小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)課件

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)11目的通過本次實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓多染紅細(xì)胞（PCE）微核測定方法。2原理微核是在細(xì)胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時(shí)，仍然留在細(xì)胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無著絲粒斷片或環(huán)。它在末期以后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成，由于比核小得多故稱微核。1目的通過本次實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓多染紅細(xì)胞（PCE2微核成因化學(xué)致突變物染色體作用于紡錘絲無著絲點(diǎn),片或環(huán)整條染色體帶著絲粒的環(huán)和斷片于細(xì)胞分裂末期細(xì)胞質(zhì)中形成微核微核成因化學(xué)致突變物染色體作用于紡錘絲無著絲點(diǎn),片或環(huán)整條染3小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的形成小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的形成4因此，微核試驗(yàn)用于檢測斷裂劑和部分非整倍體致突變劑。

微核可出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞中較難與正常核的分支相區(qū)別，由于紅細(xì)胞在成熟前最后一次分離后數(shù)小時(shí)可將主核排出，而仍保留微核于PCE細(xì)胞中，因此，通常計(jì)數(shù)PCE細(xì)胞中的微核數(shù)。因此，微核試驗(yàn)用于檢測斷裂劑和部分非整倍體致突變劑。53器材與試劑3.1器材解剖器械，生物顯微鏡，載玻片等。3.2試劑甲醇（分析純）、甘油（分析純）、小牛血清、生理鹽水、Giemsa儲備液、pH6.8磷酸鹽緩沖液3.3陽性對照物環(huán)磷酰胺3器材與試劑3.1器材解剖器械，生物顯微鏡，載玻64操作步驟4.1試驗(yàn)動物及處理動物選擇小鼠是微核試驗(yàn)的常規(guī)動物，通常用7～12周齡，體重18～20g的小鼠。每組10只，雌雄各半。4操作步驟4.1試驗(yàn)動物及處理7劑量及分組受試物應(yīng)至少設(shè)三個(gè)劑量組，最高劑量組原則上為不產(chǎn)生動物死亡的最大毒作用劑量。一般取受試樣品1/5、1/10、1/20LD50劑量。另設(shè)溶劑對照組和陽性對照組。陽性對照組可用環(huán)磷酰胺腹腔注射1次。陰性對照組使用等體積的溶劑。劑量及分組8染毒途徑腹腔注射染毒次數(shù)及取樣時(shí)間一般采用兩次或多次染毒。兩次染毒：第一次染毒后24小時(shí)進(jìn)行第二次染毒，6小時(shí)后取樣；多次染毒：每天染毒1次，連續(xù)5天，末次染毒后24小時(shí)取樣。染毒途徑腹腔注射94.2骨髓液的制備和涂片試驗(yàn)動物一次染毒后，按確定的時(shí)間用頸椎脫臼或麻醉法將其處死，取胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型止血鉗將骨髓擠于有一小滴小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片。也可在股骨取骨髓。陽性及陰性對照組處理方法同上。4.2骨髓液的制備和涂片104.3固定將推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇溶液固定15分鐘，取出，晾干。不能及時(shí)染色的涂片也應(yīng)固定好保存。4.4染色將固定晾干后的涂片，用新鮮配制的Giemsa(Giemsa儲備液1份+pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份)染色10~15分鐘，沖洗，晾干。4.3固定114.5觀察計(jì)數(shù)低倍鏡下觀察，選擇細(xì)胞完整、分散均勻，著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)。多染紅細(xì)胞（PCE）呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞（NCE）呈橘黃色。典型的微核多為單個(gè)、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE中含微核的PCE數(shù)，并且計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中PCE與NCE的比值。4.5觀察計(jì)數(shù)低倍鏡下觀察，選擇細(xì)胞完整、分散均勻，著色適125結(jié)果分析與評價(jià)本試驗(yàn)中只計(jì)數(shù)PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE/NCE為評價(jià)細(xì)胞毒性的指標(biāo)，受試組PCE/NCE值與陰性對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義表示受試化學(xué)毒物的劑量過大，試驗(yàn)結(jié)果不可靠。陰性對照和陽性對照組的微核發(fā)生率，應(yīng)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道或研究歷史數(shù)據(jù)相一致。5結(jié)果分析與評價(jià)本試驗(yàn)中只計(jì)數(shù)PCE中微核，微核率以千分率13MNNCEMNNCE14

紅細(xì)胞電鏡

15單個(gè)微核多個(gè)微核單個(gè)微核多個(gè)微核16小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)課件17小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)181目的通過本次實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓多染紅細(xì)胞（PCE）微核測定方法。2原理微核是在細(xì)胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時(shí)，仍然留在細(xì)胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無著絲粒斷片或環(huán)。它在末期以后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成，由于比核小得多故稱微核。1目的通過本次實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓多染紅細(xì)胞（PCE19微核成因化學(xué)致突變物染色體作用于紡錘絲無著絲點(diǎn),片或環(huán)整條染色體帶著絲粒的環(huán)和斷片于細(xì)胞分裂末期細(xì)胞質(zhì)中形成微核微核成因化學(xué)致突變物染色體作用于紡錘絲無著絲點(diǎn),片或環(huán)整條染20小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的形成小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的形成21因此，微核試驗(yàn)用于檢測斷裂劑和部分非整倍體致突變劑。

微核可出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞中較難與正常核的分支相區(qū)別，由于紅細(xì)胞在成熟前最后一次分離后數(shù)小時(shí)可將主核排出，而仍保留微核于PCE細(xì)胞中，因此，通常計(jì)數(shù)PCE細(xì)胞中的微核數(shù)。因此，微核試驗(yàn)用于檢測斷裂劑和部分非整倍體致突變劑。223器材與試劑3.1器材解剖器械，生物顯微鏡，載玻片等。3.2試劑甲醇（分析純）、甘油（分析純）、小牛血清、生理鹽水、Giemsa儲備液、pH6.8磷酸鹽緩沖液3.3陽性對照物環(huán)磷酰胺3器材與試劑3.1器材解剖器械，生物顯微鏡，載玻234操作步驟4.1試驗(yàn)動物及處理動物選擇小鼠是微核試驗(yàn)的常規(guī)動物，通常用7～12周齡，體重18～20g的小鼠。每組10只，雌雄各半。4操作步驟4.1試驗(yàn)動物及處理24劑量及分組受試物應(yīng)至少設(shè)三個(gè)劑量組，最高劑量組原則上為不產(chǎn)生動物死亡的最大毒作用劑量。一般取受試樣品1/5、1/10、1/20LD50劑量。另設(shè)溶劑對照組和陽性對照組。陽性對照組可用環(huán)磷酰胺腹腔注射1次。陰性對照組使用等體積的溶劑。劑量及分組25染毒途徑腹腔注射染毒次數(shù)及取樣時(shí)間一般采用兩次或多次染毒。兩次染毒：第一次染毒后24小時(shí)進(jìn)行第二次染毒，6小時(shí)后取樣；多次染毒：每天染毒1次，連續(xù)5天，末次染毒后24小時(shí)取樣。染毒途徑腹腔注射264.2骨髓液的制備和涂片試驗(yàn)動物一次染毒后，按確定的時(shí)間用頸椎脫臼或麻醉法將其處死，取胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型止血鉗將骨髓擠于有一小滴小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片。也可在股骨取骨髓。陽性及陰性對照組處理方法同上。4.2骨髓液的制備和涂片274.3固定將推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇溶液固定15分鐘，取出，晾干。不能及時(shí)染色的涂片也應(yīng)固定好保存。4.4染色將固定晾干后的涂片，用新鮮配制的Giemsa(Giemsa儲備液1份+pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份)染色10~15分鐘，沖洗，晾干。4.3固定284.5觀察計(jì)數(shù)低倍鏡下觀察，選擇細(xì)胞完整、分散均勻，著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)。多染紅細(xì)胞（PCE）呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞（NCE）呈橘黃色。典型的微核多為單個(gè)、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE中含微核的PCE數(shù)，并且計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中PCE與NCE的比值。4.5觀察計(jì)數(shù)低倍鏡下觀察，選擇細(xì)胞完整、分散均勻，著色適295結(jié)果分析與評價(jià)本試驗(yàn)中只計(jì)數(shù)PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE/NCE為評價(jià)細(xì)胞毒性的指標(biāo)，受試組PCE/NCE值與陰性對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義表示受試化學(xué)毒物的劑量過大，試驗(yàn)結(jié)果不可靠。陰性對照和陽性對照組的微核發(fā)生率，應(yīng)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道或研究歷史數(shù)據(jù)相一致。5結(jié)果分析與評價(jià)本試驗(yàn)中只計(jì)數(shù)PCE中微核，微核率以千分率30MNNCEM