分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)4限制性內(nèi)切酶切

實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、掌握對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切的原理和方法，理解限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵工具。背景知識(shí)上世紀(jì)七十年代，當(dāng)人們?cè)趯?duì)噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。首批被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶包括來(lái)源于大腸桿菌的EcoR

I和EcoR

II，以及來(lái)源于流感 桿菌(Heamophilus

influenzae)的Hind

II和Hind

III。這些酶可在特定位點(diǎn)切開(kāi)DNA，產(chǎn)生可體外連接的片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究

組成、功能及表達(dá)非常有用的工具。限制性內(nèi)切酶生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶可以將外來(lái)的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去，但對(duì)自己的DNA卻無(wú)損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。這種切割作用是在DNA分子進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱限制酶）。1.分類類別識(shí)別位點(diǎn)切割位點(diǎn)需用ATPⅠ類非對(duì)稱不特異，在識(shí)別位點(diǎn)1000bp外YesⅡ類4-6

bp，大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)特異，在識(shí)別位點(diǎn)中或緊靠NoⅢ類5-7

bp非對(duì)稱不特異，在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26

bpYes2.命名1）用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母表示寄主菌的物種名稱，如E.coli

用Eco

表示，所以用斜體字。

EcoRI，EcoRV。2

）

用

一

個(gè)

字

母

代

表

菌

株

或

型

，

如

流

感

菌(Heamophilus

influenzae)Rd菌株用d，即Hind。3）如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制酶，則以羅馬數(shù)字表示，如HindⅠ,

HindⅡ，HindⅢ等3.限制性內(nèi)切酶的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的結(jié)合載體和 的特性選擇合適的酶切位點(diǎn)；根據(jù)酶本身的屬性酶的酶切效率；雙酶切共用緩沖液；選擇何種公司的產(chǎn)品：Fermentas、TaKaRa、NEB。4.酶切產(chǎn)物（1）粘性末端：如EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)為：5’……

G↓AATTC

……3’3’……

CTTAA↑G

……5’在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置切割后生成：5’……G3’……CTTAAAATTC……3’G……5’（2）平末端例如EcoRV

的識(shí)別序列是：GAT

ATCCTA

TAG切割后形成GAT

ATCCTA

TAG同裂酶來(lái)源于不同物種但能識(shí)別相同DNA序列的限制性內(nèi)切酶，切割位點(diǎn)可以相同也可以不同同序同切酶同序異切酶SmaI和XmaICCC↓GGGC↓CCGGGSmaIXmaI同尾酶識(shí)別DNA分子中不同核苷酸序列，但能酶切產(chǎn)生相同的黏性末端XbaI與SpeI;

XhoI與SalI;

BamHI與BglIIXbaI5’……

T↓CTAGA

……3’3’……

AGATC↑T

……5’SpeI5’……

A↓CTAGT……3’3’……

TGATC↑A

……5’5’……

TCTAGT……3’3’……

AGATCA

……5’5.酶切的方式單酶切/雙酶切部分酶切/完全酶切單酶切環(huán)狀DNA分子L-DN

段雙酶切環(huán)狀DNA兩種限制酶識(shí)別序列數(shù)之和線性DNA兩種限制酶識(shí)別序列數(shù)加1部分酶切限制性內(nèi)切酶切割DNA【實(shí)驗(yàn)材料】實(shí)驗(yàn)材料及試劑質(zhì)粒或目的

（DNA），雙蒸無(wú)菌水，10×Buffer，EcoRI限制性內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)用具及儀器不同量程的移液器和配套吸頭，0.2lEppendorf管，微量離心機(jī)，塑料板，恒溫水浴鍋等pCAMBIA

130412361

bpkanamycin

(R)hygromycin

(R)mGFP5*pVS1

stagusA

(N358Q)N358-Q

Glycosylation

site

mutatiolacZ

alphaCaMV

35S

promoterpBR322

oripBR322

bomNco

I

(1)Bgl

II

(8)Spe

I

(15)Nhe

I

(5982)pVS1

repPml

I

(339)Histidine

tagNhe

I

(2541)Pml

I

(2564)Bst

EII

(2574)Nos

poly-AT-Border

(right)Sph

I

(2979)Hin

d

III

(11600)Sph

I

(11598)Pst

I

(11592)Sal

I

(11582)Xba

I

(11576)Bam

H

I

(11570)Sma

I

(11567)Kpn

I

(11565)Sac

I

(11559)EcoR

I

(11549)Xho

I

(9425)CaMV35S

polyAT-Border

(left)Sac

II

(8907)Bst

XI

(11306)CaMV35S

promoterXho

I

(10519)【實(shí)驗(yàn)步驟】1.配制酶切反應(yīng)體系由于酶切體系為30μl，先根據(jù)下表需要使用試劑及用量，計(jì)算出需要補(bǔ)充雙蒸水的體積，然后取1個(gè)200l離心管，按照ddH2O

、10×Buffer、質(zhì)粒或

（DNA）、兩種內(nèi)切酶的加樣順序，配制酶切反應(yīng)體系。試劑取樣體積ddH2Oup

to

30

μl10×Buffer3.0

μl質(zhì)?；?/p>

（DNA）10.0μl（約1μg）限制性內(nèi)切酶1.0

μl酶切反應(yīng)配制好酶切反應(yīng)體系，用手指輕彈離心管管壁使溶液充分混勻，用微量離心機(jī)離心15秒。將離心管置于

塑料板上，在最適反應(yīng)溫度（一般為37°C）下反應(yīng)2-4h。如果酶切樣品是PCR產(chǎn)物，需要酶切過(guò)夜，使酶切完全。終止酶切反應(yīng)待反應(yīng)完全后，將離心管置于65°C保溫10min，滅活限制酶，終止酶切反應(yīng)，以進(jìn)行下一步操作。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg

DNA加1單位酶，消化1-2h。吸樣量一定要準(zhǔn)確。酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。要求在冰上操作，并充分混勻。開(kāi)啟Eppendorf管時(shí)，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防污染。樣品在37℃與65℃保溫時(shí)，將離心管 ，以防水進(jìn)入管內(nèi)造成實(shí)驗(yàn)失敗。市場(chǎng)銷售的酶一般濃