污染物的生物效應(yīng)檢測

關(guān)于污染物的生物效應(yīng)檢測第1頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五第一節(jié)生物測試及方式第2頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五一、生物測試（Bioassay）的概念：

指系統(tǒng)地利用生物的反應(yīng)測定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨或聯(lián)合存在時所導(dǎo)致的影響或危害。注釋1：所利用的生物反應(yīng)包括分子、細胞、組織、器官、個體、種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)各級水平上的反應(yīng)。注釋2：生物測試不同于常規(guī)的物理、化學(xué)檢測。前者能夠測定污染物對生物機體的影響，而后者只能測定污染物的濃度。例如：通過水污染的生物測試可獲得以下數(shù)據(jù)：各種環(huán)境因素如DO、pH、溫度、混濁度等對生命的有利以及不利的濃度或強度；污染物對受測生物的毒性；各種水生生物對污染物的相對敏感性；廢水所應(yīng)處理的程度；允許的污染物排放濃度等。第3頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五二、生物測試的方式（一）生物測試的分類1.短期生物測試（ShortTermBioassays）主要用于測定LC50、IC50、EC50，用來快速估計污染物的毒性，評定幾種不同毒物或廢物對某種生物的相對毒性或評定不同生物對不同條件如溫度、pH的相對敏感性等。多數(shù)采用靜止式。2.中期生物測試（IntermediateTermBioassays）時間為8d到90d，多數(shù)情況下為流動式。3.長期生物測試（LongTermBioassays）包括全部生活史的生物測試（CompleteLife－cycleBioassays）和部分生活史的生物測試（PartialLife－cycleBioassays）目的是要測定出在持續(xù)情況下不造成有害效應(yīng)的毒物最大濃度或最大允許毒物濃度（MATC）只能采用流動式，要保證試驗的環(huán)境條件和自然界的季節(jié)變化相符合。第4頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五（二）受試生物的選擇（1）對試驗毒物或者因子要具有敏感性（2）具有廣泛的地理分布和足夠的數(shù)量，并在全年中在某一區(qū)域范圍內(nèi)可獲得（3）是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，具有重大的生態(tài)價值（4）在實驗室內(nèi)易于培養(yǎng)和繁殖（5）具有豐富的生物學(xué)背景資料，人們已經(jīng)清楚了解受試生物的生活史、生長、發(fā)育、生理代謝等等（6）受試生物對試驗毒物或因子的反應(yīng)能夠被測定，并具有一套標(biāo)準(zhǔn)的測定方法或技術(shù)（7）受試生物應(yīng)具有重要的經(jīng)濟價值和旅游價值，應(yīng)考慮與人類食物鏈的聯(lián)系。第5頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五影響生物測試結(jié)果的因素受試生物：年齡，生活階段，尺寸大小，季節(jié)等。試驗條件：溫度，水質(zhì)，水流速度等。實驗室差異：人員造作水平，儀器設(shè)備，統(tǒng)計分析方法。（三）生物測試的標(biāo)準(zhǔn)化（1）不同的實驗室進行許多有用的測試并把一致的測試結(jié)果選擇出來（2）增加數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性（3）測試可以被其他實驗室重復(fù)（4）各種人員容易進行該試驗（5）可方便的將數(shù)據(jù)進行比較（6）可為環(huán)境管理，環(huán)境立法提供可靠的數(shù)據(jù)或者結(jié)果第6頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五第二節(jié)一般毒性試驗第7頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五一、生物毒性的基本概念毒物（Toxicant）的概念任何能以較小劑量作用于機體，通過化學(xué)作用造成機體損害乃致死亡者，稱毒物。毒物與非毒物之間不存在絕對的界限，通常一種物質(zhì)只有達到中毒劑量時才是毒物。中毒（Intoxication）生物體受到毒物作用引起功能或器質(zhì)性改變后出現(xiàn)的疾病狀態(tài)。中毒是各種毒性作用的綜合表現(xiàn)，包括急性中毒、亞急性中毒、慢性中毒。毒性（Toxicity）指一種物質(zhì)引起機體損傷的能力。毒性作用或毒效應(yīng)（ToxicEffect）第8頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五

效應(yīng)（Effect）也稱為作用，指接觸一定劑量化學(xué)物后，使機體產(chǎn)生的生物學(xué)改變。效應(yīng)是對個體而言的，這種改變可用一定的計量單位表示。反應(yīng)（Response）指接觸一定劑量化學(xué)物后，產(chǎn)生某種效應(yīng)并達到一定強度的個體在群體中所占的比例。反應(yīng)是對群體而言的，用百分率或比值來表示，如發(fā)病率、死亡率等。劑量－效應(yīng)關(guān)系和劑量－反應(yīng)關(guān)系以劑量為橫坐標(biāo)，以表示效應(yīng)強度的計算單位或表示反應(yīng)的百分率或比值為縱坐標(biāo)繪制散點圖所得到的曲線，即為劑量－效應(yīng)關(guān)系和劑量－反應(yīng)關(guān)系曲線。不同的化學(xué)物或同一化學(xué)物在不同條件下，其劑量與效應(yīng)或反應(yīng)的相關(guān)關(guān)系不同，可呈現(xiàn)不同類型的曲線。（見圖3－1，3－2，3－3，3－4）第9頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五劑量－效應(yīng)關(guān)系和劑量－反應(yīng)關(guān)系曲線圖劑量10050反應(yīng)強度（％）圖3－1劑量－反應(yīng)曲線（直線型）劑量10050死亡率（％）圖3－2劑量－反應(yīng)曲線（拋物線型）對數(shù)劑量10050死亡率（％）圖3－3劑量－反應(yīng)曲線（S形線型）死亡率（概率單位）對數(shù)劑量10050圖3－4劑量－反應(yīng)曲線第10頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五（二）毒性試驗常用參數(shù)致死劑量或致死濃度（LethalDose，LethalConcentration）:一次染毒后引起受試生物動物死亡的劑量或者濃度。絕對致死劑量或致死濃度（LD100、LC100）：一群動物全部死亡的最低濃度或者劑量。半數(shù)致死劑量或濃度（LD50、LC50）：能引起一群動物的50%死亡的最低濃度或者劑量。最小致死劑量或濃度（MLD、MLC）：能使一群動物中僅個別死亡的最高劑量或者濃度。最大耐受劑量或濃度（LD0、LC0）：能使一群動物雖然發(fā)生嚴重中毒，但全部存活無一死亡的最高劑量或者濃度。第11頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五最大無作用劑量（MaximumNo－effectLevel）：指化學(xué)物質(zhì)在一定時間內(nèi)，按一定方式與機體接觸，用現(xiàn)代的檢測方法和最靈敏的觀察指標(biāo)不能發(fā)現(xiàn)任何損害作用的最高劑量。與閾劑量一樣，最大無作用劑量也不能通過試驗獲得。每日容許攝入量（AcceptableDailyIntake）最高容許濃度（MaximumAllowableConcentration）第12頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五最小有作用劑量：在一定時間內(nèi)，一種外來化合物按一定方式或途徑與機體接觸，能使某項觀察指標(biāo)開始出現(xiàn)異常變化或使機體開始出現(xiàn)損害作用所需的最低劑量，也可稱為中毒閾劑量，或中毒閾值。第13頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五毒作用帶：是一種根據(jù)毒性和毒性作用特點綜合評價外來化合物危險性的指標(biāo)：急性毒作用帶（Acute－toxicEffectZone）：又稱一次作用帶，是指半數(shù)致死濃度（劑量）與急性閾濃度之比值。該值與外來化合物一次作用的危害性成反比關(guān)系。急性毒作用帶越寬，說明該化合物外來引起急性致死性中毒的危害性越小。慢性毒作用帶（Chronic－toxicEffectZone）：急性閾濃度（劑量，Limac）與慢性閾濃度（劑量，limch）之比值，以此表示外源性化合物的蓄積性及機體代償能力。慢性毒作用帶愈寬，Zch值愈大，說明該化合物引起慢性中毒的可能性就愈大。第14頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）：能引起50%受試生物的某種效應(yīng)變化的濃度。通常指非死亡效應(yīng)。半數(shù)抑制濃度（IC50）：引起受試生物的某種效應(yīng)50%抑制的濃度。第15頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五二、急性毒性試驗（AcuteToxicityTest）急性毒性試驗（AcuteToxicityTest）研究化學(xué)物質(zhì)大劑量一次染毒或24小時內(nèi)多次染毒動物所引起的毒性的試驗。其目的是短期內(nèi)了解該物質(zhì)的毒性大小和特點，并為進一步開展其他毒性試驗提供設(shè)計依據(jù)。急性毒性試驗類型哺乳動物急性毒性試驗水生生物急性毒性試驗蚯蚓急性毒性試驗第16頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五動物急性毒性試驗（1）動物急性毒性試驗方法如下：按試驗要求選擇受試生物常用成年大鼠或小鼠，雌雄動物同時試驗，對試驗動物預(yù)先觀察幾天后標(biāo)記編號并隨機分組。預(yù)備試驗和確定劑量組選用少量動物進行預(yù)備試驗，找出引起動物90％（或全部）死亡的劑量（即最高劑量組劑量）和引起動物10％死亡（或不死亡）的劑量（即最低劑量組劑量）。在最高劑量組劑量和最低劑量組劑量的范圍內(nèi)，按等比級數(shù)插入若干個中間劑量（一般4～6組），從而確定正式試驗的劑量組。染毒方式和受試物的配制一般用灌胃法和人工熏氣法。受試物的配制：配制試驗所需的最高劑量濃度溶液，然后依次稀釋到所需濃度。第17頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五動物急性毒性試驗（2）觀察指標(biāo)中毒癥狀：一般觀察24～48小時，最好觀察到絕大多數(shù)動物出現(xiàn)典型中毒癥狀。動物死亡數(shù)目和死亡時間病理檢查：對于試驗時立即死亡的動物，可解剖，分析死亡原因，看是技術(shù)事故還是中毒引起的死亡。確定半數(shù)致死量（LD50）試驗結(jié)果LD50值越小，毒性越大。急性毒性試驗結(jié)果只能粗略地表示某化學(xué)物質(zhì)的毒性，而不能全面反映其毒性。由于動物種屬、性別、染毒方式的不同，所表現(xiàn)的毒性也不一致，故表示LD50應(yīng)注釋明動物種類和染毒方式。第18頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五三、亞慢性毒性試驗和慢性毒性試驗（一）亞慢性毒性試驗：指實驗動物連續(xù)多日接觸較大劑量的外來化合物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。所謂較大劑量，是指小于急性LD50的劑量。1.亞慢性毒性試驗的目的，主要是探討亞慢性毒性的閾劑量或閾濃度和在亞慢性試驗期間未觀察到毒效應(yīng)的劑量水平，且為慢性試驗尋找接觸劑量及觀察指標(biāo)。第19頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五2、實驗動物的選擇亞慢性毒性作用研究一般要求選拔兩種實驗動物，一種為嚙齒類，另一種為非嚙齒類，如大鼠和狗，以便全面了解受試物的毒性特征。由于亞慢性毒性試驗期較長，所以選擇被動物的體重(年齡)應(yīng)較小，如小鼠應(yīng)為15g左右，大鼠100g左右。3、染毒途徑亞慢性毒性試驗接觸外來化合物途徑的選擇，應(yīng)考慮兩點：一是盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該化合物的途徑或方式，二是應(yīng)與預(yù)期進行慢性毒性試驗的接觸途徑相一致。具體接觸途徑主要有經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚三種。第20頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五4、觀察指標(biāo)（1）一般性指標(biāo)1）.一般綜合性觀察指標(biāo)，這類指標(biāo)是非特異性觀察指標(biāo)，它是外來化合物對機體毒性作用的綜合性總體反映。①動物體重：實驗動物在亞慢性方式接觸外來化合物過程中，有多種因素均可影響動物體重的增長，包括食欲變化、消化功能變化、代謝和能量消耗變化等。體重變化的表示方式，可將接觸組與對照組同期體重絕對增長的重量加以比較和統(tǒng)計學(xué)處理。也可將接觸組與對照組同期體重百分增長率(以接觸化合物開始時動物體重為100%)進行統(tǒng)計和比較。②食物利用率：亞慢性試驗期間必須注意觀察并記錄動物的飲食情況，在此基礎(chǔ)上計算食物利用率，即動物每食入100g飼料所增長的體重克數(shù)。分析比較接觸組與對照組食物利用率，有助于分析受試化合物對實驗動物的生物學(xué)效應(yīng)。第21頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五③癥狀實驗動物在接觸外來化合物過程中所出現(xiàn)的中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時間均應(yīng)記錄和分析。④臟器系數(shù)或稱臟/體比值，是指某個臟器的濕重與單位體重的比值，通常以100g體重計。如肝/體比，即(全肝濕重/體重)′100。此指標(biāo)的意義是實驗動物在不同年齡期，其各臟器與體重之間重量比值有一定規(guī)律；若受試化合物使某個臟器受到損害，則此比值就會發(fā)生改變，可以增大或縮小，因此，臟/體比值是一個靈敏、有效和經(jīng)濟的指標(biāo)。第22頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五2）一般化驗指標(biāo)主要指血象和肝、腎功能的檢測，在亞慢性試驗中研究外來化合物對實驗動物的毒性作用，使用這類指標(biāo)，一般為篩檢性和探討性。通常血象檢測包括紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)和分類、血紅蛋白定量等。肝、腎功能也是一種常規(guī)指標(biāo)，如SGOT、SGPT、血清尿素氮、尿蛋白定性或定量、尿沉渣鏡檢等。（2）病理學(xué)檢查：亞慢毒性試驗中應(yīng)重視病理學(xué)檢查。凡是在染毒過程中死亡的動物均應(yīng)及時解剖，肉眼檢查后再進行病理組織學(xué)檢查。必要時作組織化學(xué)或電鏡鏡檢。第23頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五（二）慢性毒性試驗1、概念：慢性毒性是指以低劑量外來化合物長期給予實驗動物接觸，觀察其對實驗動物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。2、目的：慢性毒性試驗是確定外來化合物的毒性下限，即長期接觸該化合物可以引起機體危害的閾劑量和無作用劑量。為進行該化合物的危險性評價與制定人接觸該化合物的安全限量標(biāo)準(zhǔn)提供毒理學(xué)依據(jù)，如最高容許濃度和每日容許攝入量等。3、慢性毒性試驗期限：一般認為工業(yè)毒理學(xué)慢性試驗動物染毒6個月或更長時間；而環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)則要求實驗動物染毒1年以上或2年。也有學(xué)者主張動物終生接觸外來化合物才能全面反映外來化合物的慢性毒性效應(yīng)，以及求出閾劑量或無作用劑量。第24頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五4、實驗動物慢性毒性試驗選擇實驗動物的條件與亞慢性毒性試驗相同。但實驗動物最好為純系甚至同窩動物均勻分布于各劑量組。實驗動物年齡應(yīng)較小，大鼠和小鼠應(yīng)為初斷奶者，即小鼠出生后3周，體重10~12g；大鼠出生后3~4周，體重50~70g。性別要雌雄各半。慢性毒性試驗實驗動物的飼養(yǎng)條件和飼養(yǎng)環(huán)境與亞慢性毒性試驗相同。第25頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五5、接觸途徑：慢性毒性試驗多為經(jīng)口與經(jīng)呼吸道接觸。經(jīng)呼吸道接觸，每日接觸時間，依試驗要求而定。工業(yè)毒物的試驗通常每日吸入4～6小時。環(huán)境污染物一般要求每日吸入8小時或更長。6、劑量的選擇與分組：為制定外來化合物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)而進行慢性毒性試驗時，一般設(shè)3個染毒劑量組和1個對照組，必要時另設(shè)一個溶劑對照組，即無作用劑量組、閾劑量組、發(fā)生比較輕微毒性效應(yīng)的劑量組(此為最高劑量組)。以求出明確的劑量－反應(yīng)關(guān)系。第26頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五

染毒組劑量的選擇可參考三組數(shù)據(jù)。一是以亞慢性閾劑量為出發(fā)點，即以亞慢性閾劑量或其1/5~1/2劑量為慢性毒性試驗的最高劑量，以這一閾劑量的1/50~1/10為慢性毒性試驗的預(yù)計閾劑量組，并以其1/100為預(yù)計的慢性無作用劑量組；一是以急性毒性的LD50劑量為出發(fā)點，即以LD50的1/10劑量為慢性試驗的最高劑量。以LD50的1/100為預(yù)計慢性閾劑量，以LD50的1/1000為預(yù)計的無作用劑量組。各染毒劑量組之間的劑量間距應(yīng)當(dāng)大些，有利于求出劑量-反應(yīng)關(guān)系，也有助于排除實驗動物個體敏感性差異。組間劑量差一般以5~10倍為宜，最低不小于兩倍。第27頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五7、觀察指標(biāo)體重、食物攝取、臨床癥狀、行為、血象和血液化學(xué)、尿的性狀及生化成分以及重點觀察在亞慢性毒性試驗中已經(jīng)顯現(xiàn)的陽性指標(biāo)。注意三點：一是試驗前應(yīng)對一些預(yù)計觀察指標(biāo)，尤其是血、尿常規(guī)及重點測定的生化指標(biāo)進行正常值測定，廢棄個體差異過大的動物；二是在接觸外來化合物期間進行動態(tài)觀察的各項指標(biāo)，應(yīng)與對照組同步測定；三是各化驗測定方法應(yīng)精確、可靠、且進行質(zhì)量控制。第28頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五四、蓄積毒性試驗（一）基本概念蓄積毒性作用：外源化學(xué)物連續(xù)或反復(fù)多次地與機體接觸，當(dāng)其吸收速度超過生物轉(zhuǎn)化和排泄的速度時，在體內(nèi)的總量就會逐漸增加并貯留，這種現(xiàn)象稱為蓄積作用。蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的基礎(chǔ)。1.物質(zhì)蓄積化學(xué)分析的方法能夠測出機體內(nèi)存在該物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物時。

2.功能蓄積（損傷蓄積）多次接觸一定時間后，雖不能測出該物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物，但機體有慢性中毒的癥狀出現(xiàn)。第29頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五（二）試驗方法蓄積系數(shù)法：蓄積系數(shù)是指多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)毒性效應(yīng)的總有效劑量(ED50（n）)與一次染毒的半數(shù)有效量（ED50（1））之比值，毒性效應(yīng)包括死亡。蓄積系數(shù)K＝1、固定劑量法：2、遞增劑量法：第30頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五生物半減期法：由于生物的代謝作用，環(huán)境污染物在機體或器官內(nèi)的量減少到原有量的一半所需要的時間，又稱代謝半減期或生物半衰期(T)生物半減期T＝第31頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五第三節(jié)生物的分子和細胞水平檢測第32頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五

加合物的測定DNA－加合物的測定蛋白加合物的測定一般代謝酶的活性測定乙酰膽堿酯酶腺三磷酶解毒系統(tǒng)酶類誘導(dǎo)作用的檢測混合功能氧化酶的誘導(dǎo)作用谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗氧化防御系統(tǒng)檢測過氧化氫酶谷胱甘肽過氧化酶第33頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五第四節(jié)生物致突變、致畸和致癌效應(yīng)檢測

第34頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五一、致突變試驗（一）基本概念突變：生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生了基因結(jié)構(gòu)的變化。致突變作用：某些物質(zhì)引起生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生基因結(jié)構(gòu)改變的作用。致突變物：具有引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生基因結(jié)構(gòu)變化的物質(zhì)。

（二）分類基因突變：只涉及染色體的某一部分的改變，不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察。染色體畸變：可設(shè)計到染色體的數(shù)目或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可用光學(xué)顯微鏡直接觀察。第35頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五（二）試驗方法（Ames試驗）原理：鼠傷寒沙門氏菌與被檢測化學(xué)物質(zhì)接觸，如果該化學(xué)物質(zhì)具有致突變性，則可使突變性微生物發(fā)生回復(fù)突變，成為野生型微生物。野生型微生物具有合成組氨酸的能力，可在低營養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長，而突變性不具有合成組氨酸的能力，不能在低營養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長。致突變試驗的目的致突變試驗的目的是為了檢查受試物對機體遺傳過程有無影響的方法。致突變試驗方法基因突變試驗，例如Ames試驗，下文以鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗法為例介紹。染色體畸變試驗DNA損傷試驗第36頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五二、致畸效應(yīng)（一）概念畸形：胚胎發(fā)育過程中，由于受到某種因素的影響，使胚胎的細胞分化和器官形成不能正常進行，并出現(xiàn)肉眼可見形態(tài)結(jié)構(gòu)異常者。有畸形的胚胎或者胎仔稱為畸胎。致畸物：凡能引起胚胎發(fā)育障礙而導(dǎo)致胎兒發(fā)生畸形的物質(zhì)稱為致畸物或者致畸源。致畸作用：致畸物通過母體作用于胚胎而引起胎兒畸形的現(xiàn)象稱為致畸作用。致畸作用的毒理學(xué)特點胚胎與致畸物接觸時因胚胎處于不同的發(fā)育階段而呈現(xiàn)不同的敏感性。種屬差異較為明顯。第37頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五化學(xué)致畸作用機理突變引起胚胎發(fā)育異常；對細胞的生長分化較為重要的酶類受到抑制；母體正常代謝過程被破壞；細胞分裂過程的障礙第38頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五（二）致畸試驗1、目的：檢測環(huán)境污染物能否通過妊娠母體引起胚胎畸形。2、受試生物的選擇：一般試驗動物要求其對化學(xué)物質(zhì)的代謝過程與人相似，胎盤結(jié)構(gòu)也相似，還要求孕期短，產(chǎn)仔多，經(jīng)濟實用，如家兔、大鼠、小鼠等。3、劑量分組：正式試驗最少應(yīng)設(shè)3個劑量組，另設(shè)對照組。如受試物溶于某種溶劑中給予動物，則另設(shè)溶劑對照組。有時為了更好地驗證試驗結(jié)果，另設(shè)陽性對照組。原則上，最高劑量組該劑量一般不超過LD50的1/5-1/3，應(yīng)引起母體輕度中毒，即進食量減少、體重減輕、死亡不超過10%；最低劑量組可為LD50的1／100～l/30，不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀，；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀，其劑量與高劑量和低劑量成等比級數(shù)關(guān)系。最高劑量組能引起母體輕度中毒，仍未觀察到致畸作用，則可確認為該因素不具有致畸作用。第39頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五4、動物交配處理將性成熟雌雄動物按雌雄1:1或2:1的比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。確定受孕方法是陰栓檢查或陰道滌片精子檢查，出現(xiàn)陰栓或精子之日即為受孕“0”日，也有人作為第l日。

5、胎仔檢查自然分娩前1～2日將受孕動物處死剖腹，取出子宮及活產(chǎn)胎仔，記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家兔在第29天。胎仔在臨近出生期間，發(fā)育進展極為迅速。相差半日，發(fā)育情況即有顯著差異，骨骼發(fā)育尤為顯著。第40頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五6、下列幾方面進行畸形檢查：外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等。畸形檢查只限活產(chǎn)胎仔。

第41頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五7、結(jié)果評定活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù):即根據(jù)出現(xiàn)的畸形總數(shù)，計算每個活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)的畸形平均數(shù)。

畸形出現(xiàn)率:即作為畸胎的幼仔在活產(chǎn)幼仔總數(shù)中所占的百分率。

母體畸胎出現(xiàn)率

:即出現(xiàn)畸形胎仔的母體在妊娠母體總數(shù)中所占的百分率。

第42頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五8、致畸作用的評價注意與自然變異區(qū)分；注意種屬差異；注意試驗的閾劑量與人類實際可能攝入量之間的差別。第43頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五三、致癌效應(yīng)概念化學(xué)致癌作用：指化學(xué)物質(zhì)引起腫瘤的過程?；瘜W(xué)致癌物：指誘發(fā)腫瘤的化學(xué)物質(zhì)。細胞癌變學(xué)說（1）體細胞突變學(xué)說：致癌因素包括化學(xué)，物理和生物因素等。作用于體細胞的遺傳物質(zhì)DNA,使其發(fā)生了突變，其結(jié)果使細胞的功能發(fā)生異常改變而致癌。即癌變形成的基礎(chǔ)是體細胞發(fā)生了突變。（2）分化障礙學(xué)說：細胞癌變不一定需要體細胞遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，而只是細胞分化過程中有關(guān)的基因調(diào)控過程受到致癌因素的干擾，使細胞分化和增殖發(fā)生紊亂而出現(xiàn)癌變。（3）癌基因?qū)W說：所有細胞DNA分子中都存在有癌基因的遺傳信息，在正常情況下癌基因處于阻遏狀態(tài)，只有細胞內(nèi)有關(guān)的調(diào)節(jié)機制遭到破壞的情況下，基因才能表達，從而使細胞發(fā)生癌變，形成腫瘤。第44頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五癌變過程引發(fā)階段：致癌物直接作用于DNA的初級序列，引起基因突變，使單個細胞或少量細胞發(fā)生永久性的、不可逆的遺傳性改變，此種細胞稱為“啟動細胞”（initiatedcell），誘發(fā)細胞突變的因素稱為啟動劑。促進階段：細胞在致癌作用的第一階段變成啟動細胞后，在某些因素作用下，以相對于周圍正常細胞的選擇優(yōu)勢進行克隆擴增，形成鏡下才能觀察到的或有時肉眼可見的細胞群，即良性腫瘤，這就是致癌作用的第二階段，稱為促進階段，起促進作用的因素稱作促進劑或促癌劑。浸潤和轉(zhuǎn)移階段:已形成的腫瘤不斷發(fā)展，逐漸侵害周圍的正常組織，并擴散到較遠的部位。第45頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五第46頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五第47頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五致癌試驗致癌試驗是檢驗受試物及其代謝產(chǎn)物是否具有致癌效應(yīng)或誘發(fā)腫瘤作用的慢性毒性試驗法。短期篩檢方法長期動物誘癌試驗第48頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五致突變試驗細菌回復(fù)突變試驗（Ames試驗）、染色體畸變試驗、微核試驗、姐妹染色單體交換試驗（SCE）細胞惡性轉(zhuǎn)化試驗細胞形態(tài)、生長能力、生化等表型改變移植于動物體內(nèi)形成腫瘤的能力常用敘利亞倉鼠胚胎細胞小鼠成纖維細胞皮膚、器官、肝等器官組織上皮細胞體外培養(yǎng)短期試驗第49頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)基因動物試驗轉(zhuǎn)染細胞將原癌基因或活化癌基因?qū)爰毎?，觀察致癌物對細胞生長的影響將人類的P450基因?qū)雱游飦碓吹娜狈Υ嗣赶档募毎?，形成具有與人相同的對潛在化學(xué)致癌物代謝能力的細胞轉(zhuǎn)基因動物通過增強或抑制某個基因的表達，了解這個基因的功能人為地把某個基因及其相關(guān)基因組插入或者把某個基因從基因群中去除，這樣得來的新品種稱為轉(zhuǎn)基因動物

通過比較轉(zhuǎn)基因動物和正常動物的生理、生化和病理指標(biāo)，來確定這個基因的功能

第50頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五優(yōu)點人類接觸受試物后往往需要20年左右的潛伏期，動物試驗一般進行1-2年可獲陽性結(jié)果能嚴格控制試驗條件，排除流行病學(xué)不易控制的許多混雜因素的影響

缺點動物試驗結(jié)果外推至人存在不肯定性

動物致癌試驗

第51頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五受試物優(yōu)先選擇短期致癌試驗陽性的化學(xué)物質(zhì)

動物種屬的選擇，應(yīng)考慮受試物可能作用的靶器官

大鼠肝癌小鼠呼吸道和肺腫瘤金黃倉鼠(或稱金黃地鼠)、狗或猴膀胱癌靶器官無法估計大鼠和小鼠

染毒劑量應(yīng)為最大耐受劑量(MTD)或1／2MTD試驗組包括空白和溶劑對照

染毒途徑選用與人類接觸相同的方式

動物應(yīng)選擇自發(fā)腫瘤率低并且對致癌作用不應(yīng)過分敏感

每劑量組每性別動物不得少于50只

第52頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五哺乳動物長期致癌試驗

長期試驗期限依據(jù)不同種屬壽命而定，一般小鼠1.5-2年，大鼠2-2.5年轉(zhuǎn)癌基因或前癌基因小鼠

一種有望代替長期動物致癌的試驗系統(tǒng)可觀察致癌物與基因相互作用以及不同致癌階段所起的作用這類方法對確認致癌物以及理解致癌機制很有幫助不適于作危險性評估

第53頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五嚙齒類動物短期致癌試驗

小鼠肺腫瘤誘發(fā)試驗大鼠肝轉(zhuǎn)移灶誘發(fā)試驗小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗雌性大鼠乳腺癌的誘發(fā)試驗促癌劑的檢查選用適當(dāng)?shù)牡蛣┝繂觿?，啟動?-2周開始用受試物染毒第54頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五腫瘤流行病學(xué)調(diào)查

以腫瘤的發(fā)病率或病死率作為觀察終點

多采用分析流行病學(xué)的方法（回顧性定群調(diào)查、病例對照調(diào)查的方法）

調(diào)查結(jié)果為陽性+劑量-反應(yīng)關(guān)系+得到動物試驗的驗證該化合物為人類致癌物

調(diào)查結(jié)果為陰性不能完全確定受試物為非致癌物，可能是接觸時間短或劑量低所致

流行病學(xué)調(diào)查第55頁，共61頁，2022年，5月20日，5點22分，星期五生物標(biāo)記物流行病學(xué)調(diào)查

內(nèi)劑量

測定細胞、組織、體液內(nèi)某些致癌物或其代謝產(chǎn)物的含量，衡量接觸的水平