分子生物學技術(shù)精講

5.1重組DNA技術(shù)回顧本章內(nèi)容介紹了DNA重組研究的發(fā)現(xiàn)歷史以及2個基本概念，粘性末端和載體粘性末端，眾所周知，就是一段DNA雙分子結(jié)構(gòu)末端突出的只有一條邊的幾個bp長的DNA短片段，有特定的酶與之對應(yīng)，能夠?qū)λM行切割，即斷裂堿基互補配對的分子間作用力，并且切斷特定幾個堿基組合的一個磷酸二酯鍵，使之片段分離。而載體就是一個質(zhì)粒了，之所以它能夠成為載體，必然有其必須的一面，即：能夠自我復(fù)制和表達，有特定的酶切位點。大多數(shù)還有其特定的篩選標記，如氨芐抗性等等。現(xiàn)代常用的克隆載體為大腸桿菌DH5α，表達載體BL21，這兩種在分子生物學上比較通用。本章內(nèi)容還涉及了氯化鈣處理后的大腸桿菌能夠變成感受態(tài)細胞。氯化鈣能夠打通細菌的細胞壁和細胞膜，從而能夠讓質(zhì)粒載體進入細胞。另外，T4連接酶能夠連接片段和T載體。他們之間連接不靠粘性末端，而靠taq酶的一種特性。Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物末端加一個A，而T載體剛好是有T在外部暴露的，從而很容易連接。5.2DNA基本操作技術(shù)5.21核酸凝膠電泳技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)是利用DNA分子在凝膠中的阻滯效果而實現(xiàn)的。從分子層面來看，瓊脂糖或者聚丙烯酰胺一個分子和一個分子之間是有空隙的，不同大小的DNA片段通過同一種空隙的能力是不一樣的，大的過空隙的時候，就慢，小的就快，就像胖子和瘦子穿過一個過道是一個效果。所以就在通過空隙的時候DNA不同大小的片段就被分離開了。而凝膠的濃度，決定了這種空隙的大小，越濃，那么空隙就越小，“胖子”穿過空隙就會越慢。從而會有凝膠濃度不同，能分離的DNA片段大小不一樣的效果。核酸染料溴乙錠EB，結(jié)合在DNA分子相鄰堿基之間，它在紫外熒光下可以顯示顏色，便于我們識別DNA在凝膠上的位置。脈沖場凝膠電泳用于分離超大的DNA片段，因為0.3%的瓊脂糖最多分離50000bp的長度，（太胖了，跑得太慢，就基本不動了）所以當我們需要分離的更大，就不得不讓DNA在凝膠中反復(fù)跑，如果只是像普通電泳中那種直線跑膠方法，那么需要的膠長度，就超乎了你的想象了，所以通過不同的變換方位延長跑膠的長度，一般走的是Z字形，而之所以用脈沖場，就是他太胖了，需要很大的力量推著他走，所以增加了大的電壓。5.22細菌轉(zhuǎn)化與目標DNA分子的增值細胞轉(zhuǎn)化介紹了2中細胞轉(zhuǎn)化的方法，一種是大腸桿菌的氯化鈣改變細胞膜通透性的方法，一種是電轉(zhuǎn)化。兩種都是通過將細胞的膜和細胞壁打透，從而能讓分子質(zhì)粒進入細胞。氯化鈣法處理細胞是通過低溫下氯化鈣造成細胞膨脹，增加了細胞膜通透性，能夠粘附DNA分子在其表面熱激的時候，黏附的分子由于分子熱運動加快，細胞膜透性好，就進入了細胞內(nèi)部。熱激完了以后冷激，細胞膜的通透性就會再次下降，成了包含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，能夠用細菌復(fù)制和生長，得到大量所需要的質(zhì)粒。電擊轉(zhuǎn)化是電脈沖打透了細胞壁，DNA從孔洞中進入細胞。5.23聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)——PCRPCR，聚合酶鏈式反應(yīng)，用于體外擴增所需要的目的片段，接下來直入正題。首先回顧PCR的基礎(chǔ)原理：PCR儀，個人認為就是一個能夠?qū)崿F(xiàn)快速變溫的溫度控制裝置，別無他用，而在聚合酶鏈式反應(yīng)中，溫度的快速改變，是控制DNA結(jié)構(gòu)改變所必須的。1，DNA一般為雙鏈，首先，我們需要把它進行解鏈，從而產(chǎn)生兩條單鏈，讓引物結(jié)合上去，達到復(fù)制的目的。一開始我們設(shè)置的高溫，剛好能夠使得DNA雙鏈解體。約94~98℃，用3到5min即可。此反應(yīng)中我們用的TAQ酶（嗜熱桿菌中提取的DNA聚合酶）也是高溫啟動的，初始的高溫適合其開始在體系中的活性，但是約15分鐘的高溫會導致其半衰期，從而失去活性，使得反應(yīng)效率降低，所以高溫的時間不宜過長。2，在2~4步驟中，我們進行循環(huán)，以達到指數(shù)擴增的作用，大量得到所需DNA產(chǎn)物。3，在2步循環(huán)中，第一次的高溫是進行預(yù)變性，在每一次的開鏈中都需要在進行一次變性，從而達到開鏈的目的。預(yù)變性同樣是94~98℃，時間控制在30S到2min之間，根據(jù)片段不同長度而不同。4，在第三步循環(huán)中，我們進行退火，使得溫度控制在引物和模板鏈剛好能夠結(jié)合的溫度使得引物和模板鏈進行結(jié)合。溫度約為37~70℃，引物是個人根據(jù)基因片段不同而自行設(shè)置的，具體設(shè)置方法參見引物設(shè)計的內(nèi)容。設(shè)計引物的時候會給出相應(yīng)的參考TM值，一般小于TM值5℃算作本次PCR的退火溫度。如果不行，則根據(jù)具體情況調(diào)整，梯度PCR，tallPCR反應(yīng)都是可以嘗試的。5，第四步延伸，在引物結(jié)合在模板上進行合成，復(fù)制得到引物起始和模板鏈尾部的新片段。溫度約為72℃，時間：taq酶的活力是1000bp/min，根據(jù)所需片段，自行計算延伸時間。Pfu酶延伸速率為500BP/min在多次循環(huán)以后，得到的片段大多是兩個引物控制的部分。即目的片段。在第二步到第四步的過程中每次經(jīng)過解鏈，引物結(jié)合目的片段，延伸，這三個過程，就新生成一次的目的片段，所以按照推測，PCR產(chǎn)物應(yīng)該是成對數(shù)增長的。即一變二二變四的反應(yīng)過程。但是酶的活力和反應(yīng)體系等的影響，并不能保證每一次都能夠完全反應(yīng)，所以PCR產(chǎn)物的增長曲線，實際上更接近于細菌的生長期，對數(shù)期成熟期和消亡期的增長曲線。6，第五步進行補齊延伸，因為酶的活力并不是穩(wěn)定的，我們的條件也不一定能夠達到標準反應(yīng)條件，所以酶的效果并不一定能夠達到最好的情況，最后設(shè)置7到10分鐘的補齊延伸，能夠讓得到產(chǎn)物完整性更加好。程序的編寫很大程度上取決于酶的使用說明書，參照說明書來寫。最后需要設(shè)置4℃恒久保存， 在來不及收樣的時候能夠保持其片段不變性。PCR體系設(shè)計：一般PCR采用50微升體系，加入以下試劑PSBuffer（5X）5μLdNTP4μL模板1μg（cDNA200ng足夠，基因組400ng一般可以）正向引物10μM的加入1μL反向引物同上酶活力達到5U即可，一般0.5μL足夠水（ddH2O）補齊50μL體系PCR體系根據(jù)酶的不同而不同，每一種酶的說明書上都有標明體系和所需程序。5.24實時定量PCR本書是從實驗方法來進行分類的，我們對于實時定量不好理解是因為不知道他是干什么的，為了克服這一點，筆者從源頭開始給大家說起。實時定量PCR，應(yīng)用以上PCR反應(yīng)，求測cDNA底物的濃度。但是為什么要測cDNA底物的濃度呢？因為cDNA是從mRNA反轉(zhuǎn)錄而來的。我們提取了總mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過特異引物，定量某些基因的cDNA量，也就是定量那些基因在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄量，即mRNA量。得到轉(zhuǎn)錄量，就知道在這個水平上，這個基因的基本情況，如果我們做某些條件對這些基因的影響，只需要改變條件，測定轉(zhuǎn)錄量的變化，就能夠確定他在這個水平上，是否有一定影響。實時定量中選用了SYBRGreen作為熒光底物，它能夠結(jié)合在到DNA分子，從而通過熒光量，確定DNA分子的含量。通過光學元件的測定，判斷生成DNA的分子量，由PCR基本原理，反推底物量。（實際上不是按照對數(shù)算的，機器自動設(shè)置了一個效率，如果有興趣，可以參看附件中的PPT）那么，為什么能夠確定所生產(chǎn)的片段為目的片段呢？實際上，定量PCR所合成的產(chǎn)物，并非是目的基因本身，而只是其一小部分。定量PCR所合成的片段是所給出定量引物之間的那一部分，定量后的產(chǎn)物不能作為完整的cDNA模板。定量PCR不要求產(chǎn)物是什么，有多少，只要求反推模板濃度，所以定量引物要確切的反映是目的基因，而并非要產(chǎn)物多少。定量引物一般非常特異，而合成片段總長度，或許只有100bp長。Taqman探針這是一種很簡單的熒光猝滅技術(shù)。探針的兩頭有兩個集團，他們接近的時候能夠引發(fā)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光不會被檢測到，而探針大小保證兩個集團足夠近。探針特異性結(jié)合在DNA鏈的某些位置（堿基互補配對），當taq酶在延伸階段活動到探針一側(cè)，并因為其外切活性，將一個集團切割下來，與另一個集團分離較遠的時候，儀器就能夠檢測到熒光了。探針在taq酶延伸過程中被切得粉碎，兩個熒光集團就會分布在整個空間，距離足夠遠所以熒光會一直存在，根據(jù)最后熒光量，來判斷產(chǎn)生了多少產(chǎn)物。5.25基因組DNA文庫構(gòu)建構(gòu)建DNA文庫，其實就是將某生物的基因組放到細菌里，一個細菌的培養(yǎng)皿就是一個文庫。通過隨機切割酶，我們將基因組切成小一些的片段，然后將切好的片段，連接到質(zhì)粒載體上，然后把這些包含不同片段的載體，轉(zhuǎn)化到細菌里，就形成了一個基因文庫。培養(yǎng)皿上有各種菌落，雖然他們看起來是一樣的，但是所包含的某生物的基因組的片段是不一樣的。所有的菌落，構(gòu)成了一個完整的DNA文庫。5.3RNA上基本操作技術(shù)5.31，總RNA提取現(xiàn)最常用的的RNA提取方法是trizol法，無論動物還是植物組織，都用異硫氰酸胍和苯酚來抽提RNA。RNA提取的方法不詳細介紹，基本流程為破裂細胞，萃取提取RNA，洗滌。OD（吸光度）在2。0純度最佳，看提取RNA質(zhì)量還可以用電泳。因為真和生物28s和18s的rRNA是高度保守的（在多種生物中是一樣的），如果瓊脂糖凝膠電泳檢測有這兩個，且比例（亮度）接近2:1，則是很好的。提取總RNA一般是為了反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為模板，從而進行實時定量PCR，驗證轉(zhuǎn)錄量。5.3.2mRNA的純化現(xiàn)在用纖維素柱色譜法來獲得純的mRNA，一般用試劑盒來做。用的物理原理的磁場吸附。這里不是重點考點，一般考試不會涉及，所以本文不加以贅述。5．3.3cDNA的合成用反轉(zhuǎn)錄酶來進行cDNA的合成常用引物為oligodT，引物凡是真核RNA，都會在末端有polyA

(重復(fù)多個A)尾巴，而且在翻譯中，這個是不會產(chǎn)生蛋白的，所以反轉(zhuǎn)錄的時候我們就用很多T來做引物，從而擴增cDNA的一條鏈。在合成中，很多人都以為只有一條引物是無法擴增的，但是你可以想象，cDNA另一端當酶走到的時候，會自然脫落，無法延長，不會產(chǎn)生錯誤，所以一條引物足夠。而且PCR反應(yīng)中另一條引物并不是讓酶來脫落的，而是從另一端合成的開始。兩者相交部分退火時候相結(jié)合，從而產(chǎn)生大量的目的片段。OligodT是有酶切位點在末尾的，從而能夠方便的連接到載體上。至于甲基化修飾，就是防止酶切割的，因為酶切割的時候活性中心固定識別不帶甲基化的核苷酸，當加入甲基化以后，這個位點原來能夠作用的酶產(chǎn)生了空間位阻，不容易結(jié)合了，從而導致不能切割。5.3．4cDNA文庫構(gòu)建同基因組文庫一樣，只是反轉(zhuǎn)錄后形成的轉(zhuǎn)錄基因庫。5.3.5基因文庫篩選1核酸雜交法：首先用纖維素膜來影印一個文庫的菌落，然后裂解了膜上的細菌，使質(zhì)粒暴露在膜上。用蛋白酶出去蛋白質(zhì)，只剩下質(zhì)粒DNA和細菌的基因組DNA，80℃考一下固定，然后用特異探針雜交，如果有相應(yīng)克隆的話，在放射自顯影下能夠看出，再從培養(yǎng)皿中找到相應(yīng)菌落提取質(zhì)粒，就能夠得到相應(yīng)的目的基因片段的載體了。2PCR篩選法：通過特異引物PCR特定目的片段，如果模板上存在目的片段，則有擴增，否則無擴增。3免疫篩選法：此篩選法主要針對于表達文庫的篩選，抗體特異結(jié)合目的蛋白，以確定文庫中是否存在目的蛋白。5.4SNP單核苷酸多態(tài)性這個指的就是每個堿基的不同。在生物體內(nèi)，并不是所有的AT,CG都是這樣配對的，也有可能AG,CT或者其他形式，當發(fā)生了這些的時候，就算作一個SNP位點。SNP由于他的遺傳穩(wěn)定性而被提出來，因為它算作一種突變，卻又是較為穩(wěn)定的突變（在染色體的部分位置上）5.42SNP檢測方法一般是酶切，因為很多酶切位點都是特定的堿基匹配，當酶切不能完成的時候，就證明位點改變了，而在基因組中，發(fā)現(xiàn)了這種改變，就看做一個SNP。當然，也可能選取某些類酶切位點，與真正酶切位點不完全相同，但是切開的時候，也就發(fā)現(xiàn)了SNP。測序方法檢測SNP成本較高，一般實驗室承擔不起。1基因芯片技術(shù)：在固體物質(zhì)上加入特定分子，能夠和特意位點結(jié)合，通過熒光檢測來實現(xiàn)判斷。一般都由公司做好直接發(fā)回結(jié)果，所以方法學習參照公司的芯片介紹，考試內(nèi)容中基本不占比例。2Taqman探針技術(shù)：同實時定量PCR的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。3分子信標：當和特異物質(zhì)結(jié)合的時候有熒光，不經(jīng)過切割反應(yīng)，考試中基本不占比例。4焦磷酸測序法：每一輪反應(yīng)只有一種dNTP，所以當結(jié)合的時候會產(chǎn)生能量，放出熒光。這個本組不是很懂，基本過程如此，至于怎么加入的只有一種還能實現(xiàn)自動化，請參照公司的說明書。5.5基因克隆技術(shù)：RACE技術(shù)：此技術(shù)為經(jīng)典PCR技術(shù)之一。5’RACE——獲得5’缺失序列：首先由mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用已知的臨近3’端的序列設(shè)計特異引物GSP1，反轉(zhuǎn)錄出mRNA的互補鏈，此時互補鏈的3’也就是原鏈的5’部分是不知道的。降解掉mRNA，用末端轉(zhuǎn)移酶（此酶在末端，即3’端加尾）加入大量dCTP。用錨定此dCTP的引物來和3’端另一個知道的特異引物GSP2擴增，就能得到未知區(qū)域的基因了。而未知區(qū)域，就是原mRNA的5’端。在這里，有幾點解釋：兩次用不同的GSP1和GSP2能夠進一步防止基因的非特異性擴增。因為如果GSP1能夠擴增兩條鏈，（基于基因組的復(fù)雜性）那么有了GSP2則很可能排除一條鏈的影響，因為那一條鏈，可能不包含GSP2所能結(jié)合的位置。之所以先反轉(zhuǎn)錄，是因為下一步利用末端轉(zhuǎn)移酶的特性，來給產(chǎn)物加尾，從而特異擴增未知區(qū)域。3’RACE——獲得3’缺失序列：不必用GSP1了，因為mRNA子代多聚A的尾巴，其他方法和5’RACE相同。期間需要去除甲基化帽子結(jié)構(gòu)，請參照課本。5.52cDNA差示分析法1987年發(fā)表的PCR經(jīng)典技術(shù)。此技術(shù)基于退火時候的特異結(jié)合，越穩(wěn)定，越互補，越能結(jié)合。既然要進行差示分析，就必然需要2種存在差異的樣品。我們通過過表達或者基因敲除等方法，獲得了兩種不同的樣品，他們大部分的序列都是一樣的，但是有一段序列，暫且稱之為A，一個有，另一個沒有，或者很少。那么，這個A就是差異了?，F(xiàn)在通過這個方法我們來放大這個差異，讓A在總體中特異性擴增。首先將兩種總mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,然后把他們用4堿基內(nèi)切酶消化。用4堿基內(nèi)切酶是讓他們能夠成為均一的256bp長的片段，這樣其實A序列就被切碎了，如果他大于256bp的話。但是先不管這些，因為差異A片段，仍然是存在的。通過這次切割，方便以后的作業(yè)。（cDNA是mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，一般不會長）切割以后，兩種樣品分別加上12/24堿基接頭，就是在兩端加上如同前文所提到的oligo(dT)一類的東西，用做引物，這里加的接頭是帶有粘性末端的，這是為了方便以后的工作，以便除去一個接頭，方便PCR擴增。兩種樣品的接頭是不一樣的，讓他倆分別通過自己的接頭，進行PCR擴增，這樣兩種樣品的cDNA就有了較為大量的樣品了。此時，將兩個樣品分別去除原有接頭，再把包含有A的那個樣品連上新的接頭，并把二者混合。這時候會出現(xiàn)什么情況呢？我們在做下一步PCR的時候，底物中有大量的各種DNA片段，但是A樣品是有完全的接頭的，而其他的各種DNA片段，有很多是有接頭的，也有很多是沒有接頭的，在PCR退火的過程中，有接頭的部分和沒有接頭的部分都很多，可以互相退火，相互結(jié)合這樣，他們只有一部分的退火產(chǎn)物有接頭。當我們將沒有接頭的部分取了100倍多于有接頭的部分，那么退火過后，很多有接頭的雜質(zhì)片段（即不是A的片段）就會和沒有接頭的雜志片段相結(jié)合，因為他們除了接頭以外全都一樣。但是僅有A這一種片段是必然有接頭的，所以以接頭為引物進行PCR，得出的指數(shù)擴增的目的片段，就只有A了，其他的片段在PCR過程中均沒有得到指數(shù)擴增，所以量遠遠小于A，這樣就得到了A這個差異片段。但是前文中可以看出，得到的片段不只有一條，通過測序，他們這些256bp長的片段互相拼接，就得到了全長的A。5.53GATEway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)此技術(shù)的重點在于TOPO反應(yīng)和LR反應(yīng)TOPO反應(yīng)：entry載體上有ccctt的堿基序列，它能夠被拓撲異構(gòu)酶識別，能夠切成課本上的那個圖的左半邊的那種樣子，然后做PCR的時候需要你在末端加入如圖中紅色的那樣的堿基，載體的粘性末端會自動攻擊PCR產(chǎn)物的末端，然后就能夠按照他所說的那種方向連入載體了。Entry載體之所以叫這個名字，主要還是因為LR反應(yīng)，如圖所示，attl1和attR1能夠彼此互換，而另外兩個位點也會產(chǎn)生同樣效應(yīng)，這樣形成的attb和attp就能夠?qū)⒒蚝蚦mRccdB的標記相互交換，讓標記轉(zhuǎn)入entry載體而基因轉(zhuǎn)入表達載體了。5.5.4基因的圖位克隆法這種方法用來分離未知性狀的目的基因，這句話并不好理解，實際上，我們對于這個基因必然是有一定了解的，圖位克隆法的重點，在于尋找這條基因，并把它克隆出來。這條基因的性狀其實我們是知道的，但是不知道控制這個性狀的基因，在哪里，就是說，我們發(fā)現(xiàn)了一個性狀，為了尋找這個基因，而用圖位克隆法。首先介紹一下RFLP和RAPD標記，標記，就是位于染色體上的一段序列，他們是基因連鎖圖上的一部分，是經(jīng)過專業(yè)人士篩選并定位的，具體生物學意義并不重要，重要的是他們存在于染色體上的位置是很固定的。例如06年SCIENCE上發(fā)表的關(guān)于標記YR36的小麥染色體定位，用染色體步移做出的，就是一個定位準確的標記。課本上所提到的RFLP標記，即限制性內(nèi)切酶多態(tài)性的標記價格昂貴，雖然穩(wěn)定但是不常用，而基于PCR的RAPD標記，則是較為常用的。首先可以進行缺體鑒定，缺失掉某一條染色體，然后觀察表型性狀，如果目的性狀的基因被消除了，表型也就發(fā)生了相應(yīng)變化，從而確定了此基因在哪一條染色體上。不過這個方法不穩(wěn)定，所以一般不用。然后，我們找到基因連鎖圖，上面會有很多很多的標記，在遺傳學上，染色體存在交叉互換，遺傳距離相近的基因，在一塊交叉互換的幾率就越大。在進行初步定位的時候，由于染色體會進行交叉互換，你所定位的基因也會在染色體交叉互換的過程中被換，通過針對每一條染色體上的標記設(shè)計特異引物，我們特異擴增不同表型的群體。例如，A和B是一對相對性狀，我們對其1號染色體上的標記進行篩選。首先，我們拿到表現(xiàn)型是A的一個群體，如100個，然后表現(xiàn)型是B的群體，同樣是100個。針對于這兩個群體上的1號染色體上的幾個標記，特異性擴增。我們發(fā)現(xiàn)，A和B兩個表現(xiàn)型的相同的某個標記，擴增出來的條帶大小是不一樣的，這樣我們就認為這個標記和我們控制這個表現(xiàn)型的基因，是連鎖的。通過以上方法，我們就能找到距離我們想要的目的基因最近的兩條標記。如果這兩個群體足夠大，例如10000個樣本，你會發(fā)現(xiàn)有一部分的A性狀的個體，會有B性狀大部分個體的條帶，而B中也是如此，這樣的差異就是這個標記和目的基因的不共同交叉互換而形成的。通過三點測驗，就能計算兩者不共同重組的重組率，從而確定這個基因和兩個最近距離標記之間的遺傳距離。這時候，在這兩個標記之間存在這個基因，就是一定的了，我們?nèi)∧骋粋€帶有此基因的樣品，進行染色體步移。染色體步移，就是一步一步來確定這個基因的。例如他們兩個之間有10Kb那么長的區(qū)段，首先我針對前5Kb設(shè)計引物，克隆這部分基因，然后把它連入載體進行轉(zhuǎn)染入不帶有這個基因的樣本，如果樣本表現(xiàn)型發(fā)生了變化，就說明，這個基因存在于這前5Kb中，如果沒有變化，則是剩下的5Kb或者，這個基因被切斷了。如果是前5Kb，那么我們在縮短到3Kb,繼續(xù)重復(fù)試驗，直到縮短到不能再短為止，就找到了這條基因，這就是染色體步移技術(shù)。通過以上方法，我們就找到了帶有這種性狀的基因，完成了這個實驗。5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學技術(shù)5.61雙向電泳技術(shù)顧名思義，雙向電泳，就是兩個方向的電泳，一個橫向，一個縱向，從而建立了二維分離蛋白的一個圖像。橫向上，通過SDS電泳技術(shù)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小不同而進行，在這個方向上，距離最初越近，蛋白質(zhì)的=分子量大小越大?？v向上，設(shè)置PH梯度，讓蛋白質(zhì)根據(jù)等電點不同，停留在各自的等電點上，從而能夠雙向分離蛋白，得到更加純正的蛋白。5.62蛋白質(zhì)印跡法——westernblot免疫印跡法，是表達水平檢測的一種很好的方法。首先制備蛋白樣品，然后用SDS蛋白電泳，分離蛋白樣品。此時，蛋白質(zhì)根據(jù)自己的分子量大小不同，排列在蛋白膠上，我們用硝酸纖維素膜，通過電轉(zhuǎn)移，讓帶有電荷的蛋白質(zhì)，平行轉(zhuǎn)移到能夠結(jié)合蛋白質(zhì)的硝酸纖維素膜上。這時候，蛋白膠上的蛋白就被轉(zhuǎn)移了，但是蛋白膠上，并不是所有的位置都有蛋白，也就是說電轉(zhuǎn)膜以后，硝酸纖維素膜上有大片區(qū)域沒有蛋白。這時候，我們用價格便宜的奶粉來結(jié)合膜上空白的部分，讓硝酸纖維素膜上不能再非特異性結(jié)合蛋白。下一步，我們對于我們的蛋白結(jié)合特異性的一抗，這個抗體有兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個特異性結(jié)合我們所需要的蛋白樣品，一個特異性結(jié)合二抗。由于硝酸纖維素膜上已經(jīng)沒有可以結(jié)合蛋白的位置，所以一抗只能結(jié)合在目的蛋白上。此后，我們要洗去未結(jié)合的一抗，因為一抗除了特異性結(jié)合以外，還有可能通過電荷吸附或者分子間作用力，并不牢固的存在于膜上，通過洗除，我們能夠降低背景，排除非特異性結(jié)合所謂背景，就是本不該著色的部分。按正說，除了特異性結(jié)合一抗的位點以外，沒有地方能夠結(jié)合二抗，但如果一抗沒有洗除，那么二抗結(jié)合在本不該有的地方，背景顏色就被加深了。如果距離目的片段很近，有可能影響實驗結(jié)果。洗去一抗以后，我們特異性結(jié)合二抗。二抗特異性結(jié)合在一抗上，帶有熒光標記。再洗一次二抗以后，就可以進行曝光或者顯色了。曝光顯色以后就能夠半定量鑒定蛋白的量，與對照組對比，就能夠得到表達水平上的變化。如果想要得到完全的定量結(jié)果，可以通過軟件實現(xiàn)。這里需要解釋的是，為什么要用一抗和二抗來顯示熒光而不直接一抗制成熒光一抗。首先，第一點，熒光一抗的成本就很高了，所以大都不用。第二點，一抗要求是對于目的蛋白特異，而所需要研究的蛋白基因太多，特異一抗就會有很多，但是一抗的另一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即結(jié)合二抗的結(jié)構(gòu)域，只需要幾個，這樣更利于熒光二抗的商品化。第三點，也是最重要的一點，在免疫學上，蛋白熒光具有級聯(lián)放大的效應(yīng)，一抗結(jié)合二抗后所產(chǎn)生的熒光，比熒光一抗熒光強3~4倍，這樣反應(yīng)更加靈敏，更加準確。因為通過SDS作用，蛋白已經(jīng)變性，選擇一抗的時候需要考慮他能夠結(jié)合變性后的蛋白。5.63蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)質(zhì)譜部分在本科階段一般不考，而研究生階段也不作為重點。蛋白質(zhì)譜通過激光反應(yīng)激發(fā)蛋白電子，從而離子化蛋白肽段。激發(fā)后，高能汽化肽分子，根據(jù)其飛行島檢測器的時間，判定它的分子量。本人在此不詳細介紹。6.1基因表達研究技術(shù)6.11基因表達系列分析技術(shù)這個技術(shù)好難啊，筆者不得不這樣說。SAGE測定的是轉(zhuǎn)錄組，定量分析全基因組的轉(zhuǎn)錄。首先，將提取到的樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA,同前文所敘述過的方法，用4堿基內(nèi)切酶切開，形成256BP的片段，并得到3’端的片段，將他們分成兩份。這里要介紹2個問題，第一個，書上有句話很重要，任何長度超過9~10個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。從而這里用的4堿基內(nèi)切酶，即錨定酶AE，的識別位點和切割位點是不一致的，如書上的例子，它識別GGGAC切的卻是后面的未知序列。切完以后，必然足夠9~10個堿基。也就是說，這個片段能夠代表一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。即mRNA.第二個，為什么要分成兩份，是為了用連接子1和2，共同進行PCR擴增，如果只有一份，只能連入一個連接子，因為連接子能夠特異識別的只有錨定酶切割的那一端，如果只有一個連接子，那么就是說，只有一種PCR引物，可能會導致PCR效率降低。下一步，連接接頭連接子1和2，這兩個連接子，實際上就是兩段不同的DNA序列，以后方便作為PCR引物使用。用標簽酶2再切一次，這一步是方便識別標簽，進行多一次的驗證。因為沒人能保證酶切完完整整的全切得是你所需要的片段，另外有同一種標簽的可能性，但由于總量的mRNA極大，所以兩種標簽全部重復(fù)的可能性就很小了，能夠排除很大的干擾成分。下一步是末端補平，補平以后能夠方便用平末端連接酶進行連接，從而讓連接子1和2能夠形成一條DNA片段。這一步中需要說明的是，連接子1的片段可能和連接子1的片段末端相連，但是理論上來說這樣的片段是可以擴增的，因為兩端的引物是都包含的。這時候，需要說明為什么要進行PCR，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量雖然貌似很多，但是對于需要進行計算機分析的我們，量就很少了，為了方便計算機分析，我們進行了PCR擴增。但是根據(jù)模板量不同，即cDNA數(shù)量不同，PCR效率也會有所不同，這樣導致了差異的放大，量的差別更大，卻不準確了。我們一般需要的計算機分析的數(shù)據(jù)，是半定量的，只要知道各種比例的分布即可，所以差異的放大有利于我們的判斷，雖然和原來的量有所區(qū)別。PCR過后用錨定酶酶切掉兩端的引物，并連接，這樣，所有標簽全部因為錨定位點而串聯(lián)成為一條，我們把它連入載體就能夠測序了。測序完成以后，我們用標簽進行比對，從而判定各種產(chǎn)物的量。6.1.2RNA的選擇性剪切技術(shù)這個技術(shù)其實就是PCR方法驗證mRNA差異的一種方法。不同細胞中不但mRNA的表達量是不同的，他們的本身也有可能不同。就是說，從同一基因片段轉(zhuǎn)錄而來的樣本，他們切除不同的內(nèi)含子，甚至拋棄部分外顯子進行拼接，經(jīng)過選擇性剪切，形成了不同的mRNA產(chǎn)物。提取不同的組織樣品，針對于全長cDNA設(shè)計引物，發(fā)現(xiàn)不同組織中產(chǎn)物大小不一致，從而看出差異來自選擇性剪切。6.13原位雜交技術(shù)用核酸探針經(jīng)過放射自顯影技術(shù)來觀察。之所以成為原位雜交，是將細胞固定后，在原來位置上觀察探針所處位置判定核內(nèi)核外的位置。6.14基因的定點突變技術(shù)本部分僅介紹PCR介導的定點突變。重疊延伸介導的定點突變，是很常用的突變方法。當我們獲取了一條片段時，想要針對于某幾個bp的片段進行突變，便可以用這種方法。首先有如下完整序列我們想要突變其中?的位點，這個位點的長度我們暫定為10bp，我們?nèi)缦逻x取引物兩端引物為普通兩頭引物，包含酶切位點，而中間為突變引物不包含酶切位點。突變引物中，大部分序列是匹配的，而所需要突變的10bp是完全不匹配的，遵循A-C,T-G互換原則。突變引物總長度要求和正常引物類似，在18~38bp之間，根據(jù)所突變位點大小不同而不同。重疊延伸介導的定點突變就是先分別用一條普通引物和一條突變引物克隆一半的鏈，再用兩條鏈互為模板與引物，進行退火延伸因為堿基互補配對當突變引物兩頭都能結(jié)合，而中間不能結(jié)合的時候，仍然是可以退火的，這樣，經(jīng)過第一輪PCR，位點就被克隆出來（引物延伸出一條鏈），當進行第二輪PCR，突變引物會自動尋找最適合他的模板，就是突變后的那條序列了。經(jīng)過30+次的擴增，突變鏈的量就很大了。之后以兩條突變鏈互為模板，進行PCR，延伸成功后就能得到突變后的模板，再用兩頭的普通引物進行pCR擴增，就能夠得到新的突變鏈。重疊延伸的功能不僅限于突變，還可以克服高級結(jié)構(gòu)，PCR較長片段，至于PCR的各種方法，需要讀者自己慢慢體會，掌握PCR原理，就能夠自己開發(fā)新方法。6.2基因敲除技術(shù)6.21基本原理：1完全基因敲除：完全基因敲除通過打靶載體進行同源置換，將目的基因功能區(qū)從基因組中置換到載體上，而載體上沒有相應(yīng)的表達原件，從而導致目的基因失活。類似于前文所講的gateway大規(guī)?？寺∷玫腖-R反應(yīng)。完全基因敲除添加負向選擇標記，因為打靶載體不見得只置換目的基因，還有可能置換錯誤，或者置換區(qū)域不對。當載體由于差錯將載體上的負向選擇標記插入基因組并進行了表達，那么細胞就會死亡。通過上述敘述，大家都明白，其實完全基因敲除會有很大的偶然性，因為載體剛好不置換目的片段又置換了負向選擇標記的幾率并不大，所以假陽性的概率較高，這樣的基因組包含了未敲除的基因，也不包含負向選擇標記。6.2條件性基因敲除敲除某些基因具有致死性，從而研究無法進行，所以在培養(yǎng)過程中，這些基因仍需要表達，當開展實驗的時候，在進行基因敲除。將loxp位點和neo標記插入到目的基因內(nèi)含子中，表達的時候仍然會被切除，從而無影響。通過neo標記即可篩選相應(yīng)中標細胞。當進行實驗的時候，將這個基因與EII-cre細胞雜交，重組酶就會把lop位點之間的目的基因片段刪除，就可以進行研究了。6.22動物基因敲除技術(shù)圖示，前半部分為完全基因敲除，不再贅述，從顯微注射開始，顯微注射是將細胞植入胚胎，這樣胚胎長成的時候，既包含了正常細胞，也包含了敲除細胞，從而成長為黑白嵌合體。嵌合體和白色小鼠回交，產(chǎn)生后代中即會有黑色也會有白色，通過表型鑒定（看黑色還是白色），判定插入率?；虿东@法很簡單，看圖就能明白，不做贅述。6.23T-DNA插入失活技術(shù)T-DNA插入失活最重要的就是記住他