第六章-微生物生態(tài)學的研究方法課件

第六章微生物生態(tài)學的研究方法

1第六章微生物生態(tài)學的研究方法11.直接測定法利用光學和電子顯微鏡對樣品中的微生物進行直接觀察，并計算微生物數目或測定絲狀微生物的長度，其結果可以用每單位面積或每單位體積或重量的微生物數目來表示，以此來估計生物量。其優(yōu)點是能夠使人們直接觀察到天然樣品的微生物形態(tài)和微生物在自然樣品所處的位置。缺點是只能取少量的樣品，與微生物所生活的整個自然環(huán)境相比，少量的樣品不能代表整個自然環(huán)境。

第一節(jié)微生物生態(tài)學研究的傳統(tǒng)方法21.直接測定法第一節(jié)微生物生態(tài)學研究的傳統(tǒng)方法22.培養(yǎng)法培養(yǎng)微生物的方法是很多的，一般來說對所采集的樣品應進行適當的稀釋，以便每一個平板上只能生長有一定數目的微生物菌落。其最大優(yōu)點便是可以計算自然樣品中的活微生物數目，并可以辨認真菌、放線菌和細菌。其缺點是造成計算誤差的因素很多。比如：A.自然中的許多微生物細胞成群粘接在一起，用普通的方法很難把它們分開，這樣形成的菌落可能是由許多個細胞增殖而來的，而不是由單個細胞形成的菌落.32.培養(yǎng)法3B.有些微生物在平板上只能形成微菌落，不便于肉眼觀察。C.一般情況下實驗室所用的培養(yǎng)條件很難滿足所有微生物的生長，所用的有限種類的培養(yǎng)基也無法滿足所有微生物的生長。D.在平板上形成的絲狀微生物菌落不知是從孢子而來的還是從菌絲而來的。盡管如此，這種方法還是被廣泛用于微生物生態(tài)學研究中，特別適合用于研究細菌生態(tài)學.4B.有些微生物在平板上只能形成微菌落，不便于肉眼觀察。43.生理生化法同位素示蹤法。我們知道一個微生物群體的大小，那么通過測定H3標記的胸腺嘧啶組入微生物群體DNA中的速率便可以估計微生物的代時。代謝活力測定法。是分析某些特殊酶類的酶活力，這一方法是假設所有待測的細胞都含有這些特殊的酶類，并且所有細胞以同樣的能力使用這些酶類。

53.生理生化法5測定自然樣品中的ATP含量也可以反映微生物代謝活力的大小和生物量的大小。測定葉綠素的含量和其他光合色素的含量可以用來估計藻類和其他光合生物的生物量和代謝活力。最廣泛使用的測定代謝活力的方法是估計整個微生物群體的呼吸作用和藻類的光合作用，測定的對象是O2和CO2量的變化。6測定自然樣品中的ATP含量也可以反映微生物代謝活力的大小和生生理學的方法——Biolog微孔板法

BiologGN板是一種多底物的96孔ELISA反應平板。除對照孔只裝有四氮疊茂，其余95孔作為反應孔還裝有不同的單一碳底物。在進行ELISA反應時，各孔中的微生物利用碳底物，呼吸作用產生電子傳遞，引起四氮疊茂發(fā)生還原反應變?yōu)樽仙Ｎ⑸飳Σ煌嫉孜锏睦们闆r可用發(fā)生反應的孔的分布及反應孔的顏色變化――時間關系即群落水平生理圖譜（CLPP）來表示。通過對孔中顏色變化的光吸收值的測量，可獲得較系統(tǒng)的信息。7生理學的方法——Biolog微孔板法7Biolog微孔板最初是由Biolog公司為了鑒定純種微生物而設計的，其碳源代謝指紋圖可用來鑒定1900多種細菌、酵母和霉菌。1991年，Garland首次將Biolog微孔板應用于土壤微生物群落的研究。現在Biolog微孔板已被廣泛應用于描述各種環(huán)境包括土壤、淡水、沉積物、活性污泥和海水的微生物群落生理狀況。8Biolog微孔板最初是由Biolog公司為了鑒定純種微4.數學模型法

研究微生物生態(tài)學過程中慣用的方法，是以感官觀察為基礎，經過一些實驗將搜集的資料加以分析和解釋，并進一步歸納、假設和推理。在這過程中，其結果大多數是描述性的，數據基本是孤立的。將數學研究應用于微生物生態(tài)學研究中，以統(tǒng)計數據和建立生態(tài)模型來定量描述微生物生態(tài)學問題。首先在實驗室中建立人工的經過簡化的環(huán)境。分解成許多小的、較為簡單的亞系統(tǒng)。這些亞系統(tǒng)之間的相互作用，亞系統(tǒng)之內各種因素的作用則用數學方程式描述?？梢源蟠蟮貕嚎s真實過程的時間、人力和物力，并在短時間內調查生態(tài)演變過程的規(guī)律，并預測生態(tài)演變過程的發(fā)展趨勢，提供最優(yōu)利用方案。

94.數學模型法9第二節(jié)微生物生態(tài)學的分子生物學研究方法微生物分子生態(tài)學方法彌補了傳統(tǒng)的微生物生態(tài)學方法的不足，使人們可以避開傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)過程而直接探討自然界中微生物的種群結構及其與環(huán)境的關系。微生物生態(tài)學研究中采用的分子生物學方法主要有核酸探針技術、PCR擴增技術、rRNA序列同源性分析方法、梯度凝膠電泳方法等。10第二節(jié)微生物生態(tài)學的分子生物學研究方法微生物分子生態(tài)學方法一、核酸探針雜交技術核酸雜交技術快速，能靈敏地探測出環(huán)境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度測定法可直接比較核酸雜交所得到的陽性條帶或斑點就能得出定量的結果，從而反映出相關微生物的存在及功能。其基本原理是:人工合成能與某類群微生物特征基因序列互補的寡聚DNA或RNA探針，并以熒光或放射性標記該探針，然后利用該探針與微生物基因雜交，通過熒光顯微鏡技術或放射自顯影技術對微生物的群落結構進行分析和研究。11一、核酸探針雜交技術核酸雜交技術快速，能靈敏地探測出環(huán)境微核酸探針雜交法的基本的步驟：先對rRNA(基因)序列比對，并對這些序列的特異性進行鑒定，然后進行互補核酸探針的合成和標記，最后對探針的特異性和測定敏感性進行評價和優(yōu)化。目前已經進行測序的核酸序列數目很有限，這樣對某些生態(tài)系統(tǒng)中存在的微生物和核酸序列就不可能進行全面的了解，必須對各種生物的16SrRNA和23SrRNA進行測序和研究，才能設計足夠的探針來監(jiān)測高度可變的目標樣品中的所有微生物。12核酸探針雜交法的基本的步驟：先對rRNA(基因)序列比對，并1313寡聚核苷酸探針由人工合成，一般為30kb左右，具有很高的靈敏度，可用于檢測環(huán)境微生物的單一基因和點突變。目前應用較多的寡聚核苷酸探針是根據細菌rRNA基因的多拷貝且高度保守的DNA片段設計的。這種技術在微生物生態(tài)學研究時具有重要的用途：（1）用于檢測環(huán)境中的微生物、指示生物及某些特定基因型的存在與否；（2）用于檢測某一特定環(huán)境中的微生物種群、數量、分布及其變化，從而預測該環(huán)境中的微生物種群變化趨勢；（3）用于檢測某些微生物的特定基因型在環(huán)境中的動態(tài)。14寡聚核苷酸探針由人工合成，一般為30kb左右，具有很高的靈敏隨著基因工程技術的發(fā)展，新的核酸分子雜交技術不斷出現和完善，核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交包括:組織原位雜交、菌落原位雜交、斑點雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、固相夾心雜交、固化探針雜交、反向雜交。15隨著基因工程技術的發(fā)展，新的核酸分子雜交技術不斷出現和完善，二、PCR特異性擴增技術

PCR技術主要特點是短時間內在實驗室條件下人為地控制并特異擴增目的基因或DNA片段，使研究的目的基因及其環(huán)境樣品中的微量微生物基因得到無限的擴增，為這些基因和微量微生物種群的研究提供了保證。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。

16二、PCR特異性擴增技術PCR技術主要特1、反轉錄PCR(RT-PCR)技術是利用反轉錄酶，使樣品中mRNA反轉錄為DNA，然后利用DNA分析方法進行研究。雖然在活的微生物細胞中mRNA的含量較高，但當細胞死亡和裂解以后，釋放到環(huán)境中的mRNA迅速被降解。因此，RT-PCR技術常被用來分析環(huán)境樣品中活體微生物生存狀況和活性。171、反轉錄PCR(RT-PCR)技術是利用反轉錄酶，使樣品2、競爭性PCR曾被用來測定受多環(huán)芳香烴污染的沉降物中的編碼鄰苯二酚-2，3-加雙氧酶的dmpB基因的濃度。對PCR擴增dmpB的基因片段進行人工改造，使其帶有一個40bp大小的缺失，作為PCR擴增的競爭模板。因此，競爭模板的PCR產物就比目的模板的PCR產物短。用競爭性PCR對二者進行共擴增，通過與競爭模板的濃度進行比較，來定量沉降物中dmpB基因的濃度。182、競爭性PCR曾被用來測定受多環(huán)芳香烴污染的沉降物中的編碼3、限制性片段長度多態(tài)性技術(RFLP)是根據不同生物個體或種群之間DNA片段酶切位點有所差異的特點，利用限制性內切酶進行消化，產生長短、種類、數目不同的限制性片段，然后對這些特定DNA片段的限制性內切酶產物進行分析，根據特定的限制性酶譜圖可對群落中的微生物加以區(qū)分。193、限制性片段長度多態(tài)性技術(RFLP)是根據不同生物個體或限制性片段長度多態(tài)性技術需要依賴Southern技術，需要克隆基因探針，DNA的用量較大且純度要求很高，因此應用受到了一定限制。將PCR應用于RFLP的PCR-RFLP技術則克服了這一缺點。4、PCR-RFLP法是將PCR引物中的一條加以熒光標記，反應后用合適的限制酶切、電泳分析，再根據片斷的大小不同以及標記片斷種類和數量的不同分析群落的結構及組成多樣性。此方法對微生物遺傳多樣性尤其是微生物的種以下分類具有重要意義。20限制性片段長度多態(tài)性技術需要依賴Southern技術，需要克5、隨機引物擴增多態(tài)性(RAPD)也是應用比較廣泛的一項技術。RAPD是用那些對某一特定基因的非特異性的引物來擴增某些片段。RAPD分析用于探測含有混合微生物種群的各種生物反應器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時間內微生物種群的變化以及比較小試規(guī)模和中試規(guī)模的反應器方面是有用的，但還不足以用來估測群落的生物多樣性。215、隨機引物擴增多態(tài)性(RAPD)也是應用比較廣泛的一項技術6、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)是RFLP技術和PCR技術相結合發(fā)展而成的一種新型DNA指紋圖譜技術。具有可靠、有效地揭示微生物多態(tài)性水平的能力，為研究微生物屬以下物種之間的親緣關系，乃至菌株間差異提供了非常有效手段。該技術的主要步驟：（1）樣品染色體DNA的提取和純化；（2）DNA的修飾和模板的制備；（3）AFLP反應；（4）聚丙烯酰胺凝膠電泳分析PCR產物；（5）放射自顯影及數據的數值分析。

226、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)是RFLP技術和PCR技術AFLP技術與其他的DNA指紋技術相比有其獨特的優(yōu)點：（1）AFLP標記具有比RFLP、RAPD標記更為可靠、有效的揭示物種多態(tài)性水平的能力，為研究原核生物屬以下物種之間的親緣關系，乃至菌株之間關系提供了一種有效手段；（2）具有一定的靈活性，可通過特異性PCR引物設計和內切酶組合的選擇，來調整AFLP圖譜中限制性片段的適宜數目；（3）由于使用了嚴格的PCR條件和高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳，因而重復性好，分辨率高。23AFLP技術與其他的DNA指紋技術相比有其獨特的優(yōu)點：（7、末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)，是根據16SrRNA的保守區(qū)設計通用引物。其中一個引物的5′端用熒光物質標記。提取待分析樣品的總DNA，以它為摸板進行PCR擴增，所得到的PCR產物一端就帶有這種熒光標記。將PCR產物用合適的限制性內切酶消化。由于在不同細菌的擴增片段內存在核苷酸序列的差異，酶切位點就會存在差異，酶切后就會產生許多不同長度的限制性片段。消化產物用自動測序儀進行檢測，只有末端帶熒光標記的片段能被檢測到，而其他沒有帶熒光標記的片段則檢測不到。這些末端標記的片段就可以反映微生物群落組成情況，因為不同長度的末端限制性片段必然代表不同的細菌，也就是說一種末端限制性片段至少代表一種細菌。247、末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)，是根據16ST-RFLP主要應用于微生物群落組成和結構、微生物系統(tǒng)發(fā)育及其菌種鑒定等研究，是一種應用比較廣泛的微生物生態(tài)學研究方法。該方法可降低圖譜的復雜性，使結果易于分析，且重復性好，結合克隆、測序，不僅可對已知菌進行鑒定，還有助于發(fā)現新的未知菌，是細菌培養(yǎng)前大量篩查糞便標本菌群的有用方法。25T-RFLP主要應用于微生物群落組成和結構、微生物系統(tǒng)發(fā)育及8、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)利用DNA片段核苷酸組成的差異，造成單鏈構像的不同，使單鏈DNA或RNA分子在電泳時產生特異性譜帶。被應用于微生物鑒定、微生物區(qū)系、微生物多樣性等研究領域。此法的原理是：DNA單鏈構象具有多態(tài)性，由于堿基序列不同而影響其空間構象，它的正常序列與變異序列的單鏈構象不同，因此在電泳上的遷移率也不同。從而可以在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中來分析DNA單鏈中的基因突變。268、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)利用DNA片段核苷酸組成的差異其主要步驟是：（1）提取細菌基因組DNA；（2）用PCR擴增16SrDNA或16S-23SrDNA間隔區(qū)片段；（3）將特異的PCR擴增產物變性，而后快速復性，使之成為具有一定空間結構的單鏈DNA分子；（4）該單鏈DNA分子進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；（5）銀染或放射自顯影；（6）分析得到的特異指紋圖譜，與標準菌株的圖譜相比較，即可分析菌群，對菌株進行鑒定。亦可對特異條帶回收、測序，進行菌種鑒定和分類。27其主要步驟是：（1）提取細菌基因組DNA；（2）用PCR擴增三、rRNA基因同源性分析方法rRNA基因同源性分析方法是綜合應用多項分子生物學技術對細菌中rRNA基因進行分析，從而揭示微生物多樣性。這是分子微生物生態(tài)學中最重要的方法，取得的成果也最多。rRNA在所有的微生物中，功能和進化上是同源的，同源物種之間rRNA結構是相當保守的。因此，為了確定一個分離物為一個分類單元，或證明屬于一個新的分類單元，rRNA基因序列分析還是最可靠的方法。28三、rRNA基因同源性分析方法rRNA基因同源性分析方法是rRNA序列分析技術與其它分子生物技術以及傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)相結合，具備分析微生物多樣性及其發(fā)現新物種的能力，而且提供了一種擺脫傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)方法鑒定環(huán)境微生物的途徑，并已被廣泛應用于對諸如共生細菌和古細菌、趨磁細菌、海洋微型浮游生物以及土壤細菌等微生物類群的研究，并發(fā)現了眾多未知的新序列。rRNA方法還應用到土壤細菌的檢測、基因工程菌的安全性檢查、環(huán)境中微生物間的基因轉移等諸多方面。但是在實際應用中，存在基因文庫構建、全部序列測定周期長，工作量大，費用高等問題。29rRNA序列分析技術與其它分子生物技術以及傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)相結16SrRNA序列分析主要步驟：（1）提取基因組DNA；（2）利用16SrRNA基因兩端的保守序列作為PCR的引物，PCR擴增且純化；（3）以PCR的產物為模板直接進行16SrRNA序列分析；（4）TA克隆建庫或直接測序；（5）用BLAST對所得序列進行比對分析。

3016SrRNA序列分析主要步驟：（1）提取基因組DNA；（2四、變性梯度膠電泳技術變性梯度凝膠電泳(DGGE)的原理是使用一對特異性引物，PCR擴增微生物自然群體的l6SrRNA基因，產生長度相同但序列有異的DNA片段的混合物。然后用DGGE分離產物混合物DGGE方法可用于微生物群落結構的研究、微生物種群動態(tài)的分析、富集培養(yǎng)物及分離物的分析、核糖體RNA同源性的分析。

31四、變性梯度膠電泳技術變性梯度凝膠電泳(DGGE)的原理是使該方法擴增環(huán)境樣品的16SrRNA的部分基因序列(100~400bp)，通過DGGE或TGGE分離，收集不同條帶的DNA測序，再同基因文庫中的現有序列比較，即可確定微生物的種類。該方法的要點在于PCR引物的選擇。由于擴增的環(huán)境樣品成分復雜，所以研究人員都選擇了核糖體小亞基的DNA的保守序列作為引物。由于電泳的限制，被分析的片斷不能大于400bp。為了便于電泳的分析，提高分辨率，引物的5′端有一個40bp左右的發(fā)夾結構，提高了引物合成的成本。32該方法擴增環(huán)境樣品的16SrRNA的部分基因序列(100~43333DGGE對原水及活性污泥的分析原水AS出水原水AS出水34DGGE對原水及活性污泥的分析原水AS出水原水原水測序結果DGGEbandAccessionnumber%IdentityMostcloselyrelatedbacterialsequence1DQ10563997%Unculturedbacterium2DQ20530991%Unculturedepsilonproteobacteria4DQ10564097%Epistylissp5DQ10564198%Unculturedbacterium6DQ10564298%Unculturedbacterium7DQ20531086%Unculturedbacterium9DQ10564394%Unculturedbetaproteobacteria10DQ18163085%UnculturedFerribacteriumsp11DQ18163187%Thermalspringbacterium12DQ181629Noresult13DQ18163285%DechloromonasaromaticRCB多數為非培養(yǎng)的細菌35原水測序結果DGGEAccessionnumber%Ide微生物生態(tài)學的困惑PCR-DGGE定量PCRFISH呼吸醌克隆涌現出大量新技術微生態(tài)系統(tǒng)

得到的信息仍然十分零碎而不確定噬菌體、病毒古細菌、細菌原生動物酵母、霉菌、藻

后生動物克服了分離培養(yǎng)的難題36微生物生態(tài)學的困惑PCR-DGGE涌現出大量新技術微生態(tài)系各種技術的特點PCR-DGGE：便利、信息多但不確定定量PCR：可定量、信息確定性強但少克?。盒畔⒋_定性強但工作量大基因芯片：功能強大但費用昂貴傳統(tǒng)培養(yǎng)技術各種技術需要加強聯(lián)合應用37各種技術的特點PCR-DGGE：便利、信息多但不確定傳統(tǒng)培相信,隨著各種方法學的進一步完善,我們將會逐漸了解到自然生態(tài)環(huán)境中微生物群體多樣性及實際的生存狀態(tài)。38相信,隨著各種方法學的進一步完善,我們將會

第六章微生物生態(tài)學的研究方法

39第六章微生物生態(tài)學的研究方法11.直接測定法利用光學和電子顯微鏡對樣品中的微生物進行直接觀察，并計算微生物數目或測定絲狀微生物的長度，其結果可以用每單位面積或每單位體積或重量的微生物數目來表示，以此來估計生物量。其優(yōu)點是能夠使人們直接觀察到天然樣品的微生物形態(tài)和微生物在自然樣品所處的位置。缺點是只能取少量的樣品，與微生物所生活的整個自然環(huán)境相比，少量的樣品不能代表整個自然環(huán)境。

第一節(jié)微生物生態(tài)學研究的傳統(tǒng)方法401.直接測定法第一節(jié)微生物生態(tài)學研究的傳統(tǒng)方法22.培養(yǎng)法培養(yǎng)微生物的方法是很多的，一般來說對所采集的樣品應進行適當的稀釋，以便每一個平板上只能生長有一定數目的微生物菌落。其最大優(yōu)點便是可以計算自然樣品中的活微生物數目，并可以辨認真菌、放線菌和細菌。其缺點是造成計算誤差的因素很多。比如：A.自然中的許多微生物細胞成群粘接在一起，用普通的方法很難把它們分開，這樣形成的菌落可能是由許多個細胞增殖而來的，而不是由單個細胞形成的菌落.412.培養(yǎng)法3B.有些微生物在平板上只能形成微菌落，不便于肉眼觀察。C.一般情況下實驗室所用的培養(yǎng)條件很難滿足所有微生物的生長，所用的有限種類的培養(yǎng)基也無法滿足所有微生物的生長。D.在平板上形成的絲狀微生物菌落不知是從孢子而來的還是從菌絲而來的。盡管如此，這種方法還是被廣泛用于微生物生態(tài)學研究中，特別適合用于研究細菌生態(tài)學.42B.有些微生物在平板上只能形成微菌落，不便于肉眼觀察。43.生理生化法同位素示蹤法。我們知道一個微生物群體的大小，那么通過測定H3標記的胸腺嘧啶組入微生物群體DNA中的速率便可以估計微生物的代時。代謝活力測定法。是分析某些特殊酶類的酶活力，這一方法是假設所有待測的細胞都含有這些特殊的酶類，并且所有細胞以同樣的能力使用這些酶類。

433.生理生化法5測定自然樣品中的ATP含量也可以反映微生物代謝活力的大小和生物量的大小。測定葉綠素的含量和其他光合色素的含量可以用來估計藻類和其他光合生物的生物量和代謝活力。最廣泛使用的測定代謝活力的方法是估計整個微生物群體的呼吸作用和藻類的光合作用，測定的對象是O2和CO2量的變化。44測定自然樣品中的ATP含量也可以反映微生物代謝活力的大小和生生理學的方法——Biolog微孔板法

BiologGN板是一種多底物的96孔ELISA反應平板。除對照孔只裝有四氮疊茂，其余95孔作為反應孔還裝有不同的單一碳底物。在進行ELISA反應時，各孔中的微生物利用碳底物，呼吸作用產生電子傳遞，引起四氮疊茂發(fā)生還原反應變?yōu)樽仙?。微生物對不同碳底物的利用情況可用發(fā)生反應的孔的分布及反應孔的顏色變化――時間關系即群落水平生理圖譜（CLPP）來表示。通過對孔中顏色變化的光吸收值的測量，可獲得較系統(tǒng)的信息。45生理學的方法——Biolog微孔板法7Biolog微孔板最初是由Biolog公司為了鑒定純種微生物而設計的，其碳源代謝指紋圖可用來鑒定1900多種細菌、酵母和霉菌。1991年，Garland首次將Biolog微孔板應用于土壤微生物群落的研究?，F在Biolog微孔板已被廣泛應用于描述各種環(huán)境包括土壤、淡水、沉積物、活性污泥和海水的微生物群落生理狀況。46Biolog微孔板最初是由Biolog公司為了鑒定純種微4.數學模型法

研究微生物生態(tài)學過程中慣用的方法，是以感官觀察為基礎，經過一些實驗將搜集的資料加以分析和解釋，并進一步歸納、假設和推理。在這過程中，其結果大多數是描述性的，數據基本是孤立的。將數學研究應用于微生物生態(tài)學研究中，以統(tǒng)計數據和建立生態(tài)模型來定量描述微生物生態(tài)學問題。首先在實驗室中建立人工的經過簡化的環(huán)境。分解成許多小的、較為簡單的亞系統(tǒng)。這些亞系統(tǒng)之間的相互作用，亞系統(tǒng)之內各種因素的作用則用數學方程式描述?？梢源蟠蟮貕嚎s真實過程的時間、人力和物力，并在短時間內調查生態(tài)演變過程的規(guī)律，并預測生態(tài)演變過程的發(fā)展趨勢，提供最優(yōu)利用方案。

474.數學模型法9第二節(jié)微生物生態(tài)學的分子生物學研究方法微生物分子生態(tài)學方法彌補了傳統(tǒng)的微生物生態(tài)學方法的不足，使人們可以避開傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)過程而直接探討自然界中微生物的種群結構及其與環(huán)境的關系。微生物生態(tài)學研究中采用的分子生物學方法主要有核酸探針技術、PCR擴增技術、rRNA序列同源性分析方法、梯度凝膠電泳方法等。48第二節(jié)微生物生態(tài)學的分子生物學研究方法微生物分子生態(tài)學方法一、核酸探針雜交技術核酸雜交技術快速，能靈敏地探測出環(huán)境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度測定法可直接比較核酸雜交所得到的陽性條帶或斑點就能得出定量的結果，從而反映出相關微生物的存在及功能。其基本原理是:人工合成能與某類群微生物特征基因序列互補的寡聚DNA或RNA探針，并以熒光或放射性標記該探針，然后利用該探針與微生物基因雜交，通過熒光顯微鏡技術或放射自顯影技術對微生物的群落結構進行分析和研究。49一、核酸探針雜交技術核酸雜交技術快速，能靈敏地探測出環(huán)境微核酸探針雜交法的基本的步驟：先對rRNA(基因)序列比對，并對這些序列的特異性進行鑒定，然后進行互補核酸探針的合成和標記，最后對探針的特異性和測定敏感性進行評價和優(yōu)化。目前已經進行測序的核酸序列數目很有限，這樣對某些生態(tài)系統(tǒng)中存在的微生物和核酸序列就不可能進行全面的了解，必須對各種生物的16SrRNA和23SrRNA進行測序和研究，才能設計足夠的探針來監(jiān)測高度可變的目標樣品中的所有微生物。50核酸探針雜交法的基本的步驟：先對rRNA(基因)序列比對，并5113寡聚核苷酸探針由人工合成，一般為30kb左右，具有很高的靈敏度，可用于檢測環(huán)境微生物的單一基因和點突變。目前應用較多的寡聚核苷酸探針是根據細菌rRNA基因的多拷貝且高度保守的DNA片段設計的。這種技術在微生物生態(tài)學研究時具有重要的用途：（1）用于檢測環(huán)境中的微生物、指示生物及某些特定基因型的存在與否；（2）用于檢測某一特定環(huán)境中的微生物種群、數量、分布及其變化，從而預測該環(huán)境中的微生物種群變化趨勢；（3）用于檢測某些微生物的特定基因型在環(huán)境中的動態(tài)。52寡聚核苷酸探針由人工合成，一般為30kb左右，具有很高的靈敏隨著基因工程技術的發(fā)展，新的核酸分子雜交技術不斷出現和完善，核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交包括:組織原位雜交、菌落原位雜交、斑點雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、固相夾心雜交、固化探針雜交、反向雜交。53隨著基因工程技術的發(fā)展，新的核酸分子雜交技術不斷出現和完善，二、PCR特異性擴增技術

PCR技術主要特點是短時間內在實驗室條件下人為地控制并特異擴增目的基因或DNA片段，使研究的目的基因及其環(huán)境樣品中的微量微生物基因得到無限的擴增，為這些基因和微量微生物種群的研究提供了保證。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。

54二、PCR特異性擴增技術PCR技術主要特1、反轉錄PCR(RT-PCR)技術是利用反轉錄酶，使樣品中mRNA反轉錄為DNA，然后利用DNA分析方法進行研究。雖然在活的微生物細胞中mRNA的含量較高，但當細胞死亡和裂解以后，釋放到環(huán)境中的mRNA迅速被降解。因此，RT-PCR技術常被用來分析環(huán)境樣品中活體微生物生存狀況和活性。551、反轉錄PCR(RT-PCR)技術是利用反轉錄酶，使樣品2、競爭性PCR曾被用來測定受多環(huán)芳香烴污染的沉降物中的編碼鄰苯二酚-2，3-加雙氧酶的dmpB基因的濃度。對PCR擴增dmpB的基因片段進行人工改造，使其帶有一個40bp大小的缺失，作為PCR擴增的競爭模板。因此，競爭模板的PCR產物就比目的模板的PCR產物短。用競爭性PCR對二者進行共擴增，通過與競爭模板的濃度進行比較，來定量沉降物中dmpB基因的濃度。562、競爭性PCR曾被用來測定受多環(huán)芳香烴污染的沉降物中的編碼3、限制性片段長度多態(tài)性技術(RFLP)是根據不同生物個體或種群之間DNA片段酶切位點有所差異的特點，利用限制性內切酶進行消化，產生長短、種類、數目不同的限制性片段，然后對這些特定DNA片段的限制性內切酶產物進行分析，根據特定的限制性酶譜圖可對群落中的微生物加以區(qū)分。573、限制性片段長度多態(tài)性技術(RFLP)是根據不同生物個體或限制性片段長度多態(tài)性技術需要依賴Southern技術，需要克隆基因探針，DNA的用量較大且純度要求很高，因此應用受到了一定限制。將PCR應用于RFLP的PCR-RFLP技術則克服了這一缺點。4、PCR-RFLP法是將PCR引物中的一條加以熒光標記，反應后用合適的限制酶切、電泳分析，再根據片斷的大小不同以及標記片斷種類和數量的不同分析群落的結構及組成多樣性。此方法對微生物遺傳多樣性尤其是微生物的種以下分類具有重要意義。58限制性片段長度多態(tài)性技術需要依賴Southern技術，需要克5、隨機引物擴增多態(tài)性(RAPD)也是應用比較廣泛的一項技術。RAPD是用那些對某一特定基因的非特異性的引物來擴增某些片段。RAPD分析用于探測含有混合微生物種群的各種生物反應器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時間內微生物種群的變化以及比較小試規(guī)模和中試規(guī)模的反應器方面是有用的，但還不足以用來估測群落的生物多樣性。595、隨機引物擴增多態(tài)性(RAPD)也是應用比較廣泛的一項技術6、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)是RFLP技術和PCR技術相結合發(fā)展而成的一種新型DNA指紋圖譜技術。具有可靠、有效地揭示微生物多態(tài)性水平的能力，為研究微生物屬以下物種之間的親緣關系，乃至菌株間差異提供了非常有效手段。該技術的主要步驟：（1）樣品染色體DNA的提取和純化；（2）DNA的修飾和模板的制備；（3）AFLP反應；（4）聚丙烯酰胺凝膠電泳分析PCR產物；（5）放射自顯影及數據的數值分析。

606、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)是RFLP技術和PCR技術AFLP技術與其他的DNA指紋技術相比有其獨特的優(yōu)點：（1）AFLP標記具有比RFLP、RAPD標記更為可靠、有效的揭示物種多態(tài)性水平的能力，為研究原核生物屬以下物種之間的親緣關系，乃至菌株之間關系提供了一種有效手段；（2）具有一定的靈活性，可通過特異性PCR引物設計和內切酶組合的選擇，來調整AFLP圖譜中限制性片段的適宜數目；（3）由于使用了嚴格的PCR條件和高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳，因而重復性好，分辨率高。61AFLP技術與其他的DNA指紋技術相比有其獨特的優(yōu)點：（7、末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)，是根據16SrRNA的保守區(qū)設計通用引物。其中一個引物的5′端用熒光物質標記。提取待分析樣品的總DNA，以它為摸板進行PCR擴增，所得到的PCR產物一端就帶有這種熒光標記。將PCR產物用合適的限制性內切酶消化。由于在不同細菌的擴增片段內存在核苷酸序列的差異，酶切位點就會存在差異，酶切后就會產生許多不同長度的限制性片段。消化產物用自動測序儀進行檢測，只有末端帶熒光標記的片段能被檢測到，而其他沒有帶熒光標記的片段則檢測不到。這些末端標記的片段就可以反映微生物群落組成情況，因為不同長度的末端限制性片段必然代表不同的細菌，也就是說一種末端限制性片段至少代表一種細菌。627、末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)，是根據16ST-RFLP主要應用于微生物群落組成和結構、微生物系統(tǒng)發(fā)育及其菌種鑒定等研究，是一種應用比較廣泛的微生物生態(tài)學研究方法。該方法可降低圖譜的復雜性，使結果易于分析，且重復性好，結合克隆、測序，不僅可對已知菌進行鑒定，還有助于發(fā)現新的未知菌，是細菌培養(yǎng)前大量篩查糞便標本菌群的有用方法。63T-RFLP主要應用于微生物群落組成和結構、微生物系統(tǒng)發(fā)育及8、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)利用DNA片段核苷酸組成的差異，造成單鏈構像的不同，使單鏈DNA或RNA分子在電泳時產生特異性譜帶。被應用于微生物鑒定、微生物區(qū)系、微生物多樣性等研究領域。此法的原理是：DNA單鏈構象具有多態(tài)性，由于堿基序列不同而影響其空間構象，它的正常序列與變異序列的單鏈構象不同，因此在電泳上的遷移率也不同。從而可以在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中來分析DNA單鏈中的基因突變。648、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)利用DNA片段核苷酸組成的差異其主要步驟是：（1）提取細菌基因組DNA；（2）用PCR擴增16SrDNA或16S-23SrDNA間隔區(qū)片段；（3）將特異的PCR擴增產物變性，而后快速復性，使之成為具有一定空間結構的單鏈DNA分子；（4）該單鏈DNA分子進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；（5）銀染或放射自顯影；（6）分析得到的特異指紋圖譜，與標準菌株的圖譜相比較，即可分析菌群，對菌株進行鑒定。亦可對特異條帶回收、測序，進行菌種鑒定和分類。65其主要步驟是：（1）提取細菌基因組DNA；（2）用PCR擴增三、rRNA基因同源性分析方法rRNA基因同源性分析方法是綜合應用多項分子生物學技術對細菌中rRNA基因進行分析，從而揭示微生物多樣性。這是分子微生物生態(tài)學中最重要的方法，取得的成果也最多。rRNA在所有的微生物中，功能和進化上是同源的，同源物種之間rRNA結構是相當保守的。因此，為了確定一個分離物為一個分類單元，或證明屬于一個新的分類單元，rRNA基因序列分析還是最可靠的方法。66三、rRNA基因同源性分析方法rRNA基因同源性分析方法是rRNA序列分析技術與其它分子生物技術以及傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)相結合，具備分析微生物多樣性及其發(fā)現新物種的能力，而且提供了一種擺脫傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)方法鑒定環(huán)境微生物的途徑，并已被廣泛應用于對諸如共生細菌和古細菌、趨磁細菌、海洋微型浮游生物以及土壤細菌等微生物類群的研究，并發(fā)現了眾多未知的新序列。rRNA方法還應用到土壤細菌的檢測、基因工程菌的安全性檢查、環(huán)境中微生物間的基因轉移等諸多方面。但是在實際應用中，存在基因文庫構建、全部序列測定周期長，工作量大，費用高等問題。67rRNA序列分析技術與其它分子生物技術以及傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)相結16SrRNA序列分析主要步驟：（1）提取基因組DNA；（2）利用16SrRNA基因兩端的保守序列作為PCR的引物，PCR擴增且純化；（3）以PCR的產物為模板直接進行16SrRNA序列分析；（4）