寄生蟲(chóng)常見(jiàn)診斷方法課件

寄生蟲(chóng)病診斷的常用方法1一、病原學(xué)診斷方法許多寄生蟲(chóng)，特別是寄生于消化道的蟲(chóng)體，其蟲(chóng)卵、卵囊或幼蟲(chóng)均可通過(guò)糞便排出體外，通過(guò)檢查糞便，可以確定是否感染寄生蟲(chóng)或確定寄生蟲(chóng)的感染強(qiáng)度。2糞便蟲(chóng)卵檢查法1．直接涂片法2．漂浮集卵法3．沉淀集卵法4．麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法5．毛蚴孵化法32．漂浮集卵法flotationmethod應(yīng)用比重較蟲(chóng)卵大的漂浮液，使蠕蟲(chóng)卵、球蟲(chóng)卵囊等浮于液體表面，易于集中檢查。漂浮集卵法對(duì)某些線蟲(chóng)卵、絳蟲(chóng)卵和原蟲(chóng)卵囊有很好的檢出效果。缺點(diǎn)是高比重的漂浮液易使蟲(chóng)卵和卵囊變形，檢查時(shí)必須迅速，也可在制片時(shí)補(bǔ)加一滴清水。常用方法為飽和鹽水漂浮法。取5~10g糞便置于200ml燒杯中，先加入少量飽和鹽水（1L水中加食鹽400g），攪拌混合后再加入約20倍的漂浮液，用金屬篩或紗布濾去糞渣，濾液靜置30~60min，用直徑0.5~1.0cm的金屬圈蘸取表面液膜，抖落于載玻片上，加蓋片后鏡檢。檢查比重較大的蟲(chóng)卵，如棘頭蟲(chóng)蟲(chóng)卵、豬肺絲蟲(chóng)蟲(chóng)卵及吸蟲(chóng)卵時(shí)，需用硫酸鎂、硫代硫酸鈉以及硫酸鋅等飽和溶液。53．沉淀集卵法sedimentationmethod用水處理糞便，經(jīng)離心或自然沉淀，使蟲(chóng)卵沉淀集中，更易于檢查。自然沉淀集卵法是取糞便5~10g加水混合成懸浮液，經(jīng)40~60孔/2.54cm2銅篩濾去大塊物質(zhì)，靜置15min后傾去上清液,如此反復(fù)操作，直至上層液體透明為止,最后棄去上層液體，置沉淀物于載玻片上，鏡檢蟲(chóng)卵。離心沉淀法是取1~2g被檢糞便于試管中，加5倍量的水制成懸浮液，經(jīng)40孔/cm2銅篩過(guò)濾到一離心管中，以800rpm離心3~5min,棄上清，將沉渣置載玻片上，鏡檢蟲(chóng)卵。本法也適用于檢查尿液內(nèi)的蟲(chóng)卵。64．麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法MacMastermethod是常用的蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)方法之一。通過(guò)蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)，可以估計(jì)動(dòng)物感染強(qiáng)度。取糞樣2g放入三角燒瓶?jī)?nèi)，加飽和鹽水58ml和玻璃珠若干，充分震蕩使成混懸液，吸取混懸液注入麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)室，置顯微鏡下計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)室（1cm2）內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù)。由于每室混懸液等于0.15ml,結(jié)果乘以200,即為每克糞便蟲(chóng)卵數(shù)。通常一次計(jì)數(shù)4室,然后按平均值計(jì)。本法只適用于可被飽和鹽水漂起的各種蟲(chóng)卵。75．毛蚴孵化法hatchingtest是診斷日本血吸蟲(chóng)及東畢吸蟲(chóng)的方法之一。其依據(jù)是血吸蟲(chóng)卵內(nèi)的毛蚴在適宜的的條件下能很快孵出，并基本上按直線運(yùn)動(dòng)于水面下，利用這一特性檢查毛蚴即可確診。取被檢糞便30~100g（牛100g）經(jīng)沉淀集卵法處理，將沉淀倒入500ml三角燒瓶?jī)?nèi)，加溫清水（自來(lái)水需脫氯處理）至瓶口，置22~260C孵化，第1、3、5h，用肉眼或放大鏡觀察并記錄一次。如見(jiàn)水面下有白色點(diǎn)狀物做直線來(lái)往運(yùn)動(dòng)，即是毛蚴，但需與水中一些原蟲(chóng)如草履蟲(chóng)、輪蟲(chóng)等相區(qū)別。必要時(shí)吸出在顯微鏡下觀察。氣溫高時(shí)，毛蚴孵出迅速，因此，在沉淀處理時(shí)應(yīng)嚴(yán)格掌握換水時(shí)間，以免換水時(shí)傾去毛蚴造成假陰性結(jié)果。也可用1.0%~1.2%食鹽水沖洗糞便,以防止毛蚴過(guò)早孵出，但孵化時(shí)應(yīng)用清水。8刮取皮屑的方法甚為重要，應(yīng)選擇患病皮膚與健康皮膚交界處，這里的螨較多。刮取時(shí)先剪毛，取凸刃小刀，在酒精燈上消毒，使刀刃與皮膚表面垂直，刮取皮屑，直到皮膚輕微出血（此點(diǎn)對(duì)檢查寄生于皮內(nèi)的疥螨尤為重要）。蠕形螨病，可用力擠壓病變部，擠出膿液，將膿液攤于載玻片上供檢查。將刮下的皮屑，放于載玻片上，滴加50%甘油溶液，覆以另一張載玻片。搓壓玻片使病料散開(kāi)，分開(kāi)載玻片，置顯微鏡下檢查。103．蟲(chóng)體濃集法上法雖然可以查到血液中的原蟲(chóng)，但血液中的蟲(chóng)體較少時(shí)，則不易查出蟲(chóng)體。為此，常先進(jìn)行集蟲(chóng)，再制片檢查。其操作過(guò)程是，采病畜抗凝血6~7毫升，以每分鐘500轉(zhuǎn)的速度，離心5分鐘，使其中大部分紅細(xì)胞沉降；而后將含有少量紅細(xì)胞，白細(xì)胞和蟲(chóng)體的上層血漿移入另一離心管中，補(bǔ)加一些生理鹽水，以每分鐘2，500轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘。取沉淀物制成抹片，按上述染色法染色檢查。此法適用于伊氏錐蟲(chóng)病和梨形蟲(chóng)病。其原理是錐蟲(chóng)和感染有梨形蟲(chóng)的紅細(xì)胞較正常紅細(xì)胞的比重為輕，所以在第一次沉淀時(shí)，正常紅細(xì)胞下降，而錐蟲(chóng)和感染有梨形蟲(chóng)的紅細(xì)胞尚懸浮在血漿中。第二次離心沉淀時(shí)，則將其濃集于管底。12鏡檢法為取隔肌肉樣0.5~1g剪成3×10mm的小塊，用厚玻片壓緊，放顯微鏡下檢查或投放到屏幕上觀察。消化法為取100g肉樣，攪碎或剪碎，放入3L的燒瓶?jī)?nèi)。加入10g胃蛋白酶，溶于2L自來(lái)水。加入16ml鹽酸（25%），放入一磁力攪拌棒。置于可加熱的磁力攪拌器上，設(shè)溫于44~46℃。30min后，將消化液用180μm的濾篩濾入一2L的分離漏斗，靜置30min，放出40ml液體于一50ml的量筒內(nèi)，靜置10min，吸去30ml上清夜。加入30ml水，搖勻。10min后，再吸去30ml上清液。剩下的液體到入一帶有格線的平皿內(nèi)，用20-50X顯微鏡觀察。14動(dòng)物接種法有些原生動(dòng)物，在病畜體內(nèi)用上述顯微鏡檢查法不易查到，為了確診常采用動(dòng)物接種試驗(yàn)。接種用的病料、被接種的動(dòng)物種類(lèi)和接種的途徑均依病的種類(lèi)不同而異15動(dòng)物剖檢法在動(dòng)物死亡（或捕殺）后，首先制作血片，染色檢查，觀察血液中有無(wú)寄生蟲(chóng)，而后仔細(xì)檢查體表，觀察有無(wú)體表寄生蟲(chóng)。而后剝皮，觀察皮下組織中有無(wú)蟲(chóng)體寄生。將各內(nèi)部臟器依次取出，先收集胸水，腹水，沉淀后觀察其中有無(wú)寄生蟲(chóng)。而后取出全部消化器官及其所附的肝、胰等腺體。取出呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)、心臟和大的動(dòng)脈和靜脈血管，分別進(jìn)行檢查。16二、免疫學(xué)診斷方法已報(bào)道的寄生蟲(chóng)免疫學(xué)診斷方法很多，包括變態(tài)反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，免疫熒光抗體技術(shù)、免疫酶技術(shù)、放射免疫分析技術(shù)、免疫印跡技術(shù)等。此處僅介紹主要幾種。17間接血凝試驗(yàn)基本原理間接血凝試驗(yàn)（IHA）是凝集試驗(yàn)的一種。抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，在電解質(zhì)存在下，復(fù)合物相互凝集形成肉眼可見(jiàn)的凝集小塊或沉淀物。根據(jù)是否產(chǎn)生凝集現(xiàn)象來(lái)判定相應(yīng)抗原或抗體，稱(chēng)為凝集試驗(yàn)。顆粒性抗原與抗體直接結(jié)合后出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象，稱(chēng)直接凝集試驗(yàn)。將可溶性抗原或抗體先吸附于一種與免疫無(wú)關(guān)的，一定大小的載體顆粒表面，然后與相應(yīng)抗體或抗原作用，在適宜的條件下由于抗原抗體的特異性結(jié)合，會(huì)帶動(dòng)載體顆粒的凝集，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱(chēng)間接凝集試驗(yàn)。常用的載體顆粒有紅細(xì)胞（“O”型人紅細(xì)胞，羊紅細(xì)胞），聚苯乙烯膠乳顆粒，白陶土，離子交換樹(shù)脂，火棉膠等。以紅細(xì)胞為載體時(shí)，就稱(chēng)作間接血凝試驗(yàn)。18免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)又稱(chēng)熒光抗體標(biāo)記技術(shù)，是指用熒光素對(duì)抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，然后用熒光顯微鏡觀察所標(biāo)記的熒光以分析示蹤相應(yīng)的抗原或抗體的方法。用于標(biāo)記抗體的熒光色素必須具有下列條件：①能與免疫球蛋白共價(jià)結(jié)合，結(jié)合物穩(wěn)定；②結(jié)合后不影響免疫球蛋白免疫活性，同時(shí)熒光效率無(wú)明顯影響；③標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、迅速、安全無(wú)毒。目前，熒光免疫技術(shù)已在許多寄生蟲(chóng)病中得到應(yīng)用。如血吸蟲(chóng)病、錐蟲(chóng)病、旋毛蟲(chóng)病、弓形蟲(chóng)病、利什曼病等。20免疫酶技術(shù)基本原理免疫酶技術(shù)是繼免疫熒光技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的又一種免疫標(biāo)記技術(shù)，是根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合，以酶作標(biāo)記物，酶對(duì)底物具有高效催化作用的原理而建立的。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性。酶標(biāo)抗體或抗原與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，形成酶標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物。復(fù)合物中的酶在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，催化底物分解，使供氫體氧化而生成有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的出現(xiàn)，客觀地反映了酶的存在。根據(jù)有色產(chǎn)物的有無(wú)及其濃度，即可間接推測(cè)被檢抗原或抗體是否存在以及其數(shù)量，從而達(dá)到定性或定量的目的。21常規(guī)免疫酶染色法可分為直接和間接兩種方法。真接法是用酶標(biāo)記特異性抗體，直接檢測(cè)寄生蟲(chóng)或其抗原。在含有寄生蟲(chóng)或其抗原的標(biāo)本固定后，消除其中的內(nèi)源性酶，用酶標(biāo)記的抗體直接處理，使標(biāo)本中的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合，然后加底物顯色，進(jìn)行鏡檢。間接法是將含有寄生蟲(chóng)或其抗原的組織或細(xì)胞標(biāo)本，用特異性抗體處理，使抗原抗體結(jié)合，洗滌清除未結(jié)合的部分，再用酶標(biāo)記的抗抗體進(jìn)行處理，使其形成抗原-抗體-酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物，最后滴加底物顯色，進(jìn)行鏡檢。23酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）ELISA是固相免疫酶測(cè)定法中應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一種。其基本過(guò)程是將抗原（或抗體）吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果。24DNA探針（DNAprobe）技術(shù)DNA探針是帶有標(biāo)記物的已知序列的DNA片段。DNA探針技術(shù)的基本原理是堿基配對(duì)。在變性而成為單鏈的被檢DNA中加入變性的探針，隨著溫度的降低，探針便可與被檢DNA中的互補(bǔ)序列形成雙鏈，這一過(guò)程稱(chēng)雜交。通過(guò)捕捉探針標(biāo)記物釋放出的信號(hào)，便可知被檢DNA中有無(wú)與探針序列相同的DNA。每一種病原體都具有獨(dú)特的DNA片段，通過(guò)分離和標(biāo)記這些片段，就可制備出探針，用于疾病的診斷等研究。26DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒矗≒CR）PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴(lài)于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。反應(yīng)分三步。27①變性：通過(guò)加熱使DNA雙螺旋雙鏈解離形成單鏈DNA。②退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的