＋leu＋

thr＋出現(xiàn)頻率:1/107細(xì)菌接合遺傳物質(zhì)的單方向轉(zhuǎn)移Hayes實驗A:met-thr+leu+thi+B:met+thr-leu-thi-Donor：AReceptor：B

大劑量鏈霉素A品系無影響

大劑量鏈霉素B品系阻止了重組F質(zhì)粒與細(xì)菌接合Hfr菌株因為F因子和細(xì)菌的DNA分子都是環(huán)狀的，在環(huán)狀的細(xì)菌染色體和環(huán)狀的F因子間通過一個交換，環(huán)狀F因子就整合到環(huán)狀的細(xì)菌染色體上。F因子整合到細(xì)菌染色體上的菌株就是高頻重組菌株，稱為Hfr菌株。高頻重組菌株（Hfr菌株）跟菌株B（F-）雜交時，細(xì)菌染色體上基因的重組頻率很高，即出現(xiàn)重組子的頻率很高。Highfrequencerecombination

（圖示F因子整合到細(xì)菌染色體的過程）Hfr與F-的接合（示：細(xì)菌的交換過程）Hfr品系與F＋菌株的區(qū)別相同1、都能和F－雜交。2、雜交都要通過接合管和受體菌相聯(lián)接。3、高劑量鏈霉素處理后都不影響雜交，說明它們都是作為一種供體。不同1、產(chǎn)生重組子頻率不同，Hfr×F－為10－4，F(xiàn)＋×F－為10－7。2、F＋×F－后代F＋，Hfr×F－后代F－。3、F＋細(xì)菌經(jīng)吖啶橙處理變成F－，Hfr經(jīng)吖啶橙處理仍為Hfr。中斷雜交技術(shù)：把Hfr細(xì)菌與F-細(xì)菌混合培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，將試樣攪拌并稀釋后在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使其只有重組子類型可以生長，分析Hfr染色體上基因進(jìn)入受體細(xì)胞（F-細(xì)菌）的順序各所需時間（分鐘），這種根據(jù)供體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的順序和時間繪制連鎖圖的技術(shù)，稱為中斷雜交技術(shù)。（1）.Wollman和Jacob的實驗要解決的問題是：Hfr細(xì)菌在交配中，什么時候把基因轉(zhuǎn)移給F－細(xì)菌。方法：把兩個菌株混在一起，進(jìn)行雜交將二菌株在培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，Hfr細(xì)菌與F－細(xì)菌開始接觸，形成接合管。每隔一定時間取樣攪拌，斷開結(jié)合管，使配對的細(xì)菌分開。然后稀釋菌液，防止再度配對。將上述菌液涂布在含有鏈霉素，但不含有蘇氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基上。這樣，帶thr+和leu+的Hfr菌株對鏈霉素敏感；而帶有strr的F－菌不能合成蘇氨酸和亮氨酸，都不能生長。只有帶thr+和leu+的Hfr菌和帶有strr的F－菌的重組子可以生長。把中斷雜交的細(xì)菌放在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)，顯然供體、受體菌都能生長。影響檢測。我們只需要把發(fā)生重組的重組子檢出。這就必須有一個可供選擇用的供體標(biāo)記基因。這樣可以認(rèn)出重組子，如在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)選擇thr+leu+重組子。這時thr+leu+為標(biāo)記基因，可排除受體菌株，但供體菌還能繼續(xù)存在。為了不選擇供體細(xì)胞本身，供體細(xì)菌也應(yīng)該帶有一個特殊的標(biāo)記，能使自己不被選擇。例如供體菌對鏈霉素敏感，這樣當(dāng)結(jié)合體在含有鏈霉素的培養(yǎng)基上生長時，供體菌株就被殺死了。如何檢出某一基因的重組子?對每一時刻的重組thr+leu+strr的菌落影印培養(yǎng)接種到不同的培養(yǎng)基上（如乳糖lae++伊紅+美蘭→紅色，反之則是粉紅色的。記錄重組子中每一非選擇標(biāo)記出現(xiàn)的時間、出現(xiàn)的頻率和持續(xù)時間，得圖（Hfr的非選擇標(biāo)記基因進(jìn)入F-所需的時間，以及根據(jù)非選擇標(biāo)記在各個時間出現(xiàn)的頻率作圖）。在發(fā)生重組的菌落中，如何檢別非選擇標(biāo)記基因各培養(yǎng)基分別具有不同的營養(yǎng)缺陷或某種抑制性物質(zhì)存在。Wollman和Jacob對重組子thr+leu+strr進(jìn)行菌落影印培養(yǎng)實驗。分析Hfr染色體上其它非選擇性標(biāo)記基因進(jìn)入F－細(xì)菌的順序和所需時間（分鐘），繪制連鎖圖。從Hfr菌株某基因在F－細(xì)菌中出現(xiàn)開始，隨著時間的推移，具有該基因的菌落逐漸增加，直到某一百分?jǐn)?shù)為止。而且某一基因出現(xiàn)的時間愈早，它達(dá)到的頻率愈高。如疊氮化鈉抗性基因出現(xiàn)最早，在24分鐘時就達(dá)到大約90％的F-菌落；半乳糖發(fā)酵基因出現(xiàn)最遲，即使在混和后60分鐘也只有30％的菌落屬于能利用型。（3）.結(jié)論染色體從一端開始，（這一端稱為原點（origin）或O），以線性方式進(jìn)入F-細(xì)胞中。基因離原點越遠(yuǎn)，進(jìn)入F－細(xì)胞越遲。離開原點較遠(yuǎn)的基因，可能在轉(zhuǎn)移過程停止以前，仍未轉(zhuǎn)移，因而斜率較低，達(dá)到的最高值也較小。如果讓Hfr×F－雜交繼續(xù)進(jìn)行，長達(dá)二小時，然后使之中斷，這樣發(fā)現(xiàn)某些F－受體轉(zhuǎn)變?yōu)镠fr。致育因子是最后轉(zhuǎn)移到受體的，并使它們成為供體其效率很低，是因為致育因子是線性染色體最后一個單位，它最晚進(jìn)入F－細(xì)胞。細(xì)菌的交換過程重組子(即重組類型)的產(chǎn)生是由于不同的DNA分子之間發(fā)生交換的結(jié)果。細(xì)菌重組子的產(chǎn)生是由于細(xì)菌染色體（F-染色體）與供體DNA分子（部分Hfr染色體）之間發(fā)生交換的結(jié)果。但發(fā)生單交換是沒有用的，只有發(fā)生偶數(shù)的交換才能產(chǎn)生有活性的重組子。根據(jù)重組子頻率來確定兩基因之間的距離并繪制出連鎖圖，這種根據(jù)重組頻率作圖的方法稱之為重組作圖。ABbabaABABbaABba+ABba部分二倍體圖示：細(xì)菌基因的交換Hfrlac+ade+(strs)×F-lac-ade-(strr)完全培養(yǎng)基混合培養(yǎng)基本培養(yǎng)基（F-ade+菌落）（無腺嘌呤、加鏈霉素)EMB培養(yǎng)基（影印培養(yǎng)）F-ade+lac-基因間發(fā)生交換F-ade+lac+基因間未發(fā)生交換加乳糖實驗方法：

將重組子菌落影印培養(yǎng)在加有曙紅和美藍(lán)的培養(yǎng)基上：以檢驗?zāi)芊窭萌樘?。如能發(fā)酵乳糖（lac+），菌落是紫紅色的。如不能利用（lac-），菌落是粉紅色的。試驗結(jié)果：親組合52重組合15計算重組頻率：

重組菌落數(shù)/總菌落數(shù)×100%=(lac-ade+)/[(lac+ade+)+(lac-ade+)]×

100%=15/(52+15)×

100%≈20%已知中斷雜交實驗該兩個基因相距1分鐘,

重組作圖與中斷雜交作圖的圖距關(guān)系:

1分鐘圖距≈20%重組值前面提到，時間單位接近2分鐘時，測得的基因間的距離，不太可靠，故應(yīng)采用比較穩(wěn)定的重組作圖法。

Ecoli染色體全長：90分鐘；含有：3.6X106bp

20×

90≈1800cM

三點測交繪制基因圖譜F因子（F質(zhì)粒）是帶有部分細(xì)菌染色體的F因子。Hfr通過交換，可以形成帶有部分細(xì)菌染色體的F因子，而F因子又可通過交換整合到細(xì)菌染色體上的原來位置，回復(fù)到以前的Hfr狀態(tài)。F因子連同它所帶有的部分細(xì)菌染色體可一起轉(zhuǎn)移到F-細(xì)胞，并形成部分二倍體。這一特性叫做性導(dǎo)。F因子轉(zhuǎn)移到F-細(xì)胞的轉(zhuǎn)移速率近于F因子。但它把細(xì)菌染色體轉(zhuǎn)移過去的效率比Hfr低得多。不過Hfr的致育因子（F因子）極少進(jìn)入F-細(xì)胞。F質(zhì)粒F和F因子F品系轉(zhuǎn)變成Hfr品系的頻率要高于F＋品系。F變成Hfr時F因子整合到相同位點上，而F＋變成Hfr時可整合到不同位點。F×F－高頻傳遞特定的基因，形成部分二倍體，而F＋×F－產(chǎn)生F＋但不轉(zhuǎn)移任何基因，或以10－7將宿主的基因轉(zhuǎn)移，所轉(zhuǎn)移的基因是不同的。Hfr×F－將宿主的基因按順序轉(zhuǎn)入受體，產(chǎn)生重組子頻率較高，為10－４。但受體仍為F－（？）。性別細(xì)菌狀態(tài)F因子狀態(tài)♀F-無F因子♂F+F因子為游離狀態(tài)♂HfrF因子整合到宿主染色體上♂F帶有部分宿主染色體的F因子，為游離狀態(tài)小結(jié)：1、細(xì)菌細(xì)胞的兩種性別、四種狀態(tài)：F+F-丟失雜交F+Hfr整合到E.coli染色體規(guī)則脫離E.coli染色體F'Hfr

回復(fù)到Hfr染色體不規(guī)則脫離E.coli染色體2、F+、F-、Hfr、F'的關(guān)系轉(zhuǎn)變關(guān)系F+×F-低頻重組Hfr×F-高頻重組F′×F-一般為低頻重組，但對所攜帶的基因是高頻重組。重組頻率區(qū)別F＋，Hfr，F(xiàn)的接合對照利用Hfr菌株，根據(jù)中斷雜交試驗和基因重組試驗及其它基因定位試驗的結(jié)果，已繪制出的E.coliK12的環(huán)狀染色體圖。7.2

噬菌體的遺傳分析烈性噬菌體：噬菌體侵染細(xì)菌后，把宿主菌的生物合成裝置接收過來，合成更多的噬菌體，最后使細(xì)菌細(xì)胞烈解并釋放出很多子代噬菌體。這種使宿主菌烈解的噬菌體叫烈性噬菌體。如T2噬菌體。溫和噬菌體：噬菌體侵染細(xì)菌后，細(xì)菌好象未被感染一樣能繼續(xù)增殖。如不經(jīng)誘導(dǎo)宿主菌不發(fā)生烈解，這種噬菌體叫溫和噬菌體。這種現(xiàn)象叫溶源性，這樣的細(xì)菌叫溶源性細(xì)菌或溶源菌。如P22、P1和λ噬菌體。

噬菌體的繁殖噬菌斑的鑒定（噬菌體遺傳特性的鑒定）一個噬菌斑中的噬菌體在遺傳上是均一的，相當(dāng)于一個克隆。由于噬菌體的基因型不同，噬菌斑可以是大的或小的，邊緣清晰的或模糊的；另外噬菌體的宿主范圍（hostrange）也可能不同，有些噬菌體可以侵染和裂解某些細(xì)菌但不能侵染和裂解另外一些細(xì)菌，根據(jù)這些就可以鑒定噬菌體遺傳特性。T2突變型的兩點測交T2突變型r-：快速溶菌，大界限分明噬菌斑野生型r+：緩慢溶菌，小溶菌斑寄主范圍突變型h-：能感染E.Coil品系1、品系2。感染E.Coil品系1、品系2共培養(yǎng)，透明噬菌斑野生型h+：只能感染E.Coil品系1。感染E.Coil品系1、品系2共培養(yǎng)，半透明噬菌斑T2突變