斑馬魚胚胎整體原位雜交

精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上專心---專注---專業(yè)專心---專注---專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上專心---專注---專業(yè)斑馬魚胚胎整體原位雜交(Whole-mountinsituhybridizationsinzebrafishembryos)北京大學遺傳與發(fā)育生物學實驗室整理者：肖安版本：V6.22Build200說明：小號宋體文字為操作提示，其中下劃線標記者為以下數(shù)步均需注意的內(nèi)容；小號楷體文字為影響結(jié)果的重要步驟提示，注意控制記錄其操作處理的條件和時間，以在重復實驗探索最適條件時進行適當調(diào)整。在整個實驗中應當注意：(1)由于環(huán)境中存在大量RNA酶，RNA在常溫下極易降解。因此，涉及RNA的操作，在探針去除之前，以及探針的合成與純化過程，必須嚴格防止污染。操作需要要戴乳膠手套進行，使用專用槍頭、離心管、電泳槽等，盡量縮短RNA在常溫或37℃放置時間，電泳使用高電壓短時間的程序，每次必須更換新電泳液。實驗間隙中RNA放置在-20℃，過夜或更長時間保存在(2)如同時對多管進行吸去溶液和加入溶液工作，應當按照同樣的順序依次操作，以保證其處理時間基本一致。避免漏加溶液。(3)注意所加溶液與胚胎溫度的差異，應當先預熱再使用。一般溶液加入量為1mL左右，管平放以使胚胎分散與溶液充分接觸，但探針雜交一步溶液過少可豎直放置。(4)吸取胚胎的槍頭應剪去尖端以擴大開口。吸時動作要輕。任何時候都要防止丟失胚胎，可在換前一管溶液時將后一管豎直放置讓胚胎沉降一會以免吸走。(5)注意保護標簽，并且易混淆標簽必須設(shè)法分辨(如6和9)。第一天以下操作需戴乳膠手套。1水溶液體系重新處理(Rehydration)。1.1吸去恢復到室溫的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%,50%,30%的MeOH的PBST溶液依次處理5分鐘。梯度稀釋的目的是防止胚胎收縮，可適當多添加幾個濃度梯度。稀釋時間寧長勿短。特別注意保護標簽，MeOH為有機溶劑，易腐蝕油性筆書寫的標簽。1.2PBST處理5分鐘，兩次。2蛋白酶消化和隨后的固定(Proteinasedigestionandpostfixation)。2.1用蛋白酶K的PBST溶液(在管中原有的約1mLPBST中加入1uL10mg/mL的蛋白酶K，終濃度10ug/mL)常溫消化，時間可參考下表：胚胎時期處理時間尾牙期(tailbudstage)前不處理5體節(jié)(5somites,5s)酌情處理6s30秒16s1分鐘18s,24h2分鐘48h(H2O2脫色)4分鐘3d(H2O2脫色)10分鐘48h(PTU處理)30分鐘3d(PTU處理)45分鐘5d(PTU處理)1小時消化的目的是使探針更容易進入組織中。應根據(jù)胚胎質(zhì)量、以前原位雜交結(jié)果適當增減時間。注意雙氧水脫色的胚胎受損害較大，蛋白酶K處理時間應大大短于培育時加入PTU阻止色素生長的胚胎。理論上換新的酶和新胚胎都應該重試處理時間。以下操作室溫進行，注意溶液預熱。2.2消化時間到后，先盡快用PBST暫時漂洗，然后PBST洗5分鐘，一到兩次。在PBST洗后或下一步多聚甲醛固定后可以按照探針將胚胎分管和混合，注意同一管中的胚胎發(fā)育時期不宜相隔過近，以免最后觀察結(jié)果時難以分辨。但若相隔過遠，后面的染色時間可能會有很大差異，并且處于發(fā)育較早期的胚胎破裂時卵黃可能污染發(fā)育較晚期的胚胎。每一時期每一探針需15枚左右(發(fā)育早期的胚胎在實驗中容易損壞，宜多取一些)。若做正負對照，正對照用已明確的Marker基因探針(反義RNA鏈)，或者對胚胎進行雙染。負對照使用正義RNA鏈，或者不加探針(如粗略篩選時)。注意及時寫上新的標簽編號并記錄下每個編號對應的各胚胎時期。2.34%多聚甲醛(paraformaldehyde,para)固定20分鐘。提前解凍，每次實驗都盡量用一管新的多聚甲醛，避免RNase污染。未使用完部分可用于固定胚胎。用于原位雜交的胚胎都使用多聚甲醛固定。甲醛苦味酸混合液固定胚胎雖然能更好的保持形態(tài)，但將破壞胚胎抗原性，導致零結(jié)果。2.4PBST洗5分鐘，兩次。以上兩步用PBST洗滌也可改為PBT，后者含有小牛血清，對胚胎保護更好。以下65℃3預雜交(Prehybridization)。加入500uLHYB，65℃4雜交(Hybridization)。4.1RNA探針(RNAprobe)以3ng/uL濃度溶于HYB，72℃4.2吸去胚胎管中的HYB，加入約含至少300ng探針的溶液。實際探針濃度應反復調(diào)整至合適。通常加入體積為200uL，不得少于100uL，否則胚胎難以充分接觸溶液。4.365℃雜交溫度一定不得超過72℃，否則探針被破壞。溫度越低雜交時間不宜超過太多，否則背景容易過深。第二天5去除探針(ProbeRemoval)。5.1吸去探針溶液并重新保存于-20℃一般而言探針可重復使用十次左右，能重復使用次數(shù)取決于探針質(zhì)量。使用越頻繁，得到的信號越弱。探針的HYB溶液中在-80℃以下步驟不用戴乳膠手套操作。以下操作步驟仍在65℃進行，注意溶液預熱5.2甲酰胺(formamide)溶于SSCT的溶液(最終濃度甲酰胺50%，SSCT2*)洗30分鐘，兩次。5.32*SSCT洗25分鐘。5.40.2*SSCT洗30分鐘，兩次。通常在試驗時洗滌到此為止，若背景過深可繼續(xù)一至多步洗滌，如0.1*SSCT65℃洗滌的目的是洗去殘留未特異性結(jié)合的探針，留下特異性結(jié)合的探針，較高溫度(65℃)或較稀濃度SSCT洗滌可洗得更干凈，在降低背景同時也容易使雜交上的探針被洗脫，這是影響最終結(jié)果的最重要因素之一。時間要嚴格控制。實際需要反復探索適合于不同探針、不同時期胚胎的具體條件和時間。從去除探針開始的步驟需要特別保護胚胎，因為胚胎此時非常透明(處于發(fā)育較晚期的尤其如此，可能是卵黃較少的緣故)。吸取溶液時先將管豎直，待胚胎沉到管底后再吸溶液，并注意槍頭中有沒有吸走胚胎。以下步驟(6-7)為針對雙染的第一步或針對熒光素標記探針FastRed染色。若不做此步可直接跳至8。8地高辛抗體檢測(Anti-DigDetection)8.1慢搖下用MABT洗5分鐘，兩次。8.2慢搖下用阻斷溶液(blockingsolution，參見現(xiàn)配溶液)阻斷一小時。此步可以在解剖鏡下將損壞的胚胎清除。若為雙染，第二次阻斷可略去。8.3加入新用阻斷溶液3000倍稀釋的地高辛抗體(digitinantibody,anti-dig)，每管至少加入800uL，4℃注意用于稀釋抗體的溶液4℃預冷，避免抗體降解抗體不一定是單抗，有可能與胚胎中原有的其它抗原結(jié)合，導致背景過深。在對實驗結(jié)果精度要求較高的情況下，可將抗體與待原位雜交時期的胚胎或胚胎的丙酮保存粉末混合處理(參見現(xiàn)配溶液)，或者加入適當?shù)淖钄嘣噭?。第四天以下步驟最好使用另一搖床或停止加熱的雜交爐，從4℃中取出的搖床要等內(nèi)部凝結(jié)的水汽蒸發(fā)完后才能再次使用，以保護電路。9堿性磷酸酶底物染色(APSubstrateStain)9.1加入到1%熱處理羔羊血清(heattreatedlambserum)的MABT溶液中，室溫洗25分鐘。9.2MABT洗25分鐘，三次。9.3檢測緩沖液(DetectionBuffer，參見現(xiàn)配溶液)洗5分鐘，二次。胚胎轉(zhuǎn)移到24孔板。在轉(zhuǎn)移之前可再挑一次損壞的胚胎。24孔板孔內(nèi)不能有灰塵，解剖鏡下檢查并用脫脂棉蘸乙醇擦干凈，用檢測緩沖液沖洗兩次，一般使用一兩次即拋棄。各孔蓋上標好探針名。9.4加入至少300uLAP底物染色緩沖液(參見現(xiàn)配溶液)，室溫溫育，金屬箔片包裹避光。每30分鐘檢查一次染色情況。萬一需要過夜不便檢查，4℃保存第二天再室溫放置并檢查。盡量避免如此以防染色過度。溫度低可以減緩酶促反應速度，而溫度高染色快，但會使背景加深。9.5當目標著色出現(xiàn)后，用PBS洗5分鐘，兩次，以停止反應。此處PBS和雜交前使用的PBS分開，不加吐溫以免干擾。若同一孔中的不同時期胚胎染色情況不一致，可以分開分別終止。10照相(Photograph)10.14%多聚甲醛PBS溶液固定，保存于4℃。地高辛探針雜交胚胎長期保存可依次用30%,50%,70%MeOH的PBS溶液處理后轉(zhuǎn)移到MeOH中，4℃或管的側(cè)面和蓋上注明胚胎品系、時期、探針、日期。MeOH可溶解堿性磷酸酶非特異性著色和部分特異性著色，因此保存的胚胎顏色將逐漸變淺；而FastRed著色在MeOH中將全部脫落，只能保存于多聚甲醛。10.2照相前將胚胎用用30%,50%,70%甘油的PBS溶液處理后轉(zhuǎn)移到甘油中，照相后再梯度轉(zhuǎn)移回4%多聚甲醛或MeOH中。不需保留可丟棄?，F(xiàn)配溶液(僅需稀釋或混合者略)溶液名后附加的T表示吐溫(tween)，用前加入，濃度約為0.1%。吐溫的作用是使胚胎不易粘附在槍頭內(nèi)壁上。由于吐溫量少且較粘稠，吸取的時候要多等一會讓其上升至槍頭內(nèi)，加入后在溶液中吹吸幾次。(1)丙酮粉末處理抗體溶液每管800uL抗體溶液：取充分混勻的質(zhì)量百分比約1%的丙酮魚粉懸濁液11uL，4000rcf離心2分鐘，去除上清。加入500uLPBT洗滌，4000rcf離心2分鐘，去除上清。離心速度和時間須適當調(diào)整，既要保證沉淀上清分離，又要避免沉淀結(jié)合過于緊密無法重懸。加入80uLPBT，震蕩成懸濁液。加入羔羊血清至2%終濃度(1.6uL)。加入1/300的抗體，即得10*抗體溶液。使用前用阻斷溶液稀釋至1*，即1/3000抗體溶液。(2)阻斷溶液(blockingsolution)每1mL10%熱處理羔羊血清或100uL血清原液；2mL10%阻斷試劑(blockingreagent)；用MABT補至10mL。1%熱處理羔羊血清的MABT溶液類似，僅不加阻斷試劑；可共用同一容器。兩種溶液若剩余均須丟棄，防止血清變質(zhì)。(3)檢測緩沖液(detectionbuffer)又稱AP緩沖液(APBuffer)每50mL溶液：100mMNaCl(1mL5M)；50mMMgCl2(2.5mL1M)；100mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl(5mL1M，pH9.5)；0.1%Tween-20；1mM左旋咪唑(levamisole)(50uL1M)。左旋咪唑的作用是抑制胚胎組織內(nèi)源性堿性磷酸酶，若不加左旋咪唑，可以增強信號，不過同時背景也會增強。而若最終結(jié)果染色過淺，可能是左旋咪唑抑制了抗體結(jié)合堿性磷酸酶，應調(diào)整濃度。(4)FastRed染色液每片F(xiàn)astRed片劑加到2mL0.1MTris-HCl(pH8.2)，加入0.1%吐溫。錫箔包裹避光劇烈搖動溶解，用注射器過濾板過濾。(5)堿性磷酸酶底物染色緩沖液((APsubstratestainingbuffer)每1mL檢測緩沖液加入：4.5uLNBT3.5uLBCIP又稱X-磷酸鹽(X-phosphate)加入左旋咪唑(levamisol)至終濃度5mM(再加入4uL1M)兩種染色液配制后均需避光。保存溶液若無說明，溶液4℃保存。HYB及之前的溶液用DEPC水配制，之后的溶液可(1)DEPC水(DEPCwater)去離子水(dH2O)在通風櫥中加入0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)，37℃(2)10*PBS每1L溶液：1.37M(mol/L的簡寫)NaCl(80g)；27mMKCl(2g)；43mMNa2HPO4·12H2O(15.4g)或無水Na2HPO4(6.1g)；14mMKH2PO4(1.9g)；DEPC水或dH2O稀釋到1L，調(diào)節(jié)pH為7.3?；蛑苯佑觅徺I的PBS袋裝固體粉末按說明溶解于DEPC水或dH2O得1*PBS。需用DEPC水和dH2O配置兩種PBS。(3)PBT(洗滌用PBST替代品，丙酮粉末處理抗體溶劑，可選)每1L溶液：1*PBS(100mL10*PBS)；0.2%小牛血清(BSA，2gBSA-V)；0.1%Tween。不可用于稀釋甲醇，否則BSA變性。(4)4%多聚甲醛(paraformaldehyde，para)多聚甲醛以4%濃度(2g/50mL)溶于1*PBS，加熱到65℃，均勻混合使其溶解，放置約40分鐘，-20℃(5)HYB每100mL溶液：50%甲酰胺(formamide，Sigma公司產(chǎn)品，超純級)(50mL)；5*SSC(25mL20*SSC)；50ug/mL肝素(heparin)(100uL50mg/mL)；5mMEDTA(1mL0.5M，PH8.0)；0.05mg/mL核糖體RNA(ribosomalRNA，Sigma公司產(chǎn)品)(100uL50mg/mL)；920uL1M檸檬酸(citricacid)；0.1%Tween。-20℃甲酰胺濃度增加將使探針更不易結(jié)合。(6)20*SSC每1L溶液：3MNaCl(175.3g)；0.3M檸檬酸鈉(Nacitrate)(88g二水合物)；DEPC水或dH2O稀釋到1L，調(diào)節(jié)pH為7.0。最好用DEPC水和dH2O配置兩種，前者用于配HYB。(7)MAB100mM順丁烯二酸(馬來酸，maleicacid，Sigma公司產(chǎn)品)(11.69g/L)；150mMNaCl(8.89g/L)；用NaOH顆粒或濃溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。(8)熱處理羔羊血清(heattreatedlambserum)57℃化開，分裝，-20(9)10%阻斷試劑(blockingreagent)4g/36mL溶于MAB，滅菌，-20℃(10)NBT(四唑硝基靛藍，nitrobluetetrazolium)50mgNBT溶于0.7mL二甲基甲酰胺(dimethylformamide)和0.3mL水中，分裝保存。常用保存在-20℃，長期保存在-80(11)BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽，5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate；又稱X-磷酸鹽，X-phosphate)50mgBCIP溶于1mL二甲基甲酰胺(dimethylformamide)。避光保存，常用保存在-20℃，長期保存在-80NBT和BCIP亦有最終濃度的成品溶液出售(Promega公司)。(12)其他溶液0.5MEDTA，PH8.0；1M檸檬酸；50mg/mL肝素；50mg/mL核糖體RNA；均DEPC配置，用于配置HYB。5MNaCl；1MMgCl2；1MTris-HCl，pH9.5；1M左旋咪唑；用于配置檢測緩沖液。0.1M或1MTris-HCl，pH8.2，用于配置FastRed染色液。0.1M甘氨酸-鹽酸(glycine-HCl)，pH2.2，用于終止FastRed顯色。附：探針合成1帶有目的插入片段的質(zhì)粒線性化。選擇處于插入片段正義鏈5′端酶切位點的酶(合成反義RNA探針)或3′端酶切位點的酶(合成正義RNA對照)。電泳檢驗。一般取不多于10uL酶，使用100uL或200uL體系，線性化產(chǎn)物電泳檢驗需要用原質(zhì)粒稀釋液比照。注意酶切位點和RNA聚合酶的選擇：從一端切開，選用另一端的啟動序列開始轉(zhuǎn)錄。以下使用酚、氯仿的步驟在通風櫥中操作。2線性化產(chǎn)物純化。純化前稀釋到200-500uL，以減少操作中的損失。2.1加入等體積Tris飽和酚，震蕩混勻，放置10分鐘，4℃，12000rcf取上清操作最好不使用1000uL移液器，以免動作過大。切勿弄混界面。下同。吸出水相時不可帶入有機相，界面處的蛋白也不能吸上來。2.2加入等體積的氯仿:異戊醇=24:1的混合液，震蕩混勻，放置10分鐘，4℃，12000rcf不可帶入有機相。以上兩步有機溶劑體積可略少，過多可能溶解部分質(zhì)粒DNA。2.3加入1/10體積的3M乙酸鈉，2倍體積的乙醇，震蕩混勻，-20℃沉淀時間從半小時到過夜不等。2.44℃2.5加入300-500uL預冷的70%乙醇洗滌，4℃，12000rcf離心2分鐘，棄去上清，并用真空泵吸干液體，37此步謹防真空泵吸走質(zhì)粒。溫箱中放置時間不宜太長，否則質(zhì)粒難以溶解。2.6加入約30uLddH2O，震蕩溶解質(zhì)粒DNA。0.5uL左右電泳檢驗。此步電泳檢驗可以不用原質(zhì)粒稀釋液對照。3合成RNA探針。3.120uL反應體系中含：5*轉(zhuǎn)錄Buffer4uL；100mMDTT(二硫蘇糖醇，維持還原性體系保護酶中巰基)2uL；DNA模版1-10uL(盡量達到1ug)；用于補齊20uL體系的適量DEPC水；40U/uLRnasin(Promega公司的RNA酶抑制劑)0.5uL；10*NTP標記混合物(Roche公司產(chǎn)品)2uL；17U/uLRNA聚合酶(polymerase)1.5uL。37℃至少溫育2小時，視情況可適當延長1